Informacja

8.3: Elektroforeza - Biologia

8.3: Elektroforeza - Biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Elektroforeza wykorzystuje pole elektryczne przyłożone do matrycy żelowej, aby oddzielić duże cząsteczki, takie jak DNA, RNA i białka, według ładunku i wielkości. Próbki są ładowane do dołków matrycy żelowej, która może rozdzielać cząsteczki według wielkości, a na żel przykładane jest pole elektryczne. To pole powoduje, że ujemnie naładowane cząsteczki poruszają się w kierunku elektrody dodatniej. Sama matryca żelowa działa jak sito, przez które szybko przechodzą najmniejsze cząsteczki, podczas gdy dłuższe cząsteczki poruszają się wolniej.

W przypadku DNA i RNA sortowanie cząsteczek według wielkości w ten sposób jest trywialne ze względu na jednolity ładunek ujemny na szkielecie fosforanowym. W przypadku białek, które różnią się ładunkiem, należy zastosować sprytną sztuczkę, aby naśladować kwasy nukleinowe - patrz elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (STRONA) poniżej. Różne rodzaje żeli mają różną wielkość porów. Podobnie jak sita z drobniejszymi lub grubszymi oczkami, niektóre żele lepiej radzą sobie z oddzielaniem mniejszych cząsteczek, podczas gdy inne działają lepiej w przypadku większych. Elektroforeza żelowa może być stosowana jako technika preparatywna (czyli przy oczyszczaniu białek lub kwasów nukleinowych), ale najczęściej jest wykorzystywana jako narzędzie analityczne.

Elektroforeza w żelu agarozowym

Elektroforeza w żelu agarozowym to technika stosowana do rozdzielania kwasów nukleinowych głównie według wielkości. Agaroza jest polisacharydem otrzymywanym z wodorostów (ryc. 8.11). Można go rozpuścić we wrzącym buforze i przelać na tacę, gdzie ostygnie (rysunek 8.12), tworząc płytkę. Żele agarozowe wylewa się z założonym grzebieniem, aby zrobić dołki, w których umieszcza się próbki DNA lub RNA po zestaleniu się żelu. Żel zanurza się w buforze i na płytkę przykłada się prąd. Dwuniciowy DNA ma jednolity ładunek ujemny, który jest niezależny od składu sekwencji cząsteczki. Dlatego, jeśli fragmenty DNA zostaną umieszczone w polu elektrycznym, będą migrować od katody (-) w kierunku anody (+). Szybkość migracji jest bezpośrednio zależna od zdolności każdej cząsteczki DNA do robactwa lub poruszania się przez żel przesiewający. Matryca agarozowa zapewnia otwory, przez które mogą się poruszać makrocząsteczki. Najtrudniej poruszają się po żelu największe makrocząsteczki, podczas gdy najmniejsze makrocząsteczki prześlizgują się przez niego najszybciej.


Rysunek 8.11 - Struktura polisacharydu agarozowego. Wikipedia

Ponieważ elektroforeza wykorzystuje prąd elektryczny jako siłę do napędzania cząsteczek przez matrycę, oddzielane cząsteczki muszą być naładowane. Ponieważ stosunek wielkości do ładunku dla DNA i RNA jest stały dla wszystkich rozmiarów tych kwasów nukleinowych, cząsteczki po prostu sortują na podstawie ich wielkości – najmniejszy ruch jest najszybszy, a największy najwolniejszy.

Wszystkie fragmenty o danej wielkości będą migrować po żelu na tę samą odległość, tworząc na żelu tzw. „pasma”. Wizualizacja fragmentów DNA w żelu jest możliwa dzięki dodaniu barwnika, takiego jak bromek etydyny, który interkaluje między zasadami i fluorescencją podczas oglądania w świetle ultrafioletowym (rysunek 8.13). możliwe jest określenie wielkości fragmentów DNA w próbce. Warto zauważyć, że zgodnie z konwencją fragmenty DNA nie są opisywane przez ich masy cząsteczkowe (w przeciwieństwie do białek), ale przez ich długość w parach zasad (pz) lub kilozasadach (kb).


Figura 8.13 - Prążki DNA uwidocznione za pomocą barwienia bromkiem etydyny. Wikipedia

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (STRONA)

Podobnie jak DNA i RNA, białka są dużymi makrocząsteczkami, ale w przeciwieństwie do kwasów nukleinowych, białka niekoniecznie są naładowane ujemnie. Ładunek każdego białka zależy od jego unikalnej sekwencji aminokwasowej. W związku z tym białka w mieszaninie niekoniecznie przesuną się w kierunku anody.

Dodatkowo, podczas gdy dwuniciowy DNA ma kształt pręcika, większość białek jest kulista (pofałdowana). Ponadto białka są znacznie mniejsze niż kwasy nukleinowe, więc otwory w matrycy żelu agarozowego są po prostu zbyt duże, aby skutecznie zapewnić separację. W konsekwencji niezmienione (natywne) białka nie są zbyt dobrymi perspektywami dla elektroforezy na żelach agarozowych. Aby oddzielić białka masowo za pomocą elektroforezy, należy dokonać kilku modyfikacji.

