Informacja

Myszy wsobne nie mają poważnych skutków fenotypowych?

Myszy wsobne nie mają poważnych skutków fenotypowych?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dlaczego dwudzieste pokolenie myszy wsobnej nie ma szczególnych dziwnych fenotypów, a wręcz przeciwnie, gdy celowo zinbredowane psy lub tygrysy dla określonego fenotypu powodują poważną deformację struktury kości lub struktury czaszki?


Kilka informacji na temat szczepów wsobnych myszy laboratoryjnych:

https://en.wikipedia.org/wiki/Inbred_strain

http://what-when-how.com/molecular-biology/pure-line-molecular-biology/

Adekwatny cytat o konsekwencjach chowu wsobnego:

Chów wsobny w organizmach alogamicznych doprowadza szkodliwe allele recesywne do homozygotyczności; bezpośrednią konsekwencją jest wzrost częstości występowania wadliwego potomstwa, czyli innymi słowy wzrost obciążenia genetycznego populacji. Zjawisko to nazywane jest depresją wsobną lub zwyrodnieniem wsobnym. W miarę postępu chowu wsobnego, szkodliwe allele są selekcjonowane i ostatecznie znikają. Oryginalne populacje heterozygotyczne są często bardziej dopasowane niż powstałe czyste linie, ponieważ czerpią korzyści z heterozy i zrównoważonych polimorfizmów; główną zaletą czystych linii jest szybka produkcja wielu osobników o tym samym dobrze przystosowanym genotypie, podczas gdy alogamia stale generuje nowe genotypy.

Innymi słowy, chów wsobny jest szkodliwy, ponieważ zwiększa prawdopodobieństwo, że potomstwo będzie miało dwie kopie złych alleli recesywnych, co oznacza, że ​​allele te ulegają ekspresji, co oznacza, że ​​organizm otrzymuje złe konsekwencje, które nie ujawniłyby się, gdyby miało tylko jedną kopię. Tak dzieje się jednak w ciągu jednego pokolenia; przez wiele pokoleń złe allele są wybierane przeciwko, właśnie dlatego, że są szkodliwe dla organizmu, więc mniej się rozmnaża, a po wystarczającej liczbie pokoleń krzyżowania wsobnego dochodzisz do punktu, w którym wszystkie osobniki są genetycznie identyczne i mają wszystkie „dobre” allele (jeśli są mieli szczęście, w przeciwnym razie wymierają lub zostają z niektórymi złymi, ale nie-śmiertelnymi allelami). Nadal mogą być w gorszej sytuacji niż ich bardziej zróżnicowani przodkowie, ale nie są całkowicie zawiedzeni jak ich nieszczęsne ciotki i wujkowie, którym też się nie udało.

Duża różnica między myszami wsobnymi a psami lub tygrysami polega na aspekcie „dla konkretnego fenotypu”. Organizmy laboratoryjne są chowane wsobnie, dzięki czemu otrzymujesz dużą pulę osobników identycznych genetycznie, co oznacza, że ​​znacznie łatwiej jest na nich eksperymentować. Celem jest sam chów wsobny, a nie konkretny fenotyp. Na przykład, jeśli spojrzysz na stronę z najpopularniejszym szczepem myszy laboratoryjnych, C57BL/6, zobaczysz, że ma on wiele różnych właściwości i jest używany do wielu różnych rzeczy.

Z drugiej strony psy nie są chowane w celu chowu wsobnego lub bycia genetycznie identycznym; celem jest uzyskanie pożądanych fenotypów, a chów wsobny jest tylko skutecznym sposobem osiągnięcia tego celu. Nie jest również oczywiste, że wiele problemów, jakie mają psy rasowe, to chów wsobny (tj. brak różnorodności genetycznej, wysoki poziom homozygozji) per se, ale fakt, że hodowane cechy są po prostu niezdrowe dla psa lub częściowo krzywej dzwonowej, która zawiera złe wyniki na krawędziach. Na przykład jamistość rdzenia u Cavalier King Charles Spaniel:

Niektórzy badacze szacują, że aż 95% CKCS może mieć malformację podobną do Chiari (CM lub CLM), malformację kości czaszki uważaną za część przyczyny jamistości rdzenia, oraz że ponad 50% kawalerów może mieć SM. * Ma zasięg ogólnoświatowy i nie ogranicza się do żadnego kraju, linii hodowlanej lub hodowli, a eksperci twierdzą, że uważa się, że jest dziedziczony po cavalier king charles spaniel. CM jest tak rozpowszechniony w cavalierach, że może być nieodłączną częścią standardu rasy CKCS.

(podkreślenie moje)

To samo dotyczy tej deformacji kręgosłupa, która jest związana z wyborem ogonów korkociągów. Geny, które sprawiają, że korkociąg ogonowy, również mieszają się z kręgosłupem.

Innymi słowy, problemem nie jest chów wsobny czy nie, ale to, czy same geny są szkodliwe. Kiedy organizmy zostaną wyselekcjonowane pod kątem cech, które są bezpośrednio szkodliwe w ich skrajności lub są powiązane ze szkodliwymi genami, które akurat znajdują się obok tych wybranych w chromosomie, wtedy szkodliwe konsekwencje rozprzestrzenią się na populację. Chów wsobny jest problemem tylko o tyle, że pozwala na szybszy proces (więcej potomstwa na pokolenie ma pożądaną cechę). Z drugiej strony, gdy po prostu dokonujesz chowu wsobnego bez szczególnego skupienia się na fenotypie, lub nie na fenotypach, które wiążą się z oczywistymi szkodami (tj. żadne laboratorium nie wybrałoby frywolnej cechy, która również powoduje szkodę. Albo wybierają szkodliwą cechę na lub wybierają przeciwko temu, ponieważ będą chcieli zwierząt, które są jak najzdrowsze, z wyjątkiem jednej zmiennej, którą są zainteresowani), wtedy uzyskasz populacje, które są całkiem normalne, z wyjątkiem niektórych bezpośrednie konsekwencje jednorodności genetycznej.

Należy zauważyć, że większość rasowych psów prawdopodobnie nie jest szczepami wsobnymi w taki sam sposób, jak wiele zwierząt laboratoryjnych; są genetycznie identyczne, więc chodzi o to, że ich potomstwo będzie takie jak one. Tak więc, chociaż mogą być mniej sprawne niż ich nie-wsobna wersja, ich potomstwo nie będzie mniej sprawne niż oni. I to nie jest to, co obserwuje się u zwierząt rasowych, takich jak psy i konie; osoby nie są identyczne, a patrząc na stronę o jamistości rdzenia wydaje się, że problemy się pogarszają.


Ponieważ wybraliśmy konkretne szczepy wsobne, które wydawały się „normalne”, przynajmniej powierzchownie, a przede wszystkim takie, które dawały dobre mioty i nie gryzą często badaczy. Jednak szczepy wsobne myszy i szczurów mają wiele szkodliwych mutacji. W niektórych przypadkach prawdopodobnie przeżyją tylko dlatego, że są trzymane w klatkach z dużą ilością pożywienia i wody, więc nie podlegają takiej samej presji selekcyjnej jak dzikie myszy.

Na przykład wiele popularnych szczepów myszy ma rd1 mutacja (patrz: laboratoria Jacksona). Mutacja ta prowadzi do całkowitej degeneracji fotoreceptorów do około 1 miesiąca życia. Zauważ, że są to nie zazwyczaj myszy albinosów, więc różni się to od deficytów wzroku albinosów. Są to myszy, które wydają się w większości normalne, ale są całkowicie ślepy.

Najpopularniejszym szczepem myszy używanym w badaniach jest mysz C57BL/6, czasami nazywana „czarną 6”. Ponownie zobacz Jackson Labs, aby zapoznać się z niektórymi fenotypami obserwowanymi w tym szczepie. Wymienię tutaj tylko kilka: utrata słuchu, wysokie preferencje dla alkoholu, zapalenie skóry na tyle poważne, że czasami prowadzi do samookaleczenia i śmierci, podatność na otyłość, wrażliwość na miażdżycę, małe nerki, podatność na kilka typów nowotworów, wysoki wskaźnik problemy rozwojowe z soczewką oka i tak dalej.

Biorąc pod uwagę, że jest to szczep często uważany za „najbardziej normalny”, myślę, że można zauważyć, że myślenie o myszach wsobnych jako nieposiadających żadnych poważnych fenotypów wcale nie jest poprawne.


Wpływ tła genetycznego na czynność serca ex vivo i in vivo u kilku powszechnie stosowanych wsobnych szczepów myszy

Wsobne szczepy myszy odgrywają kluczową rolę w badaniach biomedycznych. Jednorodność genetyczna w obrębie szczepów wsobnych i ich ogólna podatność na manipulacje genetyczne sprawiły, że są one idealnym źródłem do analizy funkcji fizjologicznych poszczególnych genów. Jednak chów wsobny, który sprawia, że ​​myszy wsobne są tak użyteczne, powoduje również rozbieżność genetyczną między nimi. Ta rozbieżność genetyczna jest często niewyjaśniona, ale może być czynnikiem mylącym przy porównywaniu badań, które wykorzystywały różne szczepy wsobne. Tutaj porównaliśmy funkcję serca myszy C57BL/6J z siedmioma innymi powszechnie stosowanymi wsobnymi szczepami myszy: FVB/NJ, DBA/2J, C3H/HeJ, BALB/cJ, 129X1/SvJ, C57BL/10SnJ i 129S1/SvImJ. Testami stosowanymi do porównania czynności serca był wyizolowany ex vivo preparat serca Langendorffa i analiza hemodynamiczna in vivo w czasie rzeczywistym przy użyciu mikromanometrii konduktancyjnej. Zgłaszamy istotne, zależne od szczepu różnice w czynności serca między C57BL/6J a innymi powszechnie stosowanymi szczepami wsobnymi. C57BL/6J utrzymywał lepszą czynność serca niż większość szczepów wsobnych po niedokrwieniu ex vivo, szczególnie w porównaniu ze szczepami 129S1/SvImJ, 129X1/SvJ i C57BL/10SnJ. Jednak podczas ostrej hipoksji in vivo 129X1/SvJ i 129S1/SvImJ utrzymywały względnie normalną czynność serca, podczas gdy zwierzęta C57BL/6J wykazywały dramatyczną dekompensację serca. Dodatkowo, C3H/HeJ wykazywał szybką i wyraźną dekompensację serca w odpowiedzi na wlew esmololu w porównaniu z efektami innych szczepów. Odkrycia te pokazują złożony wpływ rozbieżności genetycznej między szczepami wsobnymi na czynność serca. Wyniki te mogą pomóc w analizie ablacji genów lub badaniach transgenicznych i dodatkowo wykazać określone cechy ilościowe, które mogą być przydatne w odkrywaniu modyfikatorów genetycznych istotnych dla zdrowia i chorób serca.

przez dziesięciolecia badania biomedyczne w dużej mierze opierały się na wykorzystaniu wsobnych szczepów myszy. Jednorodność genetyczna w obrębie tych szczepów pozwala na dobrze kontrolowane i wysoce powtarzalne badania. W literaturze opisano ponad 450 różnych szczepów wsobnych (3), a samo Jackson Laboratory utrzymuje ponad 180 szczepów wsobnych myszy (http://jaxmice.jax.org/list/cat481365.html). Najpopularniejszym szczepem myszy wsobnych używanym w badaniach jest mysz C57BL/6. Szczep ten jest najczęściej używanym tłem genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy utrzymywanych przez Jackson Laboratory (http://jaxmice.jax.org/literature/catalog/JAX_Mice_Catalog.pdf) i jest obecnie jedynym szczepem wsobnym, którego genom został w pełni zsekwencjonowany (57).

Chociaż nie tak szeroko stosowane, inne szczepy wsobne znalazły nisze w badaniach biomedycznych ze względu na łatwość manipulacji genetycznych lub różne skłonności do rozwoju określonych patologii. Na przykład myszy FVB/N są powszechnie stosowane w konwencjonalnej transgenezie (51), a 129 podszczepów zostało wykorzystanych prawie wyłącznie do izolacji embrionalnych komórek macierzystych (ES) stosowanych do kierowania genów (41, 56). Alternatywnie, inne szczepy wsobne znalazły zastosowanie jako modele choroby z powodu naturalnie występujących mutacji w genach związanych z chorobą człowieka (5, 22, 38, 43). Nawet przy braku zmodyfikowanych lub znanych naturalnie występujących mutacji, różne wsobne szczepy myszy mogą drastycznie różnić się pod względem podatności na choroby istotne klinicznie. W poprzednich doniesieniach wykorzystano tę naturalnie występującą zmienność podatności na daną chorobę do identyfikacji loci cech ilościowych (QTL), które modyfikują patogenezę choroby (2, 6, 13, 48, 49).

Choroba sercowo-naczyniowa jest główną przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych, dotykając 3 Amerykanów i powodując 800 000 zgonów w 2006 r. (27). Aby skutecznie zbadać procesy patologiczne związane z chorobami sercowo-naczyniowymi i opracować nowe strategie terapeutyczne, dziedzina sercowo-naczyniowa objęła genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy wsobnej jako narzędzia pomagające zrozumieć fundamentalne procesy fizjologiczne rządzące funkcjami w zdrowym i chorym sercu. Ankieta na stronie Jackson Labs pokazuje, że utrzymują one genetycznie zmodyfikowane linie myszy wykorzystywane do badań sercowo-naczyniowych, pochodzące od wsobnych szczepów myszy. C57BL/6 jest najczęstszym podłożem genetycznym (ryc. 1A ). Jednak mutacje są również utrzymywane na innych wspólnych podłożach wsobnych. Większość tych myszy została utworzona przy użyciu komórek ES pochodzących z podszczepu szczepu wsobnego 129, a następnie często krzyżowanych wstecznie i utrzymywanych na tle C57BL/6 lub mieszanym C57BL/6 × 129 (Fig. 1b ).

Podsumowanie szczepów genetycznie zmodyfikowanych myszy i embrionalnych komórek macierzystych (ES). A: tło genetyczne genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy zaprojektowanych do badań sercowo-naczyniowych prowadzonych w Jackson Labs. b: tło genetyczne komórek ES użytych do stworzenia genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy utrzymywanych w Jackson Labs.

Kilka badań wykazało zależne od szczepu różnice w funkcjonowaniu układu sercowo-naczyniowego między wsobnymi szczepami myszy różnymi metodami in vitro i in vivo (4, 7, 23, 37, 40, 47). Większość tych różnic w fizjologii serca, zależnych od szczepu, została przeprowadzona na niewielkiej podgrupie szczepów wsobnych przy braku urazu/stresu związanego z chorobą. Wcześniejsze doniesienia wykazały również silny wpływ podłoża genetycznego na modyfikację fenotypu sercowego genetycznie zmodyfikowanych myszy (20, 21, 50). Na przykład, dwie odrębne linie transgeniczne wyrażające zmutowaną tropomiozynę E180G związaną z kardiomiopatią przerostową wykazały drastycznie różne fenotypy, z których jedna wykazywała stosunkowo łagodną dysfunkcję rozkurczową (29) a druga rozwijała jawną kardiomiopatię przerostową i niewydolność serca (36). Wyłączając możliwe różnice w opiece nad zwierzętami i trzymaniu zwierząt, główną różnicą między tymi transgenicznymi myszami jest ich tło genetyczne, jedna mysz została stworzona na tle FVB/N, druga na tle C57BL/6. Chociaż dokładny mechanizm leżący u podstaw tego efektu nie jest zrozumiały, zmienność fenotypowa między tymi dwiema liniami transgenicznymi przyczynia się do rozmachu tego badania.

Celem tego badania było porównanie funkcji serca ośmiu powszechnie stosowanych wsobnych szczepów myszy w spoczynku i po fizjologicznie istotnym stresie/uszkodzeniu. Uzasadnienie przeprowadzenia tych badań jest dwojakie. Po pierwsze, duża liczba szczepów wsobnych wykorzystywanych w badaniach medycznych wymaga rozważenia różnic fizjologicznych, które wynikają z rozbieżności genetycznej między szczepami. Po drugie, ustalona rozbieżność genetyczna między wsobnymi szczepami myszy służy jako potencjalny substrat do identyfikacji powtarzalnych cech ilościowych, które różnią się między wsobnymi szczepami. Wykorzystano osiem powszechnych szczepów wsobnych, z których sześć znajduje się na liście najpopularniejszych szczepów wsobnych Jackson Laboratory (http://jaxmice.jax.org/findmice/popular.html). Techniki zastosowane do pomiaru czynności serca w tym badaniu to perfundowany preparat izolowanego serca Langendorffa oraz funkcja hemodynamiczna serca in vivo mierzona za pomocą mikromanometrii przewodnictwa opartej na cewniku. Preparat Langendorffa jest sprawdzoną techniką oceny funkcji serca wykonującego skurcze izowolumiczne przy kontrolowanym ciśnieniu końcoworozkurczowym (26, 45). Analiza hemodynamiczna in vivo zapewnia pomiary ciśnienia i objętości serca u nienaruszonego zwierzęcia, przy czym obciążenie fizjologiczne i unerwienie autonomiczne pozostają nienaruszone (33). Dodatkowo zbadaliśmy zależne od napięcia różnice w czynności serca po fizjologicznie istotnych stresach. W szczególności wyizolowane serca poddano globalnemu niedokrwieniu i reperfuzji. Myszy wyposażone w przyrządy do pomiarów hemodynamicznych in vivo poddano blokadzie adrenergicznej i ostrej prowokacji niedotlenieniem. Zależne od obciążenia różnice w czynności serca stwierdzono zarówno na początku badania, jak i po fizjologicznie istotnym stresie. Podsumowując, badanie to podkreśla zależne od szczepu różnice między myszami wsobnymi, które zapewniają wgląd w wyraźną fizjologiczną rozbieżność zgłaszaną dla transgenicznych myszy sercowych pochodzących z różnych środowisk. Identyfikacja ilościowych cech hemodynamicznych zależnych od szczepu może stanowić podstawę przyszłych badań mających na celu identyfikację QTL, które modyfikują czynność serca.


Wstęp

Ze względu na swoje zdolności metaboliczne i biotransformacyjne, mikrobiota jelitowa ssaków (GM) jest obecnie często uważana za quasi-narząd (Clarke i wsp. 2014 O'Hara i Shanahan 2006), ze zbiorowym metagenomem przyćmiewającym genom gospodarza pod względem złożoności i różnorodność. Oprócz głębokiego wpływu na procesy rozwojowe oraz trawienie i przyswajanie składników odżywczych, GM pozyskuje również węgiel ze związków ksenobiotycznych w świetle jelita, często zmieniając okres półtrwania i aktywność związków macierzystych (Koppel i wsp. 2017) i jest podobnie odpowiedzialny za inne procesy kataboliczne w świetle jelita. Wynika z tego, że różnice między osobnikami w składzie ich GM mogą przynajmniej częściowo wyjaśniać różnice w podatności na chorobę lub odpowiedzi na leczenie (Gopalakrishnan i wsp. 2018 Routy i wsp. 2018 Matson i wsp. 2018). W związku z tym społeczność badaczy biomedycznych zainwestowała ogromną ilość czasu i zasobów w przedsięwzięcia takie jak Human Microbiome Project, którego celem jest scharakteryzowanie zdrowej ludzkiej mikrobioty w różnych miejscach anatomicznych oraz setki innych powiązanych badań badających odchylenia od normy w różnych chorobach ustawienia. Badania porównawcze z wykorzystaniem modeli zwierzęcych miały kluczowe znaczenie dla zbadania przyczynowości powiązań występujących u pacjentów ludzkich oraz do zdefiniowania mechanizmów leżących u podstaw tych powiązań.

W związku z tym rośnie świadomość, że GM laboratoryjnych modeli myszy należy rozpatrywać w kontekście badań biomedycznych jako całości. Nieznajomość przez badacza konkretnego szczepu myszy użytego w jego eksperymentach byłaby śmieszna, jednak wielu badaczy ma niewiele informacji na temat genetyki genetycznej myszy w ich koloniach badawczych i tego, jak może wpływać na fenotyp ich modelu. Rzeczywiście, wiele badań z wykorzystaniem modeli mysich podsumowało lub przewidziało związki między genetycznie modyfikowaną postacią a zdrowiem gospodarza u ludzi (Ivanov i wsp. 2009 Chen i wsp. 2018 Rosshart i wsp. 2019 Shin i wsp. 2014 Cuesta-Zuluaga i wsp. 2017), odzwierciedlające użyteczność badań translacyjnych w tej dziedzinie. Mając to na uwadze, wpływy GM są powiązane z trzema głównymi aspektami badań biomedycznych i translacyjnych — odtwarzalnością, przekładalnością i odkryciami. Tutaj przedstawiamy szeroki przegląd tych rozważań, w tym aktualną wiedzę i najlepsze praktyki, w celu ulepszenia wszystkich trzech komponentów.


„Łuszczyca autozapalna” – genetyka i biologia łuszczycy krostkowej

Łuszczyca jest przewlekłą, zapalną chorobą skóry, która ma dość szeroki zakres objawów klinicznych. Łuszczyca plackowata, która jest najczęstszym objawem łuszczycy, znajduje się na jednym końcu spektrum, zdominowanym przez adaptacyjną odpowiedź immunologiczną, podczas gdy rzadsza łuszczyca krostkowa znajduje się na drugim końcu, zdominowana przez wrodzoną i autozapalną odpowiedź immunologiczną. W ostatnich latach badania genetyczne zidentyfikowały sześć wariantów genetycznych predysponujących do łuszczycy krostkowej, które podkreśliły rolę cytokin IL-36 jako kluczowej dla patogenezy łuszczycy krostkowej. W niniejszym przeglądzie omówiono obraz i kliniczne podtypy łuszczycy krostkowej, udział wariantów predysponujących genetycznie, krytyczną rolę rodziny cytokin IL-36 w patofizjologii choroby oraz perspektywy leczenia łuszczycy krostkowej.Dalej przedstawiamy zastosowanie odpowiednich modeli mysich do badania łuszczycy krostkowej i zajmujemy się nierozstrzygniętymi pytaniami i problemami związanymi z naszym zrozumieniem mechanizmów związanych z łuszczycą krostkową.


Wyniki

Charakterystyka P. berghei Zakażenie ANKA u 32 różnych szczepów myszy

Aby zidentyfikować geny zaangażowane w odporność lub podatność na P. berghei Infekcje przeanalizowaliśmy temperaturę ciała, obciążenie schizontami w narządach i przeżycie u ośmiu myszy (czterech samic i czterech samców) z każdego z 32 wsobnych szczepów myszy. Listę szczepów myszy z ich powiązaniem z grupami i analizy statystyczne dla wszystkich skwantyfikowanych fenotypów podsumowano w Tabeli S1.

Przetrwanie.

W naszej konfiguracji średnia przeżywalność wszystkich myszy wynosiła 9 (SD 3.1), jednak 46% wszystkich myszy zmarło przed siódmym dniem. Myszy, które żyły dłużej niż siedem dni, wykazywały rozkład normalny z medianą 11 dni. Różnice w przeżywalności między 32 szczepami znacznie się różniły. W celu uproszczenia analizy pogrupowaliśmy różne szczepy w trzy klastry, stosując jednoczynnikową analizę ANOVA, a następnie posttest Tukeya-Kramera z alfa = 0,05. Dwa z nich (podatne i oporne) wykazały statystycznie istotne różnice (ryc. 1A), a pozostałe szczepy umieszczono w grupie pośredniej. Podatny klaster (średnie przeżycie w klastrze 6.7) obejmował I/LnJ, RIIIS/J, CZECHII/EiJ, C3H/HeJ, BUB/BnJ, FVB/NJ, LG/J, MA/MyJ, SJL/J, SM/ J, C57BL/6J, CE/J, PL/J, A/J, NZW/LacJ i CBA/J. Klaster odporny (średnia przeżywalność klastra 13.0) obejmował 129S1/1vlmJ, AKR/J, SWR/J, BTBR_T+_tf/J, DBA/2J, C58/J, NZO/HILtJ i WSB/EiJ. Klaster pośredni (średnie przeżycie klastra 9.6) obejmowały P/J, BALB/cByJ, MRL/MPJ, KK/HIJ, NOD/LtJ, PERA/EiJ, NON/LtJ i C57BR/cdJ). Trzy szczepy wykazały statystyczne różnice między samcami i samicami z tego samego szczepu (Tabela S1).

Cztery samce i cztery samice z 32 różnych szczepów myszy zostały zakażone P. berghei oraz przeżycie (A), końcową temperaturę ciała (B) i całkowitą liczbę lucyferazy z wyciętych narządów (C). Fenotypy są przedstawiane jako wykresy pudełkowe i wąsy z wąsami pokazującymi min. do max. Nazwa szczepu jest podana na osi x, a szczepy są wymienione w celu zwiększenia średniego przeżycia. Liczbę myszy analizowanych dla każdego szczepu i zależność statystyczną między różnymi szczepami przedstawiono w Tabeli S1. Szczepy pogrupowano w trzy klastry zgodnie z ich fenotypem przeżycia: podatne (niebieskie), pośrednie (żółte) i odporne (czerwone).

Aby sprawdzić, czy przedstawiciele poszczególnych szczepów myszy pogrupowanych według pochodzenia, jak pokazano w Tabeli S1, znajdują się głównie w klastrze najbardziej podatnym, pośrednim lub najbardziej odpornym, obliczono hipergeometryczny rozkład prawdopodobieństwa dla każdej grupy i klastra. Myszy szwajcarskie i myszy Castle'a zostały znacząco wzbogacone w najbardziej podatny klaster (P = 1×10-5 i P = 3×10-5 , odpowiednio), podczas gdy istotnie wykluczone z najbardziej odpornego klastra (P = 0,002 i P = 0,004, odpowiednio). Szczepy japońskie i nowozelandzkie zostały znacząco wykluczone z klastra najbardziej podatnego i wzbogacone w klaster przeżywalności pośredniej (P = 0,0001 i P = 0,0006, odpowiednio). Myszy z pochodnymi Bagg albinos były wysoce istotnie wykluczone z najbardziej odpornego klastra (P = 7×10-7). Członkowie trzech pozostałych grup myszy nie wykazywali preferencji dla żadnego klastra.

Temperatura ciała.

W przeciwieństwie do ludzi, u których infekcja malarią charakteryzuje się wysoką gorączką, myszy wykazują spadek temperatury ciała (hipotermia) po zakażeniu pasożytami malarii. Temperatura ciała znacznie spadła w trakcie infekcji u wszystkich szczepów myszy (sparowany test t-studenta, P<0,04). Z kilkoma wyjątkami, różne szczepy myszy nie wykazywały znaczących różnic w końcowej temperaturze ciała (szczegóły patrz Rycina 1B i Tabela S1). W czterech szczepach samice myszy miały znacznie niższą końcową temperaturę ciała niż samce myszy z tego samego szczepu (test t dla niesparowanych P<0,03, szczegóły patrz Tabela S1). W przeciwieństwie do tego wystąpiły istotne różnice w przebiegu hipotermii między skupieniami podatnymi, pośrednimi i opornymi. Myszy z podatnego klastra miały znacznie niższą temperaturę ciała niż myszy z odpornego klastra od trzeciego dnia (Figura 2B, jednokierunkowa ANOVA, a następnie test końcowy Tukeya-Kramera z alfa = 0,05). W trakcie infekcji różnica stała się bardziej wyraźna i myszy ze wszystkich trzech klastrów wykazywały znacząco różne temperatury ciała w siódmym dniu. Temperatura końcowa ciała ośmiu szczepów myszy korelowała dobrze z przeżyciem (szczegóły patrz Tabela S1), ale nie było korelacji między temperaturą końcową a przeżywalnością dla wszystkich szczepów łącznie (R2 = 0,001).

Przeżywalność i temperaturę ciała rejestrowano dla myszy zakażonych P. berghei. Myszy podzielono na podatne (linia niebieska przerywana, zakażone N = 122, narządy z wycięciem N = 42), pośrednie (linia ciągła żółta, zakażone N = 64, zakażone N = 23) lub odporne (linia czerwona kropkowana, zakażone N = 64, wycięte N = 35) skupiska według ich fenotypu przeżycia. A) Krzywa przeżycia dla trzech skupień. Klastry różniły się znacząco w teście log rank (Mantel Cox) z p<0,0001. Średnia i STE dla temperatury ciała (B) w przebiegu infekcji z osią X wskazującą czas po infekcji. Różnice statystyczne za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu końcowego Tukeya między skupieniami: a: podatne kontra oporne, b: podatne kontra oporne i pośrednie, c: oporne kontra podatne i pośrednie oraz d: wszystkie trzy klastry różnią się. Ekspresję lucyferazy pasożytów w nieperfundowanych narządach zmierzono po wypreparowaniu narządów z konających myszy. Ekspresję lucyferazy na narząd wyrażono jako procent całkowitej ekspresji lucyferazy we wszystkich narządach. C) Wykres pudełkowy i wąsowy z włosami pokazującymi od minimalnej do maksymalnej względnej ekspresji lucyferazy dla każdego narządu. * oznacza istotność statystyczną P<0,05 w jednokierunkowej analizie ANOVA, a następnie w teście końcowym Tukeya, ** wskazuje P od 0,01 do 0,001, *** P≤0.001.

Rozkład Schizonta w narządach.

Sekwestracja zakażonych erytrocytów w mikrokrążeniu narządów wiąże się z patologią malarii u ludzi i myszy [26]. Aby przetestować różnice we wzorcach sekwestracji między różnymi szczepami myszy, transgeniczny P. berghei linia (pbGFP-LUCsch) zastosowano ekspresję białka fuzyjnego GFP-lucyferaza pod kontrolą promotora specyficznego dla schizontów z ama1 gen z P. berghei [27]. Ponieważ inwazyjny merozoit przenosi część fluorescencji do erytrocytów, młode pierścienie również wykazują pewną ekspresję lucyferazy. Obrazowanie fluorescencyjne całego ciała żywej myszy lub wypreparowanych narządów wykrywa zatem schizonty, formy pasożytów sekwestrujących, a także wczesne stadia pierścieniowe. W trakcie infekcji liczba lucyferazy w całym ciele u poszczególnych myszy wzrosła zgodnie z oczekiwaniami (Figura S1). Ekspresję lucyferazy w mózgu, płucach, śledzionie i wątrobie analizowano w nieperfundowanych, wyciętych narządach myszy, które były w stanie agonalnym. Tylko około 40% myszy zostało uśmierconych, a liczba analizowanych myszy różniła się dlatego dla każdego szczepu i nie analizowaliśmy różnic płci.

Sumy zliczeń lucyferazy wszystkich narządów z pojedynczych myszy uśredniono dla każdego szczepu i porównano między szczepami (Figura 1c). Jedynie C58/J i C57BR/cdJ miały znacząco wyższe całkowite zliczenia lucyferazy niż jakikolwiek inny szczep (Szczegóły patrz Tabela S2). Klaster oporny miał znacząco wyższe liczby lucyferazy niż klaster podatny (jednoczynnikowa ANOVA, a następnie test końcowy Tukeya-Kramera z alfa = 0,05). Całkowita liczba lucyferazy w narządach jest wskaźnikiem całkowitego obciążenia pasożytami żywiciela.

Zliczenia fotonów z nienaruszonych narządów również wyrażono jako procent całkowitej liczby fotonów we wszystkich narządach na mysz (względna luminescencja, Figura 2c). Wystąpiły statystycznie istotne różnice w ekspresji lucyferazy na narząd dla różnych klastrów przeżycia (Figura 2C), podczas gdy tylko kilka indywidualnych szczepów wykazało znaczące różnice w porównaniu z innymi szczepami (Tabela S2). Znacznie wyższe poziomy ekspresji lucyferazy w śledzionie były związane ze szczepami podatnymi, podczas gdy znacznie wyższa ekspresja w wątrobie była związana z opornością. Szczegółowe dane statystyczne poszczególnych szczepów znajdują się w tabeli S2. Ogólnie ekspresja lucyferazy była najniższa w mózgu, przy czym pośrednie myszy wykazywały wyższą ekspresję lucyferazy niż podatne myszy i najwyższa w płucach bez różnic statystycznych między skupieniami. Zgodnie z powyższymi ustaleniami, wystąpiła umiarkowana ujemna korelacja między przeżyciem a względną ekspresją lucyferazy w śledzionie oraz dodatnia korelacja między przeżyciem a względną ekspresją lucyferazy w wątrobie (odpowiednio R2 = 0,14 i R2 = 0,18). Korelacja dla względnej ekspresji lucyferazy w pozostałych narządach w porównaniu z przeżyciem i wszystkich narządów w porównaniu z końcową temperaturą ciała była niska (R2 > 0,06).

Porównując wyniki wszystkich różnych analiz fenotypowych, przeżycie wyraźnie wykazało najsilniejsze rozróżnienie między różnymi szczepami i grupami rodowodowymi (ryc. 1). W związku z tym przeżycie zostało użyte jako cecha w następujących analizach genotypu podstawowego.

Analizy całego genomu identyfikują locus powiązane z przeżyciem gospodarza na chromosomie 6

Aby powiązać fenotypy przeżycia różnych wsobnych szczepów myszy z ich genotypem, zastosowano dwie różne metody analizy całego genomu. Algorytm mapowania związanego z haplotypem (HAM) wykorzystuje ANOVA do obliczenia siły powiązań genetycznych między fenotypem wejściowym a strukturą haplotypu przodków (jak wywnioskowano przy użyciu lokalnego okna trzech sąsiednich polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) w całym genomie). Do wykrycia szczytów asocjacji uwarunkowanych strukturą populacji w panelu zróżnicowania myszy stosuje się metodę ważonego ładowania początkowego. W każdym locus genetycznym wynik asocjacji jest reprezentowany jako ujemna wartość P przekształcona w log10. Wynik –Log10P = 6 jest maksymalnym wynikiem wynikającym z 106 permutacji wykonanych w każdym locus. Analizę HAM przeprowadzono dla fenotypu przeżycia wśród 32 szczepów przy użyciu 297 674 informacyjnych SNP. Locus z –Log10Wynik P wynoszący 4,77 został zidentyfikowany na chromosomie 6 (115458884–115531474 pz, NCBI M36) (ryc. 3). Nawet jeśli to – Log10Wynik P jest bardzo dobry dla tego locus, nie osiąga on znaczenia dla całego genomu ze względu na zastosowany konserwatywny algorytm i dużą liczbę testowanych SNP. Locus ten zawierał nieulegający translacji region 3' (UTR) receptora γ aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (Ppar-γ, GeneID: 19016, MGI: 97747) i 5' UTR homologu endonukleazy 2 splicingu tRNA (S. cerevisiae) (Tsen2, GeneID: 381802, MGI: 2141599). W zgodzie z nomenklaturą wcześniej zidentyfikowanych QTL [17], [18], nazwaliśmy to nowo zidentyfikowane locus na chromosomie 6 berghei loci odporności 6 (berr6).

A) Skan całego genomu z algorytmem mapowania związanego z haplotypem (HAM) z wykorzystaniem przeżywalności jako cechy myszy z 32 różnych szczepów myszy zakażonych P. berghei zidentyfikował locus z -Log10Wynik P 4,77 na chromosomie 6 (strzałka). Liczby chromosomów są wskazane na osi x i -Log10Punkty P na osi y. B) Powiększenie locus na chromosomie 6 zidentyfikowane przez analizę HAM pokazuje –Log10Punktacja P (czerwona linia) oraz leżące u ich podstaw geny i ich pozycje na chromosomach. W locus wykryto trzy różne haplotypy składające się z kombinacji trzech SNP z maksymalnym –Log10Wartość P 4,77 (patrz również rysunek 4a). Średnie przeżycie każdego szczepu niosącego haplotyp 1, 2 lub 3 (odpowiednio żółty, niebieski i różowy) jest wskazane w C). Wydajna metoda mieszanego modelu asocjacji (EMMA) potwierdziła locus na chromosomie 6 zidentyfikowany za pomocą analizy HAM (D). –Log10Wynik P 9,87 z fałszywym wskaźnikiem odkrywania Q = 3,5×10-5 jest istotna dla całego genomu.

Locus zidentyfikowany za pomocą analizy HAM został potwierdzony za pomocą wydajnego mieszanego modelu mapowania asocjacyjnego (EMMA) [25]. Ta metoda modelowania wykorzystuje inny algorytm do powiązania fenotypu z genotypem i zasadniczo wykorzystuje pojedyncze powiązanie SNP, a nie wywnioskowaną strukturę haplotypu. Koryguje również mylące czynniki, takie jak pokrewieństwo genetyczne i struktury populacji, szacując pokrewieństwo parami między wszystkimi osobnikami i dopasowując je do wektora fenotypu, zmniejszając w ten sposób wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne. Locus zidentyfikowany przez EMMA w pozycji 115494951 (–log10P = 9,87), pokrywały się z locus zidentyfikowanym w analizie HAM. Ten P wartość wykazała znaczenie dla całego genomu z a Q wartość 3,5×10-5. Wartość q jest oszacowaniem współczynnika fałszywych odkryć i została obliczona zgodnie z wcześniejszym opisem [28]. Dla szczepów myszy użytych w naszym badaniu locus ten odpowiada za 53% wariancji przeżycia obserwowanej u samic i 62% u samców. Podczas gdy testowaliśmy również inne fenotypy, tylko temperatura ciała w dniu 5 samców myszy osiągnęła znaczenie całego genomu ze szczytem na chromosomie 4 (123836655 pz, -Log10P = 12,39).

Chociaż niewiele wiadomo na temat funkcji Tsen2, Ppar-γ tworzy heterodimer receptora jądrowego wraz z γ–retinowym receptorem X (przegląd w [29]). Reguluje transkrypcję szeregu genów biorących udział w różnicowaniu i metabolizmie tkanki tłuszczowej, wrażliwości na insulinę, regulacji masy ciała, miażdżycy i zapaleniu (omówienie w [30]). Ppar-γ został już powiązany z infekcją malarią. Agonista Ppar-γ zwiększył klirens iRBCs P. falciparum in vitro i poprawił wskaźnik przeżywalności myszy zakażonych P. berghei i zmniejszona parazytemia w P. chabaudi chabaudi model w sposób zależny od CD36 [31].

Porównaliśmy dostępne dane dotyczące ekspresji dla niezainfekowanych szczepów myszy z portalu BioGPS [32], [33] Tsen2 oraz Ppar-γ ze śledziony, wątroby, tkanki tłuszczowej i podwzgórza z haplotypami różnych szczepów myszy w locus berr6. Tsen2 był znacząco wyższy w tkance tłuszczowej i śledzionie szczepów myszy posiadających haplotyp trzy, podczas gdy haplotyp jeden wykazywał znacznie niższą ekspresję niż dwa w wątrobie. Ppar-γ wykazali tylko istotne różnice w ekspresji w wątrobie, gdzie haplotyp trzeci miał znacznie niższą ekspresję niż haplotyp drugi (Figura 4). Nie było różnic w poziomach ekspresji w podwzgórzu (dane nie pokazane).

Analiza HAM opiera się na tworzeniu haplotypów składających się z trzech kolejnych SNP. Kompozycje haplotypów w różnych pozycjach w locus berr6 są wskazane dla każdego szczepu myszy (A). Każdy haplotyp jest oznaczony numerem i oznaczony innym kolorem. Szczepy myszy wymieniono według ich przeżycia. -Dziennik10Wskazano wartości P dla każdej pozycji, a haplotypy z najwyższym wynikiem są obramowane. B) Wzorce ekspresji Tsen2 (górny panel) i Ppar-γ (panel dolny) z różnych szczepów myszy porównano w tkance tłuszczowej, śledzionie i wątrobie. Względne poziomy ekspresji (oś y) dla każdego szczepu myszy zostały pogrupowane i pokolorowane zgodnie z ich haplotypem w locus o najwyższym –Log10Wartość P (A). We wszystkich tkankach wykryto znacząco różne poziomy ekspresji dla Tsen2 ale tylko w wątrobie przez Ppar-γ. Wykresy punktowe ze średnią i błędem standardowym dla wyrażenia Tsen2 oraz Ppar-γ haplotypy. * oznacza istotność statystyczną P<0,05 w jednokierunkowej analizie ANOVA, a następnie w teście końcowym Tukeya, ** wskazuje P od 0,01 do 0,001, *** P≤0.001.


Podsumowanie i wnioski

Pomimo ich istotnego znaczenia klinicznego, objawy sercowe rzadko były przedmiotem badań eksperymentalnych nad chorobami autoimmunologicznymi. Dostępna literatura jest skąpa i często ogranicza się do pierwszego opisu i podstawowej charakterystyki fenotypowej odpowiedniego modelu myszy. Oznacza to, że w przypadku większości modeli, mimo że są one dobrze ugruntowane w badaniach immunologicznych, mechanizmy leżące u podstaw zajęcia serca nie są jeszcze poznane. Potrzebne są bardziej podstawowe badania, aby umożliwić bezpośrednie porównanie mechanizmów chorób serca u ludzi z odpowiednim modelem. Jednak ze względu na znaczny postęp w zrozumieniu przesłuchu immuno-kardio, dostęp do tych informacji staje się ważny, aby umożliwić naukowcom wybór odpowiednich modeli. Oprócz informacji fenotypowych podanych powyżej, zalecamy, aby badacze rozważyli również następujące ogólne wyzwania, które są związane z próbą modelowania ludzkiej choroby za pomocą myszy.

Złożona patofizjologia układowej choroby autoimmunologicznej

Wierne modelowanie chorób o etiologii i objawach fenotypowych tak różnych, jak te obserwowane w układowej autoimmunizacji, jest ogromnym wyzwaniem. Szlaki patologiczne leżące u podstaw uszkodzenia narządów w układowej autoimmunizacji są wielorakie i wzajemnie powiązane, a identyfikacja pojedynczego zdarzenia wyzwalającego lub molekularnego sprawcy nie była jak dotąd możliwa. W rzeczywistości zasugerowano, że SLE obejmuje kilka różnych grup chorób (Toro-Domínguez et al., 2018). Otwiera to możliwość stratyfikacji pacjentów i ukierunkowanego badania etiologii i mechanizmów w określonych grupach pacjentów. W międzyczasie badacze często uciekają się do modeli fenokopii wybranych objawów choroby i wysoce zalecane jest równoległe stosowanie kilku różnych modeli.

Czynniki środowiskowe

Powszechnym problemem dotyczącym modeli mysich jest to, że myszy laboratoryjne rodzą się i są utrzymywane w kontrolowanych warunkach, w niewielkim stopniu odpowiadającym środowisku ludzkiemu (Sundberg i Schofield, 2018). Jest to szczególnie istotne w przypadku badań immunologicznych, o których wiadomo, że wykazują silną wrażliwość na zmiany w diecie, mikrobiocie lub nieobecność lub obecność drobnoustrojów środowiskowych (Mu i wsp., 2017 Johnson i wsp., 2015). Staranne projektowanie eksperymentów i eksperymenty potwierdzające w oddzielnych obiektach dla zwierząt, które różnią się standardową dietą i repertuarem drobnoustrojów środowiskowych, mogą pomóc w uniknięciu fałszywych wyników i ograniczeniu tych obaw.

Różnorodność genetyczna

Obecne badania na mysich modelach opierają się w dużej mierze na wsobnych szczepach myszy, jednak nie mogą one naśladować genetycznie zróżnicowanej populacji ludzkiej. Jednak zmienna podatność oparta na zmienności genetycznej okazała się krytycznym czynnikiem determinującym ryzyko rozwoju autoimmunizacji, a także określającym główny narząd docelowy w układowej autoimmunizacji (Almlöf i in., 2017 Lanata i in., 2018). Co ważne, stworzono panele zróżnicowania genetycznego myszy, aby przezwyciężyć to ograniczenie.Na przykład panel różnorodności myszy Collaborative Cross uzyskano z systematycznego krzyżowania ośmiu wsobnych szczepów założycielskich (A/J, C57BL/6J, 129S1/SvImJ, NOD/ShiLtJ, NZO/H1LtJ, CAST/EiJ, PWK/PhJ i WSB/ EiJ) (Iraki i in., 2012). Dają możliwość identyfikacji wpływów genetycznych na przejawy autoimmunizacji.

Różnice międzygatunkowe w podstawowej fizjologii

Podczas gdy białka układu sercowo-naczyniowego, w tym miozyna i troponina, są wysoce konserwatywne, układ odpornościowy znajduje się pod silną presją ewolucyjną ze strony patogenów (Fumagalli et al., 2011). Dlatego też czynniki immunologiczne myszy i człowieka mogą się różnić, co może wpływać na bezpośrednią translację z modelu na pacjentów. Jednakże, chociaż poszczególne cząsteczki mogły ulec zmianie w toku ewolucji, ogólna funkcja komórek i sieci często pozostaje taka sama (Monaco i in., 2015). W związku z tym konkretny cel zidentyfikowany w modelach mysich wymaga starannej walidacji u ludzi, ale prawdopodobnie zaangażowane szlaki funkcjonalne są podobne.


Pododmiany myszy wsobnych różnią się aktywnością fizyczną jako zachowaniem.

Adaptacje wysiłkowe wynikają ze skoordynowanej odpowiedzi wielu układów narządów, w tym układu sercowo-naczyniowego, płucnego, endokryno-metabolicznego, immunologicznego i mięśni szkieletowych, ostatnio omówione przez Boverisa i Navarro [1], Freidenreicha i Voleka [2] oraz przez Perrino i in. [3]. Trening wysiłkowy jest sugerowany jako obiecujący środek zaradczy zapobiegający kilku stanom chorobowym oraz jako narzędzie rehabilitacyjne mające na celu przywrócenie zarówno siły, jak i wytrzymałości mięśni, w zależności od rodzaju ćwiczeń [4]. Proponuje się, aby regularne ćwiczenia oporowe połączone z odpowiednią podażą białka w celu utrzymania masy mięśniowej przeciwdziałały otyłości sarkopenicznej w starzejącej się populacji globalnej, co jest głównym wyzwaniem dla zdrowia publicznego [5]. We wszystkich powyższych przypadkach powszechnie stosowane są modele spożycia kalorii i ćwiczeń u gryzoni [6], a nowe mechanizmy molekularne leżące u podstaw efektów aktywności fizycznej zostały niedawno ujawnione [7, 8]. Niemniej anatomia i fizjologia gryzoni znacznie różnią się od anatomii człowieka. Chociaż wydaje się jasne, że Homo sapiens wyewoluował, aby wspierać smukły fenotyp biegacza wytrzymałościowego [9], lepsze zrozumienie podobieństw i różnic między modelami ludzkimi i zwierzęcymi ma ogromne znaczenie dla przełożenia odkryć w modelach przedklinicznych na warunki kliniczne.

Dwa główne rodzaje aktywności skurczowej, które są klasyfikowane jako rozwój niskiego napięcia mięśniowego przez dłuższy czas lub wytwarzanie wysokiego napięcia o ograniczonym czasie, są charakterystyczne odpowiednio dla ćwiczeń wytrzymałościowych i wytrzymałościowych. Wspomniane wyżej odpowiedzi adaptacyjne na poziomie całego organizmu oraz na poziomie komórkowym i molekularnym zależą od trybu wykonywanego wysiłku [10]. Na przykład zwiększona siła [1113], moc [14], powierzchnia przekroju mięśni [15-17], RNA i zawartość białka [18] zwykle występują po treningu siłowym. Wykazano, że ćwiczenia aerobowe i wytrzymałościowe zwiększają wydolność wysiłkową [19], zwiększają maksymalne zużycie tlenu [20], zwiększają aktywność enzymów oksydacyjnych [21] i podnoszą zawartość mitochondriów [22].

Opracowano kilka protokołów treningu wysiłkowego dla modeli gryzoni, aby naśladować ćwiczenia oporowe lub wytrzymałościowe. Na przykład w przypadku szczurów wspinanie się po pionowej drabinie jest sposobem na progresywne ćwiczenia oporowe [23]. Ostatnio zwalidowano bardzo ciekawy sprzęt i system ćwiczeń oporowych, oparty na przysiadach dla gryzoni, z kontrolą zmiennych treningowych [24]. Ten ostatni opiera się na systemie kondycjonującym złożonym z urządzeń dźwiękowych, świetlnych i do karmienia, dzięki czemu nie jest konieczne narzucanie zwierzęciu postu lub porażenia prądem w celu wykonania proponowanego zadania. Ćwiczenia wytrzymałościowe opierają się na bardziej wystandaryzowanych protokołach, w zasadzie biegania. Ćwiczenia na bieżni o kontrolowanej intensywności stanowią dobrze scharakteryzowany model ćwiczeń wytrzymałościowych [25]. Nachylenie i prędkość bieżni można regulować, a zwierzęta są trzymane w zamkniętej komorze z siatką uderzeniową, aby motywować myszy do biegania. Jedną z jego głównych zalet jest możliwość zwiększania intensywności ćwiczeń w czasie, co pozwala na poddanie gryzoni określonym programom treningowym. Jedną z wad bieżni jest fakt, że może ona wywoływać u myszy stres spowodowany warunkami środowiskowymi, niefizjologicznymi. Wręcz przeciwnie, spontaniczne ćwiczenia są często preferowanym rodzajem ćwiczeń w celach eksperymentalnych, ponieważ są fizjologiczne: są wykonywane do woli, głównie w nocy, naśladują naturalne zachowania, takie jak przerywane poruszanie się, typowe dla gryzoni typu dzikiego. wykazali, że taka dobrowolna aktywność jest powtarzalna i stabilna u poszczególnych myszy [26]. Umieszczenie myszy w klatkach wyposażonych w koła, w których ćwiczą do woli, klasycznie indukuje taką spontaniczną aktywność fizyczną. Wadą tego podejścia jest pewien stopień zmienności między i wewnątrzpopulacyjnej, co sprawia, że ​​absolutnie konieczne jest indywidualne monitorowanie aktywności biegowej za pomocą tachometrów.

Małe różnice genetyczne mogą mieć duży wpływ na fenotypy behawioralne [27]. Dlatego podłoże genetyczne różnych podszczepów powinno być starannie dobrane, zrównane i uwzględnione w interpretacji zmutowanych fenotypów behawioralnych. W tym celu Knab i in. ocenili powtarzalność powszechnie stosowanego testu maksymalnej wytrzymałości wysiłkowej na bieżni, a także dobrowolną aktywność fizyczną mierzoną przez bieganie na kółkach u myszy: nie stwierdzili znaczących różnic w wytrzymałości wysiłkowej między różnymi kohortami myszy BALB/c J i DBA/2 J, co wskazuje na ogólne szczepy generalnie testują to samo [26]. Oba szczepy są myszami wsobnymi, to znaczy populacjami, które są prawie identyczne pod względem genotypu z powodu długiego chowu wsobnego. Zwykła procedura to kojarzenie par brat-siostra przez 20 pokoleń, co daje linie, które są w przybliżeniu w 98% identyczne genetycznie. Rzeczywiście, szczepy wsobne zwierząt są często wykorzystywane w laboratoriach do eksperymentów, w których dla powtarzalności wniosków wszystkie badane zwierzęta powinny być jak najbardziej podobne.

BALB/c to szczep wsobny myszy rozpowszechniony na całym świecie i należący do najszerzej stosowanych szczepów wsobnych. Zwierzęta założycielskie szczepu ("Bagg albino") zostały uzyskane przez Halsey J. Bagg z Memorial Hospital w stanie Nowy Jork od handlarza myszami w Ohio w 1913 roku. W 1935 zwierzęta były w posiadaniu ucznia Mullera, George'a Davisa Snell, który przeniósł je do The Jackson Laboratory. Zapas ten stanowił podstawę wszystkich pododmian BALB/c, które są obecnie używane na całym świecie. BALB/c ByJ (myszy Jackson, przekazane do Jackson labs przez Bailey J., w 1974) zostały oddzielone od szczepu BALB/c J w 1935. Myszy BALB/c ByJ mają przewagę w postaci lepszej wydajności reprodukcyjnej i mniejszej agresywności niż BALB /c J pododkształcenie i stwarza wiele innych różnic z pododkształceniem J. Pomiędzy latami pięćdziesiątymi a siedemdziesiątymi trzeci pododmiana została oddzielona od wspomnianych dwóch pierwszych pododmian, to jest J i ByJ: Charles River AnNCrl (do Andervont w 1935 do NIH w 1951 z Andervont przy F72 do Charles River w 1974 z PZH).

Trzy podszczepy BALB/c były odseparowane przez dziesięciolecia i mogły się rozdzielić do takiego stopnia, aby wytworzyć wystarczające różnice genetyczne, aby wyjaśnić różnice behawioralne między podgatunkami, pozostając jednorodnymi w tej samej populacji. Myszy mogą znacząco różnić się pod względem ich aktywności fizycznej jako zachowania, co ma kluczowe znaczenie dla odtwarzalności i znaczenia badań wykorzystujących modele ćwiczeń. Różnice te mogą wydawać się łatwe do wyjaśnienia, gdy mamy do czynienia ze zwierzętami różnych płci lub szczepów. Zastanawialiśmy się jednak, czy nawet bardzo drobne różnice (takie jak rozróżnianie mysich podszczepów pojedynczego szczepu wsobnego) są w stanie określić znaczące różnice behawioralne. Z tego powodu porównaliśmy aktywność fizyczną myszy AnNCrl, ByJ i J BALB/c i znaleźliśmy uderzające różnice dotyczące ich chęci do biegania, gdy są trzymane w klatkach wyposażonych w koła. Nasze odkrycia mają ważne konsekwencje eksperymentalne z istotnymi skutkami ekonomicznymi i naukowymi.

2.1. Myszy. Myszy hojnie dostarczył Janvier (Le Genest Saint Isle, St Berthevin Cedex, Francja). W całym badaniu używaliśmy 7-tygodniowych myszy BALB/c następujących podszczepów: AnNCrl, ByJ i J. Użyliśmy łącznie 21, 12 i 12 samic myszy odpowiednio podszczepów AnNCrl, ByJ i J . Myszom pozwolono osiedlić się w zwierzętarni na jeden dzień, a następnie przeniesiono do klatek wyposażonych w koła. Kacheksję indukowano przez podskórny przeszczep przy użyciu trokaru fragmentu raka okrężnicy o grubości 0,5 [mm3] (C26, uzyskany z National Cancer Institute) w obszarze grzbietowym, jak opisano wcześniej [28]. Myszy utrzymywano w standardowych warunkach z cyklami dzień/noc po 12 godzin i pożywieniem ad libitum. Podczas eksperymentów myszy traktowano ściśle według wytycznych Institutional Animal Care and Use Committee oraz krajowych i europejskich przepisów.

2.2. Klatki. Klatki zakupiono z Animal Care System (Centennal, CO). Koła, skonstruowane jako okrągła otwarta drabina o średnicy 15 cm, zostały zakupione jako koła dla gryzoni w sklepach zoologicznych ogólnego odbiorcy. Tachometry, model DC-4 lub DC-9, zostały zakupione w Decathlon. Odczyty były rejestrowane każdego ranka przed 10 rano. Obserwowano sporadyczne zdarzenia związane z bieganiem dziennym. Kleenex został wprowadzony do klatki jako materiał do budowy gniazda, w celu zmniejszenia stresu związanego z izolacją (jedno zwierzę na klatkę).

2.3. Analiza immunohistochemiczna tkanek. Barwienie transferazą NADH przeprowadzono jak opisano wcześniej [28]. Analizę morfometryczną przeprowadzono oddzielnie na włóknach typu IIB (niska aktywność transferazy NADH, glikolityczna), typu IIA/X (średnia aktywność transferazy NADH, pośrednia) i typu I (wysoka aktywność transferazy NADH, utleniające). Dla każdego mięśnia przeanalizowano cały przekrój mięśnia, aby obliczyć procent każdego rodzaju włókna przy użyciu ImageJ 1.41 (bezpłatnego oprogramowania opracowanego przez dr W. Rasbanda w NIH i dostępnego pod adresem http://rsb.info.nih.gov /ij/). Włókna o średniej i wysokiej zawartości w mitochondriach zostały zebrane i zbiorczo uznane za włókna NADH transferaza+, czyli utleniające. Fotomikrografie uzyskano za pomocą systemu Axioskop 2 plus (Zeiss, Oberkochen, GE) lub mikroskopu Leica Leitz DMRB wyposażonego w kamerę DFC300FX (Leica, Wetzlar, Niemcy).

2.4. Analiza statystyczna. Jednoczynnikową lub dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) zastosowano odpowiednio do analizy jednej lub dwóch zmiennych. Do porównań post hoc między określonymi grupami zastosowano albo test Tukeya LSD, albo test f Studenta, jak wskazano. Poziomy istotności dla tych testów ustalono na P < 0,05 lub P < 0,01, jak określono. Punkt i przedział oszacowano na poziomie ufności 95%. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą VassarStats, witryny internetowej do obliczeń statystycznych, dostępnej bezpłatnie pod adresem http://vassarstats.net/.

Myszy z trzech podszczepów BALB/c, to jest AnNCrl, ByJ i J, zostały pozyskane przez tego samego sprzedawcę i utrzymywane w tym samym czasie w tym samym obiekcie dla zwierząt. Każda klatka wyposażona w kółko była używana dla jednej myszy, której spontaniczna aktywność biegania na kółku była rejestrowana komercyjnym obrotomierzem. Dystans przejechany przez okres czterech dni był rejestrowany codziennie, przy czym średnia km/dzień w tym okresie została uznana za minimalizującą dzienne wahania. Myszy wyraźnie dzielą się na dwie populacje biegaczy i niebiegających, przy czym ta ostatnia całkowicie ignoruje koło jako takie i nie wykazuje żadnego zainteresowania bieganiem kołem. Próg do zdefiniowania biegacza został ustawiony na 1 km dystansu przejechanego na kole przez okres 4 dni. Kilka rund niezależnych eksperymentów, z udziałem 6 myszy dla każdego z trzech podszczepów, powtórzono i oceniono procent biegaczy dla każdego podszczepu w każdym eksperymencie. W ten sposób średni procent biegaczy w danym eksperymencie i związany z nim SEM został obliczony jako funkcja podszczepu. Odkryliśmy, że biegacze mieli 85,1 [+ lub -] 3,4%, 72,0 [+ lub -] 3,0% i 38,2 [+ lub -] 7,7% odpowiednio AnNCrl, ByJ i J (Rysunek 1 (a )). Stwierdzono, że 95% przedziały ufności wynosiły odpowiednio 76,9-93,2%, 59,1-84,9% i 18,5-57%. Jednokierunkowa analiza ANOVA (F = 21,61 P < 0,0001) wykazała istotną zależność odsetka biegaczy od podszczepu, przy czym bieg BALB/c J wykazał znacznie niższą liczbę biegaczy w porównaniu z pozostałymi dwoma podszczepami według posta Tukeya z HSD test hokejowy. Biorąc pod uwagę jedynie populację biegaczy, oszacowaliśmy następnie dystans pokonywany codziennie na kole przez przedstawicieli trzech podgrup. Okazało się, że myszy biegają 5,0 [+ lub -] 0,3 km/d, 4,7 [+ lub -] 1,4 km/d i 3,7 [+ lub -] 0,6 km/d dla pododmian AnNCrl, ByJ i J , odpowiednio (Rysunek 1(b)). Stwierdzono, że 95% przedziały ufności wynosiły odpowiednio 4,1-5,8 km/d, 3,3-6,1 km/d i 2,2-5,0 km/d. Podczas gdy jednoczynnikowa ANOVA (F = 1,88 P = 0,167) nie wykazała zależności obserwowanego trendu w dziennym dystansie biegu na podstawie pododkształcenia, wstępnie wykorzystaliśmy test f-Studenta, aby statystycznie zbadać różnicę wykazaną przez J i stwierdzono, że jest znacznie niższy w porównaniu z podszczepem AnNCrl. Podsumowując, zaobserwowaliśmy, że większość myszy BALB/c J nie biega spontanicznie na kole, inaczej niż BALB/c AnNCrl i BALB/c ByJ, z których zdecydowana większość jest gotowa do biegu. Co więcej, nawet gdy BALB/c J biegną, pokonują średnio mniejszy dystans w porównaniu z myszami BALB/cAnNCrl i BALB/c ByJ. Doszliśmy do wniosku, że BALB/c AnNCrl jest najlepszym podszczepem do badań obejmujących spontaniczną aktywność fizyczną, taką jak bieganie na kole. Z tego powodu ten podszczep był używany w dalszej części badania.

Aby ocenić, czy obserwowana aktywność polegająca na bieganiu na kółkach wykazuje cechy treningu wysiłkowego i czy 5 km/dzień stanowi górną granicę aktywności fizycznej myszy BALB/c, zarejestrowaliśmy kinetykę biegu na kółkach myszy przez prawie trzy tygodnie. Do tego zestawu eksperymentów zdecydowaliśmy się użyć podszczepu AnNCrl myszy BALB/c, ponieważ zachowywały się one jak najbardziej aktywne myszy. Zauważyliśmy, że zachowanie myszy podczas biegania jest dwufazowe, z pierwszym tygodniem spędzonym na zapoznaniu się z kołem, z wybitnym (jak na wielkość zwierząt), ale umiarkowanym dystansem dziennym w porównaniu z drugim i trzecim tygodniem aktywności, w którym dzienna odległość pokonywana przez myszy osiąga poziom plateau, który jest ponad dwukrotnością początkowego km/d (co odpowiada ponad 11 km/dzień, Rysunek 2). W tym kontekście zastanawialiśmy się również, czy myszy były w stanie wykonywać dobrowolną aktywność fizyczną w stanach patologicznych, takich jak kacheksja wywołana nowotworem [29]. W ten sposób zarejestrowaliśmy codzienną aktywność biegową myszy z rakiem okrężnicy C26, u których rozwija się postępująca i ciężka forma zaniku mięśni związanego ze osłabieniem i zmęczeniem [28]. Myszy z nosicielem C26 biegają mniej więcej taki sam km/d jak zwierzęta kontrolne w pierwszym tygodniu aktywności, kiedy rozmiar guza jest nadal nieistotny, jednak nie wykazują takiego samego progresywnego wzrostu dystansu przejechanego na kole jak zwierzęta kontrolne w drugim tygodniu. tydzień aktywności. Wraz z postępem choroby i jawną kacheksją biegają dalej przez około 7 km/d, co jest uderzającą ilością ćwiczeń, biorąc pod uwagę, że myszy z nowotworami tracą około 25% masy ciała w ciągu trzech tygodni. Dwuczynnikowa ANOVA obliczona w ciągu ostatnich czterech dni rejestracji (tj. od dnia 15 do dnia 18) pokazuje, że tylko obecność guza znacząco wpływa na zachowanie podczas biegania, bez wpływu na czas (F = 19,74 P < 0,0001 Tukeya HSD P < 0,01 dla kontroli w porównaniu z łożyskiem C26). Dane te wskazują, że myszy BALB/c AnNCrl nie tylko spontanicznie biegają kilka kilometrów dziennie, ale również mają tendencję do progresywnego zwiększania odległości pokonywanej na kole. Myszy z nowotworem, schorzeniem głęboko wpływającym na masę i funkcję mięśni, nadal są zdolne do wykonywania znacznej aktywności fizycznej, choć w mniejszym stopniu niż zdrowe myszy. Wskazuje to, że bieganie kołowe może być wykorzystane jako model interwencji ćwiczeń wytrzymałościowych w warunkach patologicznych u gryzoni.

Trening wytrzymałościowy aktywuje szlaki metaboliczne i przebudowę mięśni szkieletowych. Istotną cechą tego typu ćwiczeń jest stymulacja cyklu Krebsa i mitochondriogenezy we włóknach mięśniowych. Ponieważ u myszy BALB/c AnNCrl zaobserwowaliśmy spontaniczny, ale znaczący wzrost aktywności fizycznej podczas drugiego tygodnia trwałości w klatkach wyposażonych w koła, postawiliśmy hipotezę, że zwiększona wydajność była związana ze zmianami metabolicznymi, które sprawiły, że mięśnie przystosowały się do ćwiczeń wytrzymałościowych. Przeprowadziliśmy zatem analizę histochemiczną mięśni szkieletowych myszy BALB/c AnNCrl po dwóch różnych okresach biegania na kółkach, tj. pięciu i dziewiętnastu dniach, aby monitorować zjawisko konwersji włókien do bardziej oksydacyjnego fenotypu po wysiłku. Barwiąc transferazę NADH na mięśniu piszczelowym przednim (TA) (ryc. 3 (a) i 3 (b)), podkreśliliśmy włókna bogate w mitochondria (włókna oksydacyjne i pośrednie, zwykle odpowiadające typowi I i IIA lub X). TA został wybrany ze względu na mieszaną populację typów włókien (wszystkie typy są reprezentowane), które okazały się szczególnie odpowiednie do badania zmian w typach włókien. Podczas gdy zaobserwowaliśmy wzrost liczby włókien transferazy NADH+ z 64 [+ lub -] 5% do 72 [+ lub -] 3% po dziewiętnastu dniach ćwiczeń, jednokierunkowa ANOVA (F = 2,39 P = 0,162) wykazała brak statystycznie istotnego wpływu ćwiczeń na ten parametr (Rysunek 3(c)).

Wykazaliśmy, że trzy podszczepy tych samych myszy wsobnych, a mianowicie BALB/c AnNCrl, ByJ i J, wykazują uderzające różnice w ich zachowaniu w odniesieniu do spontanicznej aktywności fizycznej. Zjawisko to zaobserwowano pomimo faktu, że trzy podszczepy wykazują niezwykłe podobieństwa genetyczne, czego przykładem jest brak barier zgodności tkankowej. Fakt, że ogromna większość myszy AnNCrl i, w mniejszym stopniu, myszy ByJ biega przez kilka km dziennie, odróżnia te dwa podszczepy od myszy J. Według naszej wiedzy jest to pierwszy artykuł dotyczący znaczących różnic behawioralnych między podszczepami tego samego szczepu wsobnego myszy. Badacze planujący przeprowadzenie eksperymentów wymagających ruchu kołowego powinni być świadomi tych nieoczekiwanych odkryć. W rzeczywistości wybór pododmiany J, która jest mniej podatna na bieganie kołem, determinowałby bardzo małą ilość ćwiczeń wykonywanych przez ograniczoną liczbę myszy.Co ciekawe, podszczep J jest najtańszy (przynajmniej u dostawcy użytego do tego badania), jednak jeśli odpowiednia liczba zwierząt zostanie wykluczona z badania, ponieważ nie ćwiczą, koszty muszą zostać ponownie obliczone. Badacze, którzy z przyczyn eksperymentalnych muszą używać pododmiany J i absolutnie wymagają, aby ćwiczyli biegając na kółkach, mogą rozważyć wybór myszy we wstępnych eksperymentach zgodnie z ich zachowaniem biegowym, aby z wyprzedzeniem oddzielić biegaczy od niebiegających. W przeciwnym razie badacze zainteresowani wykorzystaniem myszy BALB/c do eksperymentów związanych z ćwiczeniami mogą po prostu chcieć wybrać pododmianę AnNCrl lub ByJ.

Pomysł, że różne szczepy myszy zachowują się inaczej podczas jazdy na kółkach, nie jest nowy, ale ponownie nasze badanie pokazuje, że nawet bardzo drobne różnice (takie jak te wyróżniające podszczepy) są w stanie określić znaczące różnice behawioralne. Kilka badań wiązało wpływ genetyczny z aktywnością fizyczną, ale badania na zwierzętach często prowadzono tylko z jedną płcią lub ograniczoną liczbą szczepów, zmniejszając w ten sposób pokrycie genomu i ogólność wyników, które Lightfoot et al. wyraźnie wykazały, że aktywność fizyczna jako zachowanie ma podłoże genetyczne [30]. Ich wyniki sugerują, że potencjalne mechanizmy genetyczne wynikające z tradycyjnych niekodujących regionów genomu mogą być zaangażowane w regulację aktywności fizycznej [30]. Oczywiście inne badania wyraźnie pokazują, że podgrupy myszy różnią się kilkoma cechami innymi niż aktywność fizyczna jako zachowanie. Na przykład wykazano, że tło genetyczne czterech różnych podgatunków myszy wpływa na ich podatność na radzenie sobie z wyzwaniami środowiskowymi, takimi jak narażenie na nowość, autorzy konsekwentnie sugerują rozważenie wytycznych i protokołów specyficznych dla pododmiany, biorąc pod uwagę zdolności adaptacyjne specyficzne dla pododmiany pod uwagę [31]. Całkowicie zgadzamy się z autorami tego badania. Inne intrygujące badanie wykazało, że dwa podszczepy myszy BALB/c, BALB/cByJ i BALB/cAnNCr, są odpowiednio odporne i podatne na mysie zapalenie mózgu i rdzenia Theilera, chorobę demielinizacyjną wywoływaną przez wirusy [32]. Fakt, że te dwa podszczepy są zgodne tkankowo, czyni z nich dobry model do badania mechanizmów infekcji wirusowej, ponieważ umożliwiają one przenoszenie komórek między myszami naturalnie opornymi i naturalnie podatnymi przy braku immunodepresji. Podobnie można by przewidzieć możliwość przeszczepów komórek satelitarnych między różnymi podszczepami BALB/c w celu sprawdzenia, czy drobne różnice genetyczne są odpowiedzialne za zróżnicowane cechy komórek macierzystych mięśni, takie jak ich zdolność do wszczepienia w regenerujące się mięśnie. Można nawet zastanawiać się, czy komórki satelitarne z biegacze spontaniczni mogliby nadać otrzymanym włóknom mięśniowym wewnętrzne właściwości mechaniczne lub kurczliwe bardziej odpowiednie do biegania.

Nasze badanie jest zgodne z wcześniejszymi wynikami pokazującymi, że myszy spontanicznie biegają od 5 do 10 km dziennie [30]. Ten niesamowity poziom dobrowolnej aktywności jest ważnym faktem, o którym należy pamiętać i stanowi niezwykły wyczyn dla tak drobnego gatunku. Stwierdzono, że „takie odległości pokonywane codziennie przez znacznie większych ludzi prawdopodobnie wyleczyłyby większość chorób epidemicznych, z jakimi boryka się świat, w tym otyłość i cukrzyca typu 2” [33].

Bieganie wiąże się z wyraźną adaptacją metaboliczną mięśni szkieletowych [34, 35]. W szczególności doniesiono, że dobrowolne ćwiczenia biegowe indukują stały wzrost odsetka włókien NADH-dodatnich do transferazy w mięśniu TA, co było znaczące po 4 tygodniach dobrowolnych ćwiczeń [36]. Otrzymaliśmy bardzo podobne wyniki pod względem wpływu wysiłku na odsetek włókien NADH transferaza+, z tym wyjątkiem, że nie wykazaliśmy istotności takiego efektu. Może to być spowodowane kilkoma różnicami między tymi dwoma badaniami: szczep myszy (BALB/c, C57/Bl6), płeć (samica, samiec), odległość (5 km/dzień, średnio 6,8 km/dzień) oraz ramy czasowe (3 tygodnie, 4 tygodnie) każda z tych różnic może być wystarczająca do wyjaśnienia, dlaczego nie mogliśmy zaobserwować statystycznie istotnego wzrostu włókien oksydacyjnych u myszy wysiłkowych. Obserwowany trend jest zgodny ze zwiększonym zapotrzebowaniem na zdolność oksydacyjną mięśni, co sugeruje, że ćwiczenia wytrzymałościowe niezmiennie wpływają na metabolizm mięśni poprzez faworyzowanie oksydacyjnego fenotypu włókien mięśniowych.

Na koniec należy zauważyć, że efekty terapeutyczne i ergogeniczne ćwiczeń kontrolowanych, w przeciwieństwie do ćwiczeń spontanicznych, mogą się znacznie różnić u gryzoni. Co ciekawe, te dwa rodzaje ćwiczeń mogą mieć bardzo różne wyniki w zależności od docelowego narządu. Na przykład dobrowolna aktywność powoduje bardziej widoczne zmiany plastyczne w tworzeniu hipokampa szczura niż wywołane wymuszonym wysiłkiem [37].

Uznanie udowodnionych korzyści płynących z treningu fizycznego dla wyników zdrowotnych oraz tendencja do zwiększania braku aktywności na poziomie populacji sprawiła, że ​​zalecenie ćwiczeń fizycznych stało się dyrektywą o pierwszorzędnym znaczeniu. Równolegle badania nad adaptacjami organizmów i mięśni do zwiększonej aktywności fizycznej stale wzrastają w czasie, co pokazuje trend cytowań PubMed ze słowami kluczowymi ćwiczenia i wytrzymałość/odporność. Przy takim rozpowszechnieniu modeli zwierzęcych i eksperymentalnych poświęconych wysiłkowi, ważne jest, aby jasno zdefiniować główne cechy modeli eksperymentalnych stosowanych w danym badaniu i być bardzo formalnym przy ocenie, do jakiego stopnia można prowadzić uogólnienie wyników. Donosimy tutaj, że trzy podszczepy tego samego szczepu wsobnego myszy, BALB/c, wykazują znaczące różnice w aktywności fizycznej jako zachowaniu. Proponujemy, aby nie tylko użyty szczep myszy, ale także podszczep musi być jasno określony i wybrany świadomie, ponieważ różnice w spontanicznej aktywności fizycznej między podszczepami mogą wpływać na adaptację mięśni wywołaną wysiłkiem fizycznym.

D. Coletti jest wspierany przez UPMC Emergence 2011 i AFM 2012. Z. Li jest wspierany przez ANR i AFM. PRIN 2009 (Projekt nr 2009WBFZYM_001) i Włoska Agencja Kosmiczna (ASI), projekt OSMA, grant dla S. Adamo zostały również wyróżnione. Autorzy są wdzięczni Carli Raminie za jej cenną pomoc techniczną. Z wdzięcznością dziękują Richardowi Lowry'emu, emerytowanemu profesorowi psychologii w Vassar College za jego internetowe, przyjazne dla użytkownika narzędzie do wykonywania obliczeń statystycznych, VassarStats, którego używali do analizy statystycznej. Myszy użyte w tym badaniu były hojnym darem Janvier SAS (Le Genest St Isle, St Berthevin Cedex, Francja).

[1] A. Boveris i A. Navarro, „Systemowe i mitochondrialne reakcje adaptacyjne na umiarkowane ćwiczenia u gryzoni”, Free Radical Biology and Medicine, tom. 44, nie. 2, s. 224-229, 2008.

[2] DJ Freidenreich i JS Volek, „Odpowiedzi immunologiczne na ćwiczenia oporowe”, Exercise Immunology Review, tom. 18, s. 8-41, 2012.

[3] C. Perrino, G. Gargiulo, G. Pironti i wsp., „Skutki sercowo-naczyniowe ćwiczeń na bieżni w fizjologicznych i patologicznych warunkach przedklinicznych”, American Journal of Physiology, tom. 300, nie. 6, s. H1983-H1989, 2011.

[4] J.M. Argiles, S. Busquets, F.J. Lopez-Soriano, P. Costelli i F. Penna: „Czy są jakieś korzyści z treningu wysiłkowego w kacheksji nowotworowej?” Dziennik wyniszczenia, sarkopenii i mięśni, obj. 3, nie. 2, s. 73-76, 2012.

[5] Z. Li i D. Heber, „Otyłość sarkopeniczna u osób starszych i strategie kontroli wagi”, Przegląd żywieniowy, tom. 70, nie. 1, s. 57-64, 2012.

[6] GS Young i JB Kirkland, „Szczurowe modele spożycia kalorii i aktywności: związki z fizjologią zwierząt i zdrowiem człowieka”, Fizjologia Stosowana, Żywienie i Metabolizm, tom. 32, nie. 2, s. 161-176, 2007.

[7] GM Ellison, CD Waring, C. Vicinanza i D. Torella, „Fizjologiczna przebudowa serca w odpowiedzi na trening wytrzymałościowy: mechanizmy komórkowe i molekularne”, Heart, tom. 98, nie. 1, s. 5-10, 2012.

[8] J.L. Ruas, J.P. White, R.R. Rao i in., „Izoforma PGC-lalfa indukowana przez trening oporowy reguluje przerost mięśni szkieletowych”, Cell, tom. 151, nie. 6, s. 1319-1331, 2012.

[9] MP Mattson, „Ewolucyjne aspekty ludzkich ćwiczeń – urodzony, by działać celowo”, Aging Ressearch Review, tom. 11, nie. 3, s. 347-352, 2012.

[10] AV Khamoui i JS Kim, „Mechanizmy kandydujące leżące u podstaw wpływu aktywności skurczowej na morfologię i energetykę mięśni w kacheksji nowotworowej”, European Journal of Cancer Care, tom. 21, nie. 2, s. 143-157, 2012.

[11] S.B. Kelly, L.E. Brown, J.W. Coburn, SM Zinder, L.M. Gardner i D. Nguyen, „Wpływ pojedynczych lub wielu zestawów na siłę”, Journal of Strength and Conditioning Research, tom. 21, nie. 4, s. 1003-1006, 2007.

[12] M.R. Rhea, B.A. Alvar, S.D. Ball i L.N. Burkett, „Trzy serie treningu siłowego lepsze niż jeden zestaw z równą intensywnością w celu wydobycia siły”, Journal of Strength & Conditioning Research, tom. 16, nie. 4, s. 525-529, 2002.

[13] J.K. Petrella, J.S. Kim, J.M. Cross, D.J. Kosek i M.M. Bamman, „Skuteczność dodatku myonujądrowego może wyjaśniać zróżnicowany wzrost włókien mięśniowych wśród młodych i starszych mężczyzn i kobiet trenujących oporowo”, American Journal of Physiology, tom. 291, nr. 5, s. E937-E946, 2006.

[14] P. Cormie, J.M. Mcbride i G.O. Mccaulley, „Analiza krzywej moc-czas, siła-czas i prędkość-czas skoku przeciwnego: wpływ treningu”, Journal of Strength and Conditioning Research, tom. 23, nie. 1, s. 177-186, 2009.

[15] P. A. Tesch i J. Karlsson, „Typy i rozmiar włókien mięśniowych w wytrenowanych i niewytrenowanych mięśniach elitarnych sportowców”, Journal of Applied Physiology, tom. 59, nie. 6, s. 1716-1720, 1985.

[16] JW Coburn, DJ Housh, T J. Housh i wsp., „Wpływ suplementacji leucyną i białkiem serwatkowym podczas ośmiu tygodni jednostronnego treningu oporowego”, Journal of Strength and Conditioning Research, tom. 20, nie. 2, s. 284-291, 2006.

[17] D.J. Kosek, JS Kim, JK Petrella, JM Cross i M.M. Bamman, „Skuteczność treningu oporowego 3 dni/tydzień na przerost włókien mięśniowych i mechanizmy miogenne u młodych i starszych dorosłych”, Journal of Applied Physiology, tom. 101, nie. 2, s. 531-544, 2006.

[18] T S. Wong i F. W. Booth, „Powiększenie mięśni szkieletowych za pomocą ćwiczeń z podnoszeniem ciężarów przez szczury”, Journal of Applied Physiology, tom. 65, nie. 2, s. 950-954, 1988.

[19] A.C. Betik, M.M. Thomas, KJ Wright, C.D. Riel i R.T. Hepple, „Trening ćwiczeń od późnego wieku średniego do starzenia się nie łagodzi spadków funkcji tlenowych mięśni szkieletowych”, American Journal of Physiology, tom. 297, nr. 3, s. R744-R755, 2009.

[20] K.R. Short, JL Vittone, M.L. Bigelow i in., „Wpływ treningu aerobowego na związane z wiekiem zmiany wrażliwości na insulinę i zdolności oksydacyjnej mięśni”, Diabetes, tom. 52, nie. 8, s. 1888-1896, 2003.

[21] J. O. Holloszy, „Adaptacja mięśni szkieletowych do ćwiczeń wytrzymałościowych”, Medycyna i nauka w sporcie i ćwiczeniach, tom. 7, nie. 3, s. 155-164, 1975.

[22] JO Holloszy, „Adaptacje biochemiczne w mięśniach. Wpływ ćwiczeń na mitochondrialny pobór tlenu i aktywność enzymów oddechowych w mięśniach szkieletowych”, Journal of Biological Chemistry, tom. 242, nr. 9, s. 2278-2282, 1967.

[23] NJ Hellyer, JJ Nokleby, BM Thicke, WZ Zhan, GC Sieck i CB Mantilla, „Zmniejszona fosforylacja białka rybosomalnego s6 po progresywnym ćwiczeniu oporowym u rosnących dorastających szczurów”, Journal of Strength & Conditioning Research, tom. 26, nie. 6, s. 1657-1666, 2012.

[24] H. Nicastro, N.E. Zanchi, C.R. Da Luz, D.F. Chaves i A.H. Lancha Jr., „Eksperymentalny model ćwiczeń oporowych u gryzoni”, Journal of Biomedicine & Biotechnology, tom. 2012, artykuł ID 457065, 7 stron, 2012.

[25] F. Penna, S. Busquets, F. Pin i in., „Połączone podejście do przeciwdziałania eksperymentalnej kacheksji nowotworowej: kwas eikozapentaenowy i ćwiczenia treningowe”, Journal of Cachexia Sarcopenia Muscle, tom. 2, nie. 2, s. 95-104, 2011.

[26] AM Knab, R.S. Bowen, T. Moore-Harrison, AT Hamilton, MJ Turner i JT Lightfoot, „Powtarzalność zachowań podczas ćwiczeń u myszy”, Fizjologia i zachowanie, tom. 98, nie. 4, s. 433-440, 2009.

[27] N. Matsuo, K. Takao, K. Nakanishi, N. Yamasaki, K. Tanda i T. Miyakawa, "Behawioralne profile trzech podszczepów C57BL/6", Frontiers in Behavioural Neuroscience, tom. 4, s. 29, 2010.

[28] P. Aulino, E. Berardi, M.V. Cardillo i in., „Molekularna, komórkowa i fizjologiczna charakterystyka indukującego kacheksję raka okrężnicy C26 u myszy” BioMed Central Cancer, tom. 10, s. 363, 2010.

[29] W.J. Evans, J.E. Morley, J. Argiles i in., „Cachexia: nowa definicja”, Clinical Nutrition, tom. 27, nie. 6, s. 793-799, 2008.

[30] J.T. Lightfoot, L. Leamy, D. Pomp i in., „Strain screen and haplotype asocjacji mapowanie koła biegnącego w inbredowych szczepach myszy”, Journal of Applied Physiology, tom. 109, nie. 3, s. 623-634, 2010.

[31] H. Boleij, A.R. Salomons, M. van Sprundel, S.S. Arndt i F. Ohl, „Nie wszystkie myszy są równe: implikacje dobrostanu profili przyzwyczajenia behawioralnego w czterech 129 podgatunkach myszy”, PloS One, tom. 7, nie. 8, s. e42544, 2012.

[32] K.A. Karls i R.W. Melvold, „Podatność na chorobę demielinizacyjną wywołaną wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theiler u myszy BALB/cAnNCr jest związana z brakiem podzbioru limfocytów T CD4+”, Stwardnienie rozsiane, tom. 8, nie. 6, s. 469-474, 2002.

[33] JM Hagberg, „Geny ćwiczeń? I nie, nie 501 Leviego!”, Journal of Applied Physiology, tom. 109, nie. 3, s. 619-620, 2010.

[34] K.M. Baldwin, D.A. Cooke i W.G. Cheadle, „Adaptacje przebiegu czasu w mięśniach sercowych i szkieletowych do różnych programów biegania”, Journal of Applied Physiology, tom. 42, nie. 2, s. 267-272, 1977.

[35] W.L. Sexton, „Adaptacje naczyniowe w mięśniach szkieletowych kończyn tylnych szczura po dobrowolnych ćwiczeniach na kole biegowym”, Journal of Applied Physiology, tom. 79, nie. 1, s. 287-296, 1995.

[36] D.L. Allen, B.C. Harrison, A. Maass, M.L. Bell, W.C. Byrnes i L.A. Leinwand, „Adaptacje mięśnia sercowego i szkieletowego do dobrowolnego koła biegającego u myszy”, Journal of Applied Physiology, tom. 90, nie. 5, s. 1900-1908, 2001.

[37] R.M. Arida, C.A. Scorza, A.V. Da Silva, F.A.Scorza i E.A. Cavalheiro, „Różnice w działaniu spontanicznych i wymuszonych ćwiczeń u szczurów na barwienie parwalbuminy-dodatnich neuronów w hipokampie”, Neuroscience Letters, tom. 364, nr. 3, s. 135-138, 2004.

Dario Coletti, (1,2,3) Emanuele Berardi, (4) Paola Aulino, (1,2,3) Eleonora Rossi, (2,3) Viviana Moresi, (2,3) Zhenlin Li, (1) i Sergio Adamo (2,3)

(1) Starzenie się, stres, stan zapalny UR4, Uniwersytet Pierre et Marie Curie Paris 6, 7 Quai Saint Bernard, 75005 Paryż, Francja

(2) Department of Anatomical, Histological, Forensic & Orthopaedic Sciences, Sekcja Histologii i Embriologii Medycznej, Uniwersytet Sapienza w Rzymie, Via Scarpa 16, 00161 Rzym, Włochy

(3) Międzyuczelniany Instytut Miologii, 00161 Rzym, Włochy

(4) Laboratorium Kardiomiologii Translacyjnej, Departament Rozwoju i Regeneracji, Katholieke Universiteit Leuven, 3000 Leuven, Belgia

Korespondencję należy kierować na adres Dario Coletti [email protected]

Otrzymano 30 grudnia 2012 Przyjęto 4 lutego 2013

Redaktorzy akademiccy: L. Guimaraes-Ferreira, H. Nicastro, J. Wilson i N. E. Zanchi


Bibliografia

Harms DW, Quadros RM, Seruggia D, Ohtsuka M, Takahashi G, Montoliu L i in. Edycja genomu myszy przy użyciu systemu CRISPR/Cas. Curr Protoc Hum Genet. 201483:15.7.1–15.7.27.

Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F i in. Jednoetapowe generowanie myszy niosących mutacje w wielu genach za pomocą inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas. Komórka. 2013153:910–8.

Gurumurthy CB, Grati M, Ohtsuka M, Schilit SLP, Quadros RM, Liu XZ. CRISPR: wszechstronne narzędzie do badań genetyki w przód i wstecz. Szum Geneta. 2016135:971–6.

Hashimoto M, Yamashita Y, Takemoto T. Elektroporacja Cas9 białka/sgRNA do wczesnych przedjądrowych zygot generuje niemozaikowe mutanty u myszy. Dev Biol. 2016418:1–9.

Kaneko T, Mashimo T. Prosta edycja genomu nienaruszonych zarodków gryzoni przez elektroporację. PLoS Jeden. 201510:e0142755.

Kaneko T, Sakuma T, Yamamoto T, Mashimo T. Prosty nokaut przez elektroporację zmodyfikowanych endonukleaz do nienaruszonych zarodków szczura. Sci Rep. 20144:6382. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4180828/.

Chen S, Lee B, Lee AYF, Modzelewski AJ, He L. Wysoce wydajna edycja genomu myszy przez elektroporację rybonukleoproteinową CRISPR zygot. J Biol Chem. 2016291:14457–67.

Hashimoto M, Takemoto T. Elektroporacja umożliwia wydajne dostarczanie mRNA do zygot myszy i ułatwia edycję genomu w oparciu o CRISPR/Cas9. Sci Rep. 20155:11315. https://www.nature.com/articles/srep11315

Qin W, Dion SL, Kutny PM, Zhang Y, Cheng AW, Jillette NL i in. Wydajna edycja genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u myszy poprzez elektroporację zygoty nukleazy. Genetyka. 2015200:423–30.

Takahashi G, Gurumurthy CB, Wada K, Miura H, Sato M, Ohtsuka M. GONAD: Edycja genomu za pomocą systemu dostarczania kwasów nukleinowych jajowodowych: nowatorska metoda inżynierii genomu niezależna od mikroiniekcji u myszy. Sci Rep. 20155:11406.

Wada K, Maeda YY, Watanabe K, Oshio T, Ueda T, Takahashi G, et al. Delecja w elemencie cis Foxe3 powoduje zaćmę i mikroftalmię u myszy rct. Mamm Genom. 201122:693–702.

Medina-Martinez O, Brownell I, Amaya-Manzanares F, Hu Q, Behringer RR, Jamrich M. Poważne wady proliferacji i różnicowania komórek soczewki u myszy zerowych Foxe3. Mol Komórkowy Biol. 200525:8854–63. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1265778/?tool=pmcentrez

Aida T, Chiyo K, Usami T, Ishikubo H, Imahashi R, Wada Y, et al. System CRISPR/Cas bez klonowania ułatwia wstawienie funkcjonalnej kasety u myszy. Biol genomowy. 201516:87. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4414275/?tool=pmcentrez

Jacobi AM, Rettig GR, Turk R, Collingwood MA, Zeiner SA, Quadros RM i in. Uproszczone narzędzia CRISPR do wydajnej edycji genomu i usprawnione protokoły ich dostarczania do komórek ssaków i mysich zygot. Metody. 2017121–2:16–28. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104620231630442X?via%3Dihub

Yokoyama T, Silversides DW, Waymire KG, Kwon BS, Takeuchi T, Overbeek PA. Konserwatywna mutacja cysteiny do seryny w tyrozynazie jest odpowiedzialna za klasyczną mutację albinosu u myszy laboratoryjnych. Kwasy nukleinowe Res. 199018:7293-8.

Pettitt SJ, Liang Q, Rairdan XY, Moran JL, Prosser HM, Beier DR i in. Zarodkowe komórki macierzyste Aguti C57BL/6N dla zasobów genetycznych myszy. Metody Nat. 20096:493-5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3555078/?tool=pmcentrez

Miura H, Gurumurthy CB, Sato T, Sato M, Ohtsuka M. Generowanie myszy knockdown CRISPR/Cas9 przez intronowe wstawienie sztucznego mikroRNA przy użyciu dłuższego jednoniciowego DNA. Sci Rep. 20155:12799.

Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, ​​Sato T, Aida T, et al. Easi-CRISPR: solidna metoda jednoetapowego generowania myszy niosących allele warunkowe i insercyjne przy użyciu donorów długiego ssDNA i rybonukleoprotein CRISPR. Biol genomowy. 201718:92. https://doi.org/10.1186/s13059-017-1220-4.

Miura H, Quadros RM, Gurumurthy CB, Ohtsuka M. Easi-CRISPR za tworzenie modeli myszy knock-in i warunkowo knockout przy użyciu długich dawców ssDNA. Protokół Nat. 201813:195–215.

Grealish S, Jönsson ME, Li M, Kirik D, Björklund A, Thompson LH. Składnik neuronu dopaminowego A9 w przeszczepach brzusznego śródmózgowia jest ważnym wyznacznikiem powrotu funkcji motorycznych w szczurzym modelu choroby Parkinsona. Mózg. 2010133:482–95.

Haubensak W, Attardo A, Denk W, Huttner WB. Neurony powstają w podstawnym nabłonku nerwowym wczesnego kresomózgowia ssaków: głównym miejscu neurogenezy. Proc Natl Acad Sci. 2004101:3196–201. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC365766/

Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, et al. Cpf1 jest pojedynczą endonukleazą sterowaną przez RNA systemu CRISPR-Cas klasy 2. Komórka. 2015163:759–71.

Hur JK, Kim K, Been KW, Baek G, Ye S, Hur JW i in. Ukierunkowana mutageneza u myszy poprzez elektroporację rybonukleoprotein Cpf1. Nat Biotechnol. 201634:807-8. https://www.nature.com/articles/nbt.3596

Gurumurthy CB, Takahashi G, Wada K, Miura H, Sato M, Ohtsuka M. GONAD: nowatorska metoda edycji genomu CRISPR/Cas9, która nie wymaga obsługi zarodków ex vivo. Curr Protoc Hum Genet 201688:15.8.1–15.8.12. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4733652/

Hancks DC, Kazazian HH, Koning A, Gu W, Castoe T, Batzer M i in. Role insercji retrotranspozonów w chorobach człowieka. DNA mafii. 20167:9.

Yu H, Zhang VW. Medycyna precyzyjna do ciągłego poszerzania fenotypu chorób genetycznych człowieka. Biomed Res Int. 20152015:745043.

Abe H, Kamimura K, Kobayashi Y, Ohtsuka M, Miura H, Ohashi R i in. Skuteczne zapobieganie zwłóknieniu wątroby przez ukierunkowane na wątrobę hydrodynamiczne dostarczanie genów metaloproteinazy 13 macierzy w szczurzym modelu zwłóknienia wątroby. Kwasy nukleinowe Mol Ther. 20165:e276.

Khosla S, Dean W, Reik W, Feil R. Kultura zarodków przedimplantacyjnych i jej długotrwały wpływ na ekspresję genów i fenotyp. Aktualizacja Hum Reprod. 20017:419–27. https://academic.oup.com/humupd/article/7/4/419/701815

Dumoulin JC, Land JA, Van Montfoort AP, Nelissen EC, Coonen E, Derhaag JG, et al. Wpływ hodowli in vitro zarodków ludzkich na masę urodzeniową noworodków. Hum Reprod 201025:605-612. https://academic.oup.com/humrep/article/25/3/605/2915683

Behringer R, Gertsenstein M, Nagy KV, Nagy A. Manipulowanie zarodkiem myszy: podręcznik laboratoryjny. 4 wyd. Prasa laboratoryjna Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor 2014.

Kageyama S, Moriyasu S, Tabata T, Chikuni K. Amplifikacja i analiza sekwencji SRY (region determinujący płeć Y) zachowanego regionu zwierząt domowych przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy. Technologia Anim Sci. 199263:1059–65.


Gryzonie (1996)

Niestety tej książki nie można wydrukować z OpenBook. Jeśli chcesz wydrukować strony z tej książki, zalecamy pobranie jej w formacie PDF.

Odwiedź NAP.edu/10766, aby uzyskać więcej informacji o tej książce, kupić ją w wersji drukowanej lub pobrać jako bezpłatny plik PDF.

Poniżej znajduje się niepoprawiony tekst tego rozdziału odczytywany maszynowo, który ma na celu zapewnienie naszym własnym wyszukiwarkom i zewnętrznym wyszukiwarkom bardzo bogatego, reprezentatywnego dla rozdziału, możliwego do przeszukiwania tekstu każdej książki. Ponieważ jest to NIEPOPRAWIONY materiał, prosimy o rozważenie poniższego tekstu jako użytecznego, ale niewystarczającego zastępstwa dla autorytatywnych stron książki.

Kryteria doboru zwierząt doświadczalnych GATUNKÓW I STABILIZACJI Wybór gatunku do badań Aby badanie naukowe miało największą szansę na uzyskanie użytecznych wyników, wszystkie aspekty protokołu eksperymentalnego powinny być starannie zaplanowane. Jeśli zostaną użyte modele zwierzęce, ważną częścią procesu jest rozważenie, czy istnieją podejścia bezzwierzęce. Jeżeli, po dokładnym rozważeniu i przejrzeniu istniejącej literatury, badacz jest przekonany, że nie ma odpowiednich alternatyw dla wykorzystania żywych zwierząt do przedmiotowego badania, następnym pytaniem, które należy zadać, jest to, jaki gatunek byłby najbardziej odpowiedni do wykorzystania . Przy wyborze gatunku do badań ważne jest rozważenie różnych czynników naukowych i operacyjnych, w tym: . U którego gatunku proces fizjologiczny, metaboliczny, behawioralny lub chorobowy, który ma być badany, jest najbardziej podobny do procesu u ludzi lub innych zwierząt, wobec których będą stosowane wyniki badań? · Czy inne gatunki posiadają cechy biologiczne lub behawioralne, które czynią je bardziej odpowiednimi do planowanych badań (np. czas generacji i dostępność? · Czy krytyczny przegląd literatury naukowej wskazuje, który gatunek dostarczył najlepszych, najbardziej odpowiednich danych historycznych? 16

KRYTERIA WYBORU ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH 17 · Czy jakiekolwiek cechy konkretnego gatunku lub szczepu, w tym cechy anatomiczne, fizjologiczne, immunologiczne lub metaboliczne, czynią go nieodpowiednim dla proponowanego badania? · W świetle metod, które mają być zastosowane w badaniu, czy jakiekolwiek cechy fizyczne lub behawioralne danego gatunku uniemożliwiłyby wymaganą manipulację fizyczną lub procedury pobierania próbek, byłyby podatne na nieprzewidywalne niepowodzenia lub byłyby trudne do zastosowania? . Czy proponowane badanie wymaga zwierząt wysoce wystandaryzowanych genetycznie lub mikrobiologicznie? Te i inne względy często prowadzą do wyboru laboratoryjnego gatunku gryzoni jako najbardziej odpowiedniego modelu dla protokołu badań biomedycznych. Gryzonie są na ogół łatwe do zdobycia i stosunkowo niedrogie w zakupie i utrzymaniu. Inne zalety gryzoni laboratoryjnych jako modeli badawczych obejmują mały rozmiar, krótki czas generacji i dostępność zwierząt zdefiniowanych mikrobiologicznie i genetycznie, historyczne dane kontrolne i dobrze udokumentowane informacje na temat gryzoni

Patologiczne i metaboliczne ,,_^,

7 procesów zgrywania. Rząd Rodentia obejmuje wiele gatunków. Najczęściej używanymi gryzoniami są myszy laboratoryjne, szczury laboratoryjne (Rattus norvegicus), świnki morskie (Cavia porcellus), chomiki syryjskie (Mesocricetus auratus) i myszoskoczki (Meriones unguiculatus). Wszystkie te gryzonie były szeroko badane w laboratorium, a informacje na ich temat można znaleźć w recenzowanej literaturze oraz w wielu tekstach (np. Altman i Katz, 1979a,b Baker i in., 1979-1980 Foster i in. in., 1981-1983 Fox i in., 1984 Gill i in., 1989 Darkness i Wagner, 1989 Van Hoosier i McPherson, 1987 Wagner i Manning, 19761. w doborze stada gryzoni Gryzonie były utrzymywane w środowisku laboratoryjnym od ponad 100 lat Niektóre, takie jak mysz, zostały bardzo dobrze scharakteryzowane genetycznie i zostały poddane manipulacji genetycznej w celu uzyskania zwierząt o jednorodnie dziedzicznych fenotypach. dobrej metody naukowej jest powtarzalność, która jest osiągana poprzez minimalizowanie i kontrolowanie zewnętrznych zmiennych, które mogą wpływać na wyniki badań. W badaniach mechanistycznych wysoce pożądana jest jednorodność genetyczna. Może być niepożądane w badaniach, które badają różnorodność 1 myszy laboratoryjne nie są ani czystym Mus domesticus, ani czystym Mus musculus, dlatego genetycy ustalili, że nie ma odpowiedniej nazwy naukowej (Międzynarodowy Komitet ds. Standaryzowanej Nomenklatury Genetycznej dla Myszy, 1994a).

18 Gryzonie: LABORATORYJNE ZARZĄDZANIE ZWIERZĄTAMI zastosowania zjawiska w szeregu fenotypów, takich jak badania rejestracyjne produktów, w tym ocena bezpieczeństwa związków o potencjale terapeutycznym. W wielu takich badaniach odpowiednie może być zróżnicowane tło genetyczne, o ile zakres zmienności można scharakteryzować i jest on do pewnego stopnia odtwarzalny (Gill, 19801. Genetycznie zdefiniowane stada Wsobne szczepy. - krycie, ale najczęstszą i najskuteczniejszą metodą ustanowienia i utrzymania wsobnego szczepu jest kojarzenie brat x siostra (tj. pełne rodzeństwo) w każdym pokoleniu. procent jednorodności genetycznej, w którym to momencie członkowie stada są izogeniczni, a stado jest uważane za szczep wsobny.Wypracowano wiele szczepów wsobnych myszy i szczurów (Festing, 1989 Festing i Greenhouse, 1992) i są one szeroko stosowane w badaniach biomedycznych Wiele z powszechnie używanych szczepów było inbredowanych od ponad 200 pokoleń.Opracowano również kilka zinbredowanych szczepów świnek morskich, chomików syryjskich i myszoskoczków (Altman i Katz, 1979b Festing, 1993 Han sen i in., 1981

. Izogeniczność członków szczepu wsobnego stanowi potężne narzędzie badawcze. Chociaż niektóre geny mogą pozostać heterogeniczne, większość procesów metabolicznych lub fizjologicznych, a także ich ekspresja fenotypowa, będzie identyczna u osobników szczepu wsobnego, eliminując w ten sposób źródło zmienności eksperymentalnej. Izogeniczność umożliwia również wymianę tkanki między osobnikami szczepu wsobnego bez odrzucenia. Hybrydy F1. Zwierzęta hybrydowe F1 to pierwsze pokolenie potomne (pokolenie F1) z krzyżówki dwóch szczepów wsobnych. Często są bardziej odporne niż zwierzęta z obu szczepów rodzicielskich, posiadając tak zwany wigor hybrydowy. Hybrydy F1 są heterozygotyczne we wszystkich loci genetycznych, w których szczepy rodzicielskie różnią się jednak, są jednakowo heterozygotyczne. Ze względu na heterogeniczność, mieszańce F1 nie będą się rozmnażać, aby je wyprodukować, należy zawsze krzyżować zwierzęta z rodzicielskich szczepów wsobnych. Mieszańce wzajemne powstają przez odwrócenie szczepów, z których pochodzi matka i ojciec. Wzajemne hybrydy męskie będą miały różnice w chromosomie Y. Wzajemne hybrydy żeńskie będą miały identyczne genotypy, ale mogą mieć różnice spowodowane odziedziczonymi skutkami matczynymi. Hybrydy F1 przyjmą tkankę z obu szczepów rodzicielskich, z wyjątkiem przypadku niezgodności z chromosomem Y (np. przeszczep skóry od samca obu szczepów rodzicielskich zostanie odrzucony przez żeńską hybrydę F1). Specjalne zapasy genetyczne. Skutki określonych genów lub regionów chromosomowych można badać za pomocą różnych hodowli lub manipulacji genami

KRYTERIA WYBORU ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH 19 metod tworzenia nowego szczepu, który różni się od oryginalnego szczepu zaledwie jednym genem. · Segregujący szczep wsobny jest szczepem wsobnym utrzymywanym przez pełne kojarzenia rodzeństwa, jednak do kojarzenia wybierane są pary męsko-żeńskie, tak aby jedna para genów pozostawała heterozygotyczna z pokolenia na pokolenie. Ta metoda kojarzenia pozwala na dobrze kontrolowane eksperymenty, ponieważ pojedyncze rodzeństwo zawiera zarówno nosicieli, jak i nienosicieli interesującego nas genu, a wszystkie zwierzęta są zasadniczo identyczne z wyjątkiem tego genu. · Szczep koizogeniczny to szczep wsobny, w którym wystąpiła i została zachowana mutacja jednogenowa; poza tym jest identyczny z niezmutowanym szczepem rodzicielskim. Jeśli mutacja nie jest szkodliwa, gdy jest homozygotyczna, szczep można utrzymać przez proste kojarzenia z pełnymi rodzeństwami. Jeśli mutacja niekorzystnie wpływa na wydajność rozmnażania, koizogenny szczep może być utrzymywany przez jeden z kilku specjalnych systemów hodowlanych (Green, 1981 NRC, 1989

. Aby uniknąć rozbieżności między podliniami między szczepem koizogennym a niezmutowanym rodzicielskim szczepem wsobnym, zaleca się okresowe krzyżowanie wsteczne (patrz następny paragraf) ze szczepem rodzicielskim. · Szczep kongeniczny jest bliskim przybliżeniem szczepu koizogenicznego. Powstaje przez skojarzenie osobnika niosącego interesujący gen, zwany genem różnicującym, z osobnikiem ze standardowego szczepu wsobnego. Potomstwo niosące gen różnicujący łączy się z innym osobnikiem tego samego szczepu wsobnego. Ten rodzaj kojarzenia, zwany krzyżowaniem wstecznym, jest kontynuowany przez co najmniej 10 pokoleń w celu wytworzenia szczepu kongenicznego. Krzyżowanie wsteczne przez 10 pokoleń minimalizuje liczbę wprowadzonych genów innych niż gen różnicujący i jego geny ściśle powiązane. Opublikowano szczegóły dotyczące rozwoju szczepów kongenicznych (Bailey, 1981 Green, 1981)

. Zarówno szczepy koizogeniczne, jak i kongeniczne mogą być utrzymywane przez kojarzenia z pełnymi rodzeństwami, jeśli gen różnicujący jest homozygotyczny, jednak aby uniknąć subliniowej rozbieżności między szczepem kongenicznym a standardowym szczepem wsobnym, zaleca się okresowe krzyżowanie wsteczne ze szczepem standardowym. . Szczep transgeniczny jest podobny do szczepu koizogennego lub kongenicznego pod tym względem, że niesie segment informacji genetycznej, która nie jest natywna dla szczepu lub osobnika (Hogan i wsp., 1986 Merlino, 1991

. Wprowadzony materiał genetyczny może pochodzić z tego samego lub innego gatunku. Zwierzęta transgeniczne opisano bardziej szczegółowo w rozdziale 8. . Rekombinowane szczepy wsobne (RI) to zestawy szczepów wsobnych wyprodukowane głównie w celu badania powiązań genetycznych. Każdy szczep RI pochodzi z krzyżówki dwóch standardowych szczepów wsobnych. Zwierzęta z pokolenia F1 są następnie krzyżowane w celu uzyskania drugiego pokolenia potomnego (pokolenie F2), którego członkowie są losowo wybierani i kojarzeni w celu uzyskania serii linii RI. Członkowie pokolenia F2 są wykorzystywani do znajdowania linii RI, ponieważ w przeciwieństwie do pokolenia F1 nie są one izogeniczne. Myszy pochodzące z dowolnej pary rodzicielskiej będą jednorodne genetycznie po zakończeniu chowu wsobnego

20 GRYZONIE: LABORATORYJNE ZARZĄDZANIE ZWIERZĄTAMI jednak każda linia w zestawie będzie homozygotyczna dla danej kombinacji alleli pochodzących z dwóch rodzicielskich szczepów wsobnych. Allele, które są połączone w szczepach rodzicielskich, mają tendencję do pozostawania razem w liniach RI, co stanowi podstawę ich zastosowania w badaniach mapowania genetycznego. · Rekombinowane szczepy kongeniczne są podobne do rekombinowanych szczepów wsobnych, z wyjątkiem tego, że każdy szczep serii został wyprowadzony z krzyżówki wstecznej zamiast z krzyżówki F2 (Demant, 1986

. Liczba krzyżówek wstecznych wykonanych przed rozpoczęciem chowu wsobnego pełnego rodzeństwa określa proporcję genów z każdego rodzicielskiego szczepu wsobnego. Serie rekombinowanych szczepów kongenicznych są szczególnie przydatne w analizie genetycznej układów wielogenowych, takich jak ten odpowiedzialny za podatność na nowotwory. Stada niezdefiniowane genetycznie Terminy niewsobne, kojarzone losowo i niewsobne są używane w odniesieniu do populacji zwierząt, w których teoretycznie nie ma jednorodności genetycznej między osobnikami. Większość gryzoni wykorzystywanych w badaniach i testach biomedycznych stanowią stada niezdefiniowane genetycznie, które są generalnie tańsze i łatwiej dostępne niż stada zdefiniowane genetycznie. Noninbred odnosi się do populacji zwierząt, w której nie ustalono żadnego celowego systemu chowu wsobnego. Losowo kojarzone odnosi się do grupy zwierząt, w której dobór zwierząt hodowlanych jest losowy. Zakłada prawie nieskończoną populację bez zewnętrznej presji selekcyjnej. W praktyce taka kolonia prawdopodobnie nie istnieje. Outbred odnosi się do kolonii, w której rozmnażanie odbywa się według celowego schematu, który minimalizuje lub eliminuje chów wsobny. Zwierzęta produkowane przez te systemy hodowlane mają zróżnicowane genotypy, a scharakteryzowanie zasięgu i rozmieszczenia fenotypów wymaga dużej próby populacji. Stopień heterozygotyczności w dowolnym niezdefiniowanym genetycznie stadie stale się zmienia, więc dwie populacje rozwinięte z tego samego stada rodzicielskiego będą wykazywać różne stopnie heterozygotyczności w dowolnym loci w dowolnym momencie. Spontaniczne mutacje mogą wystąpić i utrwalić się, ponieważ populacja nie jest narzucana celowej selekcji w celu wyeliminowania zmutowanych genów. Populacje niekrewniacze zawsze ewoluują i dlatego są bardziej zmienne niż szczepy wsobne. Z tego powodu potrzebne są duże liczby próbek, aby uwzględnić zmienność fenotypową, która może mieć wpływ na badane cechy. Jeśli wykorzystuje się zwierzęta niekrewniacze, grupy leczone i kontrolne w badaniu niekoniecznie będą identyczne, podobnie jak populacja zwierząt nie będzie koniecznie identyczna, jeśli badanie zostanie powtórzone. Zmienność genetyczna w stadach niekrewniaczych, którą można zwiększyć przez błąd w próbie, może utrudnić porównywanie wyników z różnych laboratoriów. Dane podstawowe dotyczące charakterystyki zapasów będą się zmieniać w czasie, dlatego potrzebne są równoległe kontrole, aby umożliwić użyteczną interpretację danych.

KRYTERIA WYBORU ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH STANDARYZOWANA NOMENKLATURA DLA GRYZONI 21 Standaryzowana nomenklatura umożliwia naukowcom krótkie i precyzyjne przekazywanie informacji genetycznych ich zwierząt badawczych. Za utrzymanie nomenklatur genetycznie zdefiniowanych myszy i szczurów odpowiadają: Międzynarodowy Komitet Standaryzowanej Nomenklatury Genetycznej dla Myszy oraz Międzynarodowy Komitet Nomenklatury Genetycznej Szczurów, które są afiliowane przy Międzynarodowej Radzie Nauki o Zwierzętach Laboratoryjnych. i modyfikować je w razie potrzeby. Poniższe sekcje krótko opisują nomenklaturę myszy i szczurów wsobnych, zmutowanych i niewsobnych. Pełne zasady dotyczące myszy można znaleźć w trzecim wydaniu Genetycznych wariantów i szczepów myszy laboratoryjnej (Lyon i Searle, w druku). Zasady te są regularnie aktualizowane, a aktualizacje są publikowane w Mouse Genome (dawniej Mouse News Letter Oxford University Press) i są dostępne on-line w MOD, Mouse Genome Database. Informacje na temat MOD można uzyskać w Mouse Genome Informatics Group, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 04609 (telefon, 207-288-3371 faks, 207-288-5079 Internet, [email protected]). Zasady dotyczące szczurów zostały opublikowane jako załącznik do raportu Definition, Nomenclature, and Conservation of Rat Strains (NRC, 1992a), a aktualizacje zostaną opublikowane w Rat Genome, dr Heinz W. Kunz, wydawca Departamentu of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA 15261. Badacze wykorzystujący inne laboratoryjne gryzonie powinni przestrzegać zasad dotyczących myszy lub szczurów. Szczepy wsobne Szczepy wsobne oznaczono wielkimi literami (np. szczepy myszy AKR i CBA oraz szczepy szczurów BN i LEW). Zasady myszy, ale nie szczurów, pozwalają na użycie kombinacji liter i cyfr, zaczynając od litery (np. C3H), chociaż ten typ symbolu jest uważany za mniej pożądany. Preferowane są krótkie symbole (zazwyczaj od jednej do czterech liter). Dozwolone są wyjątki dla szczepów, które są już powszechnie znane przez oznaczenia, które nie są zgodne (np. szczepy myszy I01 i 129 oraz szczepy szczurów F344 i DONRYU). Pododmiany Uznaje się, że ustalony szczep podzielił się na podszczepy, gdy wiadomo lub podejrzewa się, że różnice genetyczne utrwaliły się w oddzielnych gałęziach. Różnice te mogą wynikać albo z resztkowej heterozygotyczności w momencie rozgałęzienia, albo z nowych mutacji. Pododmiana jest oznaczona przez pełne oznaczenie szczepu rodzicielskiego, po którym następuje ukośna linia (ukośnik) i odpowiedni symbol pododmiany, w następujący sposób:

22 Gryzonie: ZARZĄDZANIE ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH · Myszy. Symbolem pododcinków może być liczba (np. DBA/1 i DBA/2

kod laboratorium, który jest zdefiniowany poniżej (np. C3H/lie, gdzie He jest kodem laboratorium Waltera E.Heston) lub, gdy jeden badacz lub laboratorium pochodzi z więcej niż jednego podszczepu, kombinację numeru i kodu laboratorium, zaczynając od numeru (np. C57BL/6J i C57BL/lOJ, gdzie J jest kodem laboratorium Jackson Laboratory , Bar Harbor, Maine). Wyjątki, takie jak małe litery, są dozwolone dla dobrze już znanych pododmian (np. BALB/c i C57BR/cd). · Szczury. Symbol podszczepu jest zawsze liczbą, gdy wykazano różnice genetyczne. Szczep założycielski jest uważany za pierwszy podszczep, a użycie /1 dla niego jest opcjonalne (np. KGH lub KGH/11. Kod laboratorium (np. Pit dla Wydziału Patologii Uniwersytetu Pittsburgha i N dla NIH Genetic Resource ) służy do oznaczenia podszczepu, gdy różnice genetyczne są prawdopodobne, ale nie zostały wykazane (np. BN/Pit i BN/N) Kody laboratoryjne Każde laboratorium lub instytucja hodująca gryzonie powinny posiadać kod laboratorium. Rejestr kodów laboratoryjnych jest prowadzony przez ILAR, National Research Council, 2101 Constitution Avenue, Washington, DC 20418 (telefon, 202-334-2590 faks, 202-334-1687 URL: http://www2.nas.edulilarhome/

. Kod laboratorium, który może być stosowany dla wszystkich gryzoni laboratoryjnych, składa się z jednej wielkiej litery rzymskiej lub początkowej wielkiej litery rzymskiej i jednej do trzech małych liter. . Myszy. Konkretną kolonię wskazuje się przez dodanie znaku „” i kodu laboratoryjnego na końcu symbolu szczepu lub podszczepu (np. [email protected], kolonia myszy szczepu SJL wyhodowana w Jackson Laboratory C3H/[email protected], Był to podszczep szczepu C3H wyhodowany w NIH Genetic Resource i CBA/[email protected], podszczep Ca szczepu CBA niosący mutację se i wyhodowany w Jackson Laboratory). Jeżeli symbol odszczepu i kod laboratorium są takie same, symbol @ i kod laboratorium można pominąć dla uproszczenia (np. SJL/[email protected] staje się SJL/J). Kod laboratorium jest zawsze ostatnim używanym symbolem i ma na celu wskazanie, że warunki środowiskowe i poprzednia historia kolonii są niepowtarzalne. Kiedy szczep jest przenoszony do nowego laboratorium, kod laboratorium macierzystego jest usuwany, a kod odbiorcy jest dołączany, kody laboratorium nie są gromadzone. . Szczury. Zwykle szczep szczura jest oznaczony nazwą szczepu, ukośnikiem, oznaczeniem podszczepu (jeśli istnieje) i kodem laboratoryjnym (np. BN/ [Pit). Kiedy szczep zostanie założony w innym laboratorium, dodawany jest nowy kod laboratorium (np. BN/lPitN). Ogólnie rzecz biorąc, więcej niż dwa kody laboratoryjne nie są kumulowane. Kody pośrednie są pomijane, aby uniknąć zbyt długich oznaczeń.

KRYTERIA WYBORU ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH 23 Zarówno w przypadku myszy, jak i szczurów, właściciel szczepu jest odpowiedzialny za prowadzenie historii szczepu. Hybrydy F1 Hybryda F1 jest oznaczona przez pełne oznaczenie szczepu rodzica żeńskiego, znak mnożenia, pełne oznaczenie szczepu rodzica męskiego oraz F1 (np. mysz hybrydowa C57BL/6J x DBA/2J F1 i szczur hybrydowy F344/NNia x BN/RijNia Rys. Jeśli istnieje ryzyko pomyłki, nazwy szczepów rodzicielskich należy umieścić w nawiasach te.g. (C57BL/6J x DBA/21)F1 i (F344/NNia x BN/RijNia)Fl] Prawidłowa nazwa formalna powinna być podana przy pierwszym wzmiance o hybrydzie w publikacji, następnie można użyć nazwy skróconej [np. C57BL/6J x DBA/2J F1 (dalej B6D2F1) i F344/ NNia x BN/RijNia F1 (zwana dalej FBNF1

. Koizogeniczne, kongeniczne i segregujące szczepy wsobne U myszy szczep koizogeniczny jest oznaczony symbolem szczepu, symbolem podszczepu (jeśli istnieje), myślnikiem i symbolem genu napisanym kursywą (np. CBA/H-kd). Gdy zmutowany lub wprowadzony gen jest utrzymywany w stanie heterozygotycznym, jest to wskazane przez włączenie ukośnika i znaku plus w symbolu (np. CBA/H-kdl+

. Szczep kongeniczny jest oznaczony pełnym lub skróconym symbolem szczepu tła, kropką, skróconym symbolem szczepu dawcy, myślnikiem oraz symbolem locus różnicowania i allelu (np. B10.129- H12b). Segregacja szczepów wsobnych jest oznaczona jako szczepy koizogeniczne, jednak wskazanie miejsca segregacji jest opcjonalne, gdy jest ono częścią standardowego genotypu szczepu (np. 129/J i 129/J-CCh/C oznaczają to samo i każdy z nich może być użytym). U szczurów szczep koizogenny (z wyjątkiem układów alloantygenowych, patrz NRC, 1992a) jest określany jako szczep koizogenny u myszy, z wyjątkiem tego, że kod laboratoryjny następuje po symbolu podszczepu, a symbol genu nie jest wyróżniony kursywą (np. RCS/SidN- rdy). Konto

enicowy szczep szczurów (z wyjątkiem alloantygenowego sys _ _

ke szczep koizogeniczny (np. LEW/N-rnu). W przypadku segregacji szczepów wsobnych powstałych w wyniku chowu wsobnego z wymuszoną heterozygozą, wskazanie miejsca segregacji jest opcjonalne. Rekombinowane szczepy wsobne (RI) Symbol szczepu RI powinien składać się ze skrótów obu symboli szczepu rodzicielskiego oddzielonych dużym X bez odstępów (np. CXB dla szczepu RI powstałego z krzyżówki BALB/c i C57BL szczepy myszy i LXB dla szczepu RI opracowanego z krzyżówki szczepów szczurów LEW i BN). Różne szczepy RI w serii należy rozróżnić numerami (np. CXB1 i CXB2 u myszy oraz LXB1 i LXB2 u szczurów).

24 Gryzonie: ZARZĄDZANIE ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH Geny Zasady nazewnictwa genów są bardzo skomplikowane, ponieważ dotyczą nie tylko zmutowanych genów, ale także kompleksów genów, wariantów biochemicznych i innych specjalnych klas genów (np. transgenów). Opis ten obejmie tylko niewielką część nomenklatury genów. Pełne zasady można znaleźć w odnośnikach podanych wcześniej. Symbole loci są krótkie i dobierane tak, aby jak najdokładniej przekazać charakterystykę, za pomocą której zwykle rozpoznawany jest gen (np. kolor sierści, efekt morfologiczny, zmiana w enzymie lub innym białku lub podobieństwo do choroby ludzkiej) . Symbole loci to zazwyczaj dwu- lub czteroliterowe skróty nazwy. W przypadku myszy symbole są pisane kursywą dla szczurów, nie są. Dla wygody w listach alfabetycznych pierwsza litera nazwy jest zwykle taka sama jak pierwsza litera symbolu. Liczby arabskie dotyczą białek, w których liczba jest częścią rozpoznawalnej nazwy lub skrótu (np. u myszy C4 i C6, czwarty i szósty składnik dopełniacza, odpowiednio u szczurów, C4 i C63. Z wyjątkiem loci odkryta z powodu mutacji recesywnej, początkowa litera symbolu locus jest wielka, a wszystkie inne małe. Łączniki są używane w symbolach genów tylko do oddzielenia znaków, które razem mogą być mylące. Zasada ta została przyjęta dla myszy w 1993 roku, i myślniki należy usunąć ze wszystkich symboli genów, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest to konieczne, aby uniknąć pomyłek.Oznaczenia genów są dołączone do oznaczenia szczepu rodzicielskiego i są oddzielone myślnikiem.Loci, które są członkami locus serii A, które należy do serii, której członkowie określają podobne białka lub inne cechy, są oznaczone tym samym symbolem literowym i numerem wyróżniającym (np. Esl, Es2 i Es3 u myszy oraz Esl, Es2 i Es3 u szczurów). loci morfologiczne lub „widoczne” o podobnych skutkach (np. geny powodujące łysienie”, nadane są odrębne nazwy, ponieważ działania genów i produkty genów mogą ostatecznie okazać się różne (np. hr i nu u myszy oraz fz i mu u szczurów). Allele Allel jest oznaczony symbolem miejsca z dodanym indeksem górnym. W przypadku myszy indeks górny jest pisany kursywą dla szczurów, tak nie jest. Indeks górny allelu to zazwyczaj jedna lub dwie małe litery, które przekazują dodatkowe informacje o allelu. W przypadku zmutowanych genów nie stosuje się indeksu górnego dla pierwszego odkrytego allelu. Gdy zostaną znalezione dalsze allele, pierwszy jest nadal oznaczany bez indeksu górnego (np. nu dla nude i nuStr dla streaker w

KRYTERIA WYBORU ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH - 25 myszy i fa dla tłustych i faCP dla tłustych u szczurów). Jeśli informacja jest zbyt złożona, aby można ją było wygodnie przekazać w symbolu, allelowi podaje się indeks górny (np. Esla i Eslb u myszy oraz Esla i Eslb u szczurów), a informacja jest przekazywana w inny sposób. Nieodróżnialne allele o niezależnym pochodzeniu (np. nawroty) są oznaczone symbolem genu z symbolem serii, składającym się z liczby arabskiej odpowiadającej numerowi seryjnemu powtarzającego się allelu oraz kodu laboratoryjnego, dołączonego jako indeks górny kursywą. Aby uniknąć pomylenia liczby „1” i małej litery „1”, pierwszy odkryty allel nie jest numerowany, a drugi powtarzający się allel ma numer 2 (np. bg, beżowy bgJ, nawrót mutacji myszy bg w Jackson Laboratory i bg27, drugi nawrót mutacji bg w Jackson Laboratory). Mutacja lub inna odmiana występująca w znanym allelu (z wyjątkiem układów alloantygenowych u szczura) jest oznaczona indeksem górnym m i odpowiednim symbolem serii, który składa się z liczby odpowiadającej numerowi seryjnemu zmutowanego allelu w laboratorium pochodzenie plus kod laboratorium. Symbol jest oddzielony od oryginalnego symbolu allelu myślnikiem (np. Mupla-m7

dla pierwszego zmutowanego allelu myszy Mupla znalezionego przez Jackson Laboratory). W przypadku znanego usunięcia całości lub części allelu, indeks górny m można zastąpić indeksem górnym dl. Ta nomenklatura jest używana do nazywania mutacji docelowych (często nazywanych mutacjami „knockout”), a także mutacji występujących spontanicznie. 7 _ Nomenklatura transgenów dla transgenów została opracowana przez Komitet ILAR ds. Nomenklatury Transgenicznej (NRC, 1992b). Symbol transgenu składa się z trzech części, wszystkie są typu reman, jak następuje: TgX(YYYYYY)#####Zzz, gdzie TgX to tryb, (YYYYYY) to oznaczenie wstawki, a #####Zzz reprezentuje numer przypisany do laboratorium (#####) i kod laboratorium (Zzz). Tryb oznacza transgen i zawsze składa się z liter Tg (od "transgen") i litery oznaczającej tryb insercji DNA: N dla rekombinacji niehomologicznej, R dla insercji przez zakażenie wektorem retrowirusowym i H dla rekombinacji homologicznej. Celem tego oznaczenia jest identyfikacja go jako symbolu transgenu i rozróżnienie między trzema zasadniczo różnymi organizacjami wprowadzonej sekwencji w stosunku do genomu gospodarza. Gdy docelowa mutacja wprowadzona przez rekombinację homologiczną nie obejmuje wstawienia nowej sekwencji funkcjonalnej, nowy zmutowany allel (mutacja knockout) jest wyznaczany zgodnie z wytycznymi dla nomenklatury genów dla każdego gatunku. Nomenklatura genów jest również stosowana, gdy proces homolo

26 Gryzonie: ZARZĄDZANIE LABORATORIUM ZWIERZĄT Dobra rekombinacja skutkuje integracją nowej sekwencji funkcjonalnej, jeśli ta sekwencja jest funkcjonalnym genem lekooporności. Na przykład Mbpm

Dn będzie używane do oznaczenia pierwszej ukierunkowanej mutacji podstawowego białka mieliny (Mbp) u myszy wykonanej przez Muriel T. Davisson (Dn). W tym przykładzie insercja transgeniczna, nawet jeśli zawiera funkcjonalny gen oporności na neomycynę, jest przypadkowa dla „wybicia” lub mutacji docelowego locus (patrz także International Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice, 1994b). Oznaczenie wstawki jest symbolem istotnych cech transgenu, określonych przez badacza. Jest zawsze w nawiasach i składa się z nie więcej niż ośmiu znaków: liter (wielkich lub wielkich i małych liter) lub kombinacji liter i cyfr. Nie należy używać kursywy, indeksów górnych, dolnych, spacji wewnętrznych i interpunkcji. Preferowane są krótkie symbole (sześć lub mniej znaków). Całkowita liczba znaków w oznaczeniu wkładki plus numer nadany przez laboratorium nie może przekroczyć 11 (patrz niżej), dlatego w przypadku użycia siedmiu lub ośmiu znaków liczba cyfr w numerze nadanym laboratorium będzie ograniczona do czterech lub trzech , odpowiednio. Trzecia część symbolu to kombinacja cyfr i liter, która jednoznacznie identyfikuje każdą niezależnie wstawioną sekwencję. Składa się z dwóch składników. Numer nadawany przez laboratorium jest unikalnym numerem nadawanym przez laboratorium każdej stabilnie przeniesionej wstawce po potwierdzeniu transmisji do linii zarodkowej. Można użyć do pięciu znaków (liczby do 99 999), jednak łączna liczba znaków w oznaczeniu wkładki plus numer nadany przez laboratorium nie może przekroczyć 11. Żadne dwa wiersze generowane w ramach jednego laboratorium nie powinny mieć tego samego przypisanego numeru . Niepowtarzalne numery powinny być nadane nawet oddzielnym wierszom z tą samą wkładką zintegrowaną w różnych pozycjach. Liczba może mieć znaczenie wewnątrzlaboratoryjne lub po prostu być liczbą w serii transgenów wyprodukowanych w laboratorium. Drugi składnik to kod laboratoryjny. Zatem pełne oznaczenie identyfikuje wstawione miejsce, dostarcza symbol dla ułatwienia komunikacji i dostarcza unikalny identyfikator, aby odróżnić je od wszystkich innych wstawek [np. C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg dla ludzkiego CD8 klon genomowy wstawiony do myszy C57BL/6 z Laboratorium Jacksona (J' i 23. mysz przebadana w serii mikroiniekcji wykonanych w laboratorium Jona W. Gordona (Jwg)

. Opublikowano pełne zasady nazewnictwa transgenów (NRC, 1992b). TBASE, baza danych opracowana w Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee, jako rejestr szczepów transgenicznych, jest utrzymywana na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa w Baltimore w stanie Maryland. Informacje na temat TBASE można uzyskać w Genome Database and Applied Research Laboratory, The Johns Hopkins University, 2024 East Monument Street, Baltimore, MD 21205 (telefon, 410-955-1704 fax, 410-614-04341.

KRYTERIA WYBORU ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH Stado niekrewniacze 27 Oznaczenie stada niekrewniaczego składa się z kodu laboratoryjnego, dwukropka i symbolu stada, który składa się z dwóch do czterech wielkich liter (np. potomstwo myszy Crl:ICR i potomstwo szczurów Hsd:LE). Symbol 'stock nie może być taki sam, jak w przypadku szczepu wsobnego tego samego gatunku. W drodze wyjątku, stado pochodzące z krzyżowania wcześniej wsobnego szczepu może nadal używać oryginalnego symbolu w tym przypadku, kod laboratoryjny poprzedzający symbol stada charakteryzuje stado jako niekrewniacze. Rasa niekrewniacza zawierająca określoną mutację jest oznaczona kodem laboratoryjnym, dwukropkiem, symbolem stada, łącznikiem i symbolem genu (np. Crl:ZUC-fa). Transfer stada niekrewniaczej między hodowcami jest wskazywany przez podanie kodu laboratoryjnego nowego posiadacza, a następnie kodu laboratoryjnego posiadacza, z którego uzyskano stado (np. HsdBlu:LE dla szczurów uzyskanych przez Harlan Sprague Dawley z Blue Spruce Farmy). Aby uniknąć zbyt długich oznaczeń, należy stosować tylko dwa kody laboratoryjne. JAKOŚĆ Przy wyborze gryzoni do wykorzystania w badaniach biomedycznych należy zwrócić uwagę na jakość zwierząt. Jakość najczęściej charakteryzuje się stanem mikrobiologicznym oraz systemami stosowanymi w hodowli zwierząt, zapewniającymi utrzymanie określonego stanu mikrobiologicznego. Jednak genetyka zwierzęcia, a także monitoring genetyczny i programy hodowlane stosowane w celu zapewnienia spójności genetycznej, oczywiście odgrywają również ważną rolę w określaniu jakości gryzoni. Jakość mikrobiologiczna Gryzonie mogą być zakażone różnymi przypadkowymi organizmami chorobotwórczymi i oportunistycznymi, które w odpowiednich okolicznościach mogą wpływać na wyniki badań na poziomie komórkowym lub subkomórkowym. Niektóre z tych czynników mogą utrzymywać się u zwierząt przez całe ich życie, inne powodują przemijające infekcje i są eliminowane ze zwierząt, pozostawiając trwałe miana serologiczne jako jedyne „wskaźniki obecności tych organizmów”. Rodzaje organizmów, które mogą infekować gryzonie, obejmują bakterie, pierwotniaki, drożdże, grzyby, wirusy, riketsje, mykoplazmy i takie czynniki niebakteryjne, jak robaki i stawonogi. Wiele pospolitych organizmów, które zarażają gryzonie laboratoryjne, zostało obszernie przebadanych, a niektóre ich interakcje badawcze zostały scharakteryzowane (przegląd patrz Bhatt i in., 1986NRC, 1991). Niestety informacje o działaniu wielu innych organizmów są niepełne lub niedostępne. Nie ma ogólnej zgody co do znaczenia

28 GRYZONIE: ZARZĄDZANIE ZWIERZĄT LABORATORYJNYCH wiele organizmów, które latentnie infekują gryzonie, zwłaszcza organizmy oportunistyczne, które powodują choroby lub zmieniają wyniki badań tylko w ściśle określonych warunkach, a nawet wtedy zwykle dotykają tylko bardzo małej części populacji. Każda decyzja dotycząca jakości gryzoni, które mają być wybrane do konkretnego projektu badawczego, powinna zawierać realistyczną ocenę organizmów, które z uzasadnionym prawdopodobieństwem, określonym na podstawie dokumentacji w recenzowanej literaturze, wywołają mylące skutki w proponowanym badaniu. . Powszechnie przyjmuje się, że zwierzęta, w przypadku których przeprowadzono najszerszy monitoring zdrowia i wobec których zastosowano najbardziej rygorystyczne techniki wykluczania drobnoustrojów, są najbardziej odpowiednie do wykorzystania we wszystkich badaniach. Jednak zarówno ze względów naukowych, jak i praktycznych założenie to nie zawsze jest słuszne. Gryzonie, które są wolne od wszelkich mikroorganizmów (gryzonie toporne, patrz definicja poniżej) lub gryzonie toporne, które zostały celowo zaszczepione kilkoma rodzajami niepatogennych mikroorganizmów (gryzonie powiązane mikrobiologicznie) mogą mieć zmienione procesy fizjologiczne i metaboliczne, które czynią je nieodpowiednimi modele dla niektórych badań. Mogą również szybko zostać skażone powszechnymi drobnoustrojami, chyba że są utrzymywane przy użyciu specjalistycznych środków utrzymania i hodowli, które są drogie i mogą zawieść. Dostępność komercyjna takich gryzoni jest ograniczona i są one droższe niż gryzonie, których obciążenie mikrobiologiczne nie jest tak ograniczone. Z tych powodów gryzonie najczęściej używane w badaniach to te, które są wolne od kilku specyficznych gryzoni patogennych i niektórych innych mikroorganizmów, o których dobrze wiadomo, że mają mylący wpływ na określone rodzaje badań. Jakość zwierząt laboratoryjnych jest ogólnie związana z metodami wykluczenia mikrobiologicznego stosowanymi do ich hodowli i utrzymania. Istnieją trzy główne rodzaje utrzymania: zwierzęta utrzymywane w izolatorze, utrzymywane przez barierę oraz zwierzęta bez izolacji lub utrzymywane w sposób konwencjonalny. Izolator to sterylizowalna komora, która jest zwykle zbudowana z metalu, sztywnego plastiku, winylu lub poliuretanu. Zwykle ma dopływ sterylnego powietrza, mechanizm do wprowadzania wysterylizowanych materiałów oraz serię wbudowanych rękawiczek, które umożliwiają manipulację trzymanymi w nim zwierzętami. Wszystkie materiały przeniesione do izolatora są sterylizowane, a zwierzęta hodowane w izolatorze są na ogół wolne od zanieczyszczenia przez wszystkie lub określone drobnoustroje. Zwierzęta utrzymywane przez barierę są hodowane i trzymane w wydzielonej przestrzeni, zwanej barierą. W przypadku obiektów barierowych personel wchodzi przez szereg zamków i zwykle musi się rozebrać, wziąć prysznic i używać czystej, zdezynfekowanej odzieży. Wszystkie powierzchnie ciała, które potencjalnie będą miały kontakt ze zwierzętami, są zakryte.Cały sprzęt, zapasy i klimatyzowane powietrze dostarczane do obiektu zaporowego są sterylizowane lub dezynfekowane. Pomieszczenia szlabanów mogą mieć dowolny rozmiar i mogą składać się z jednego lub więcej pomieszczeń. Mają one na celu wykluczenie organizmów, dla których gryzonie są głównymi lub preferowanymi żywicielami, ale generalnie nie wykluczają organizmów, których żywicielami są ludzie.

KRYTERIA WYBORU ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH 29 Utrzymanie bariery można również przeprowadzić na poziomie klatki lub stojaka za pomocą sprzętu, który można wysterylizować lub w inny sposób zdezynfekować. Ten rodzaj konserwacji w dużej mierze zależy od dostarczania dużych ilości przefiltrowanego lub wysterylizowanego powietrza do klatek dla zwierząt. Takie systemy mogą być z powodzeniem stosowane do utrzymania zwierząt o ściśle określonym stanie mikrobiologicznym. Powodzenie takich systemów zależy od zastosowanych technik i jest trudne do monitorowania, ponieważ stan mikrobiologiczny może różnić się w zależności od klatki. Zwierzęta nie są przetrzymywane lub utrzymywane w sposób konwencjonalny, są hodowane na obszarach, które nie mają specjalnych przeszkód dla wprowadzania mikroorganizmów. Taki sposób utrzymywania zwierząt nie może zapewnić stabilności stanu mikrobiologicznego, ponieważ w każdej chwili mogą zostać wprowadzone niepożądane organizmy. Opracowano kilka klasyfikacji w celu określenia jakości mikrobiologicznej zwierząt laboratoryjnych, jak następuje (patrz także NRC, 1991).

: · Axenic odnosi się do zwierząt pochodzących z cięcia cesarskiego lub embriotransferu, hodowanych i utrzymywanych w izolatorze z zastosowaniem aseptycznych technik. Oznacza to, że zwierzęta są wyraźnie wolne od powiązanych form życia, w tym wirusów, bakterii, grzybów, pierwotniaków i innych organizmów saprofitycznych lub pasożytniczych. Zwierzęta tej jakości wymagają największej

. intensywne i częste monitorowanie ich stanu mikrobiologicznego i są najtrudniejsze do uzyskania i utrzymania. . Mikrobiologicznie powiązana, zdefiniowana flora lub gnotobiotyk odnosi się do zwierząt tojadowych, które zostały celowo zaszczepione dobrze zdefiniowaną mieszaniną mikroorganizmów i utrzymywane w sposób ciągły w izolatorze, aby zapobiec skażeniu innymi czynnikami. Na ogół w inokulum stosuje się niewielką liczbę (zwykle mniej niż 15) gatunków drobnoustrojów i sugeruje się, że organizmy te są niepatogenne. · Wolne od patogenów oznacza, że ​​zwierzęta są wolne od wszystkich widocznych patogenów. Jest często nadużywany, ponieważ nie ma ogólnej zgody co do tego, które czynniki są patogenami, jakie testy należy zastosować, aby wykazać brak patogenów iz jaką częstotliwością oraz w jaki sposób należy pobierać próbki z populacji. Należy unikać używania tego terminu ze względu na brak precyzji jego znaczenia. . Wolny od swoistych patogenów (małpa) Stosuje się u zwierząt, które nie wykazują żadnych dowodów (zazwyczaj serologicznych, kulturowych lub histopatologicznych) obecności określonych drobnoustrojów. W najściślejszym znaczeniu termin ten powinien odnosić się do określonego zestawu organizmów i określonego zestawu testów lub metod stosowanych do ich wykrywania. Zwierzę można sklasyfikować jako SPF, jeśli jest wolne od jednego lub wielu patogenów. . Konwencjonalny stosuje się u zwierząt, u których obciążenie mikrobiologiczne jest nieznane, niekontrolowane lub jedno i drugie. Ponadto, termin „czysta konwencjonalna” jest czasami używany do opisania zwierząt, które są trzymane w barierze o niskim poziomie bezpieczeństwa i wykazują, że są wolne od wybranych patogenów. Termin ten jest jeszcze mniej precyzyjny niż „wolny od patogenów” i odradza się jego stosowanie (NRC, 1991

30 GRYZONIE: LABORATORYJNE ZARZĄDZANIE ZWIERZĄTAMI Komercyjni dostawcy ukuli różne terminy wskazujące na status SPF. Wszystkie terminy odnoszą się do określonych organizmów, od których zwierzęta są uznane za wolne i pod kątem których są regularnie monitorowane. W niektórych przypadkach terminy (np. wolne od wirusów przeciwciał i wolne od mysich patogenów) sugerują jakość zwierząt wykraczającą poza rzeczywiste definicje terminów. Na przykład zwierzęta wolne od przeciwciał to zwierzęta, które są wolne od przeciwciał przeciwko określonym wirusom gryzoni. Termin ten jest odmianą SPF, ponieważ odnosi się do określonych wirusów. Sugerowaną metodą wykrywania jest serologia. Zwierzęta mogą nie być wolne od wirusów innych niż określone i mogą nie być wolne od innych. . mikroorganizmy. Jakość genetyczna Pomimo starannych praktyk utrzymania, które są wymagane w każdej kolonii hodowlanej w celu prawidłowej identyfikacji zwierząt i bezpiecznego trzymania ich, ludzie mogą popełniać błędy. Ponadto zwierzęta luźne, w tym zwierzęta, które niepostrzeżenie uciekają ze swoich domów oraz dzikie gryzonie, mogą wchodzić do klatek, kojarzyć się z mieszkańcami i wydawać genetycznie skażone potomstwo. Dobre praktyki hodowlane prowadzone przez przeszkolony personel, w tym prowadzenie rodowodu i jednoznaczne identyfikowanie zwierząt i klatek, mogą pomóc w ograniczeniu występowania takich zdarzeń. Niemniej jednak, aby uniknąć niszczycielskich konsekwencji skażenia genetycznego, dobry program monitoringu genetycznego jest uzasadniony. Monitoring genetyczny obejmuje dowolną metodę stosowaną w celu zapewnienia, że ​​integralność genetyczna osobników danego szczepu nie została naruszona. Kilka źródeł komercyjnych zapewnia usługi monitorowania genetycznego szczepów myszy i szczurów wsobnych. Personel powinien być wyczulony na zmiany fenotypowe u zwierząt, takie jak nieoczekiwane kolory sierści lub duże zmiany w wydajności reprodukcyjnej. W kolonii podstawowej z kontrolą rodowodową (patrz rozdział 4) ważne jest monitorowanie stada hodowlanego co najmniej raz na dwa pokolenia, aby można było szybko wykryć pojedyncze błędne krycie. Można przetestować emerytowanych hodowców lub część ich potomstwa. W koloniach hodowlanych lub produkcyjnych, w których tak dokładne monitorowanie może nie być opłacalne lub praktyczne, zaleca się pobieranie próbek. Zakres takiego pobierania próbek może być tak szeroki, jak pozwalają na to zasoby i potrzeba. Jeśli skażenie genetyczne wystąpi poza kolonią podstawową, skażenie zostanie ostatecznie usunięte przez infuzję hodowców z bardziej rygorystycznie kontrolowanej kolonii podstawowej. Zakres niezbędnych badań zależy od liczby i genotypów sąsiednich szczepów. System testowy powinien być w stanie zidentyfikować szczep, do którego należy dana osoba, i odróżnić go od innych szczepów utrzymywanych w pobliżu. Większość szczepów można zidentyfikować za pomocą małego zestawu dowolnych markerów genetycznych, dla których dostępny jest test. Nowsze metody typowania DNA, które wykorzystują sondy multilocus, markery minisatelitarne i „DNA-fin”

KRYTERIA WYBORU ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH 31 Analiza gerprintingu jest potężnym narzędziem do rozróżniania szczepów, szczególnie szczepów, które są blisko spokrewnione, ale metody elektroforetyczne, w których typowane są izoenzymy, są ogólnie bardziej opłacalne w monitorowaniu genetycznym (Hedrich, 1990 Nomura i wsp., 1984). , ponieważ takie monitorowanie jest najczęściej przeprowadzane w celu wykrycia błędnych skojarzeń. Stosowane są również metody immunologiczne, a wymiana przeszczepów skórnych między osobnikami szczepu jest szczególnie skuteczną metodą badania przesiewowego dużej liczby loci w pojedynczym teście. DNA od - reprezentatywnych hodowców ot a stra

n mogą być przechowywane do wykorzystania w przyszłości w identyfikacji podejrzanych zanieczyszczeń genetycznych. Monitoring genetyczny stosowany jest pierwotnie do weryfikacji autentyczności danego szczepu, rzadko w ten sposób wykrywane są nowe mutacje. Nie jest możliwe monitorowanie wszystkich loci pod kątem nowych mutacji, biorąc pod uwagę dużą liczbę nieznanych loci i znanych loci, które nie wytwarzają widocznego fenotypu. Dobry program zarządzania hodowlą, opisany w rozdziale 4, pomoże zredukować niepożądane zmiany genetyczne spowodowane mutacjami. WYBRANE ASPEKTY PROJEKTOWANIA EKSPERYMENTU Eksperyment, w którym wykorzystywane są zwierzęta laboratoryjne, powinien być zaprojektowany z rozwagą, tak aby dostarczał jednoznacznych informacji na temat pytań, na które zostało zaprojektowane. W związku z tym dwa najważniejsze wymagania prawidłowego projektowania eksperymentów są następujące: . Zwierzęta w różnych grupach powinny różnić się jedynie traktowaniem, które ma oceniać doświadczenie, tak aby wynik eksperymentu nie był mylony z różnicami w składzie grup lub w sposobie ich traktowania lub pomiaru. · Każde leczenie powinno być podane wystarczającej liczbie zwierząt, aby wynik eksperymentu można było z pewnością przypisać różnicom w leczeniu, a nie tylko przypadkowi. Najlepszym sposobem zapewnienia porównywalności grup zwierząt doświadczalnych jest pobranie ich z jednej jednorodnej puli i losowe przydzielenie do grup badanych. Wybieranie zwierząt w tym samym wieku, tej samej płci i tego samego szczepu wsobnego dla wszystkich badanych grup, a nawet przypisywanie losowo miotów do różnych grup leczenia, może wyeliminować czynniki, które mogą częściowo wyjaśniać różnice między grupami w wynikach eksperymentów. po przydzieleniu zwierząt do grup należy postępować w identyczny sposób, z wyjątkiem różnic w traktowaniu, które mają być ocenione w doświadczeniu. Pokarm, woda, ściółka i inne cechy hodowli zwierząt powinny być takie same. W przypadku eksperymentów długoterminowych klatki należy obracać, aby zminimalizować różnice między grupami spowodowane położeniem klatki. W przypadku inwazyjnego leczenia eksperymentalnego, zabiegi pozorowane lub placebo należy przeprowadzić w porównaniu

32 GRYZONIE: LABORATORYJNE ZARZĄDZANIE ZWIERZĄTAMI na przykład, zwierzęta leczone przez zgłębnik powinny być porównywane z kontrolami, którym podano nośnik przez Savage, zwierzęta leczone chirurgicznie powinny być porównywane ze zwierzętami poddanymi pozorowanym operacjom chirurgicznym i zwierzętami poddanymi leczeniu przez inhalację należy porównać ze zwierzętami umieszczonymi w komorach inhalacyjnych, w których krąży tylko powietrze. Przestrzeganie tych środków ostrożności zapewni, że różnice w wynikach między grupami można przypisać samemu leczeniu eksperymentalnemu, a nie dodatkowym różnicom związanym z podawaniem leczenia. Wreszcie, gdzie tylko jest to możliwe, wynik zainteresowania powinien być mierzony przez osoby, które nie są świadome, jakie leczenie otrzymało każde zwierzę, ponieważ taka wiedza może powiększać lub nawet tworzyć zaobserwowane różnice w leczeniu. Szczególnie ważne jest przeprowadzanie „ślepych” badań, gdy wynik ma być oceniany subiektywnie (np. przez stopniowanie ciężkości chorobyJ, a nie mierzony ilościowo (np. przez pomiar stężeń składników surowicy). grupa będzie zależeć od wielu cech projektu eksperymentalnego, w tym następujących: ... cele badania · podstawowa miara wyniku, która będzie porównywana liczba grup, które będą porównywane · oczekiwana liczba niepowodzeń technicznych lub użytecznych punktów końcowych liczba i rodzaj porównań, które zostaną wykonane · oczekiwana zmienność wyników między zwierzętami i pomiarami · projekt statystyczny i analiza, które zostaną użyte · wielkość różnic między grupą kontrolną i leczoną, które są pożądane wykryć · przewidywane straty i · maksymalną dopuszczalną szansę na wyciągnięcie błędnych wniosków Im bardziej zmienna jest miara wyniku, albo dlatego, że o Wyniki u identycznie leczonych zwierząt różnią się znacznie lub ze względu na wysoki stopień zmienności pomiarów, im więcej zwierząt będzie potrzebnych w każdej grupie, aby odróżnić różnice między grupami spowodowane leczeniem a przypadkami. W jaki sposób zmienność wyników pomiaru, wykryta różnica w leczeniu i tolerowana szansa na wyciągnięcie błędnego wniosku wpływają na wymaganą wielkość próby, zależy od pomiaru, który ma zostać wykonany oraz rodzaju porównania grup, które należy wykonać. oraz statystyczny ,

analiza, która ma być zastosowana. Opublikowano tabele i wzory do porównywania proporcji między dwiema lub większą liczbą grup (Gart i in., 1986), a także przydatne informacje dla innych typów wyników (Mann i in., 1991J. W przypadku większości eksperymentów wysoce pożądana jest współpraca ze statystykem przez cały czas, począwszy od etapu projektowania, tak aby odpowiednio zdefiniowane grupy o wystarczającej liczebności były dostępne dla właściwej analizy statystycznej.


Informacje o autorze

Autorzy ci w równym stopniu przyczynili się do tego: Thomas Naert i Dieter Tulkens.

Afiliacje

Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Technologiepark 71, 9052, Ghent (Zwijnaarde), Belgia

Thomas Naert, Dieter Tulkens, Marjolein Carron, Suzan Demuynck i Kris Vleminckx

Instytut Badań nad Rakiem Gandawa, Gandawa, Belgia

Thomas Naert, Dieter Tulkens, Suzan Demuynck i Kris Vleminckx

Wydział Biologii Rozwojowej, Instytut Perinatalny i Centrum Medycyny Komórek Macierzystych i Organoidów (CuSTOM), Szpital Dziecięcy w Cincinnati, Cincinnati, USA

Nicole A. Edwards i Aaron M. Zorn

Centrum Genetyki Medycznej, Wydział Medycyny Biomolekularnej, Uniwersytet w Gandawie, Gandawa, Belgia

Marjolein Carron, Annekatrien Boel, Paul Coucke, Andy Willaert i Kris Vleminckx

National Xenopus Resource i Eugene Bell Center for Regenerative Biology and Tissue Engineering, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, 02543, USA



Uwagi:

  1. Zulkik

    Całkowicie się z nią zgadzam. Myślę, że to dobry pomysł.

  2. Judd

    fraza Brilliant i jest na czasie

  3. Delbert

    Godzina po godzinie nie jest łatwiejsza.

  4. Athemar

    Apparently not destiny.

  5. Upton

    Mówisz poważnie?

  6. Husam

    must be sure to check it out **)



Napisać wiadomość