Matryca żelowa

Najpierw stosuje się matrycę wytworzoną przez polimeryzację i sieciowanie jednostek akryloamidowych. Monomeryczny akrylamid (rysunek 8.14) jest polimeryzowany, a polimery są sieciowane za pomocą N,N’-metyleno-bisakryloamidu (rysunek 8.15) w celu utworzenia struktury przypominającej siatkę. Wielkość otworów matrycy/siatki można łatwo regulować, zmieniając zawartość procentową akryloamidu w reakcji. Wyższe zawartości procentowe akryloamidu dają mniejsze otwory i są bardziej skuteczne w rozdzielaniu mniejszych cząsteczek, podczas gdy niższe zawartości procentowe akryloamidu są stosowane do rozdzielania mieszanin większych cząsteczek. (Uwaga: żele poliakrylamidowe są również używane do oddzielania małych fragmentów kwasu nukleinowego, przy czym niektóre żele akrylamidowe są zdolne do oddzielania fragmentów DNA różniących się długością tylko o jeden nukleotyd.)


Rysunek 8.15 - N,N’-Metylenobisakrylamid - odczynnik sieciujący akrylamid. Wikipedia

Zmiana opłaty przez SDS

Drugą kwestią jest to, że białka muszą być fizycznie zmienione, aby „prezentowały się” w matrycy jak ujemnie naładowane pałeczki DNA. Odbywa się to poprzez traktowanie białek detergentem anionowym, SDS (dodecylosiarczan sodu). SDS denaturuje białka, dzięki czemu przybierają kształt podobny do pręcika, a cząsteczki SDS pokrywają białka w taki sposób, że zewnętrzna powierzchnia jest obciążona ładunkami ujemnymi, maskując oryginalne ładunki na białkach i sprawiając, że ładunek na białkach jest bardziej proporcjonalny do ich masy, jak kręgosłup DNA.

Ponieważ białka zazwyczaj mają wiązania dwusiarczkowe, które uniemożliwiają ich całkowite rozwinięcie w detergencie, próbki gotuje się z merkaptoetanolem, aby rozerwać wiązania dwusiarczkowe i zapewnić, że białka są jak najbardziej podobne do pręcików w SDS. Odczynniki, takie jak merkaptoetanol (a także ditiotreitol) są odczynnikami zawierającymi sulfhydryl, które utleniają się, ponieważ redukują wiązania disiarczkowe w innych cząsteczkach (patrz Rysunek 8.16)

Żel do układania

Trzecią kwestią jest to, że na wierzchu żelu poliakryloamidowego można zastosować „żel układający”, aby zapewnić sposób sprasowania próbek w ciasne pasmo, zanim wejdą one do głównego żelu poliakryloamidowego (zwanego żelem rozdzielającym). Podobnie jak fragmenty DNA w elektroforezie w żelu agarozowym są sortowane na podstawie wielkości (największy ruch najwolniejszy, najmniejszy najszybszy), białka migrują przez macierz żelową z prędkościami odwrotnie proporcjonalnymi do ich wielkości. Po zakończeniu elektroforezy białka można wizualizować przez barwienie związkami wiążącymi się z białkami, takimi jak Coomassie Brilliant Blue (rysunek 8.17) lub azotan srebra.

Figura 8.17 - Dwa żele SDS-PAGE - Białka to niebieskie prążki (wybarwione błękitem Coomassie). Wikipedia

Niedenaturująca elektroforeza żelowa

Opisana powyżej technika SDS_PAGE jest najpowszechniejszą metodą stosowaną do elektroforetycznego rozdziału białek. Jednak w niektórych sytuacjach białka mogą być rozdzielone na tak zwanych „natywnych” żelach, przy braku SDS. W tych warunkach na ruch białek przez żel będzie wpływać nie tylko ich masa, ale także ich ładunek w pH żelu. Białka skompleksowane z innymi cząsteczkami mogą poruszać się jako pojedyncza jednostka, umożliwiając izolację partnerów wiążących białek będących przedmiotem zainteresowania.

Ogniskowanie izoelektryczne

Białka różnią się znacznie pod względem ładunku, a co za tym idzie, wartości pI (pH, przy którym ich ładunek wynosi zero). Można to wykorzystać do oddzielenia białek w mieszaninie. Oddzielenie białek przez ogniskowanie izoelektryczne wymaga ustalenia gradientu pH w probówce zawierającej matrycę żelową akrylamidową. Wielkość porów żelu jest dostosowana tak, aby była duża, aby zmniejszyć efekt przesiewania na podstawie wielkości. Cząsteczki, które mają być rozdzielone, są nakładane na żel zawierający gradient pH i przykładane jest pole elektryczne. W tych warunkach białka poruszają się zgodnie ze swoim ładunkiem.

Na przykład cząsteczki naładowane dodatnio poruszają się w kierunku elektrody ujemnej, ale ponieważ przechodzą przez gradient pH, gdy przez nią przechodzą, docierają do obszaru, w którym ich ładunek wynosi zero i w tym momencie przestają się poruszać. W tym momencie nie są przyciągane ani do dodatniej, ani do ujemnej elektrody, a zatem są „zogniskowane” na swoim pI (rysunek 8.18). Stosując ogniskowanie izoelektryczne, możliwe jest oddzielenie białek, których wartości pI różnią się nawet o 0,01 jednostki.

Elektroforeza żelowa 2D

Zarówno SDS-PAGE, jak i ogniskowanie izoelektryczne są potężnymi technikami, ale sprytne połączenie tych dwóch jest potężnym narzędziem proteomiki - nauki o jednoczesnym badaniu wszystkich białek komórki/tkanki. W elektroforezie żelowej 2-D najpierw przygotowuje się lizat z komórek będących przedmiotem zainteresowania. Białka w lizacie są najpierw rozdzielane przez ich pI, przez ogniskowanie izoelektryczne, a następnie według wielkości przez SDS-PAGE.

Mieszanina białek jest najpierw nakładana na probówkę lub pasek (ryc. 8.19, krok 1), gdzie przeprowadza się ogniskowanie izoelektryczne w celu oddzielenia białek według ich wartości pI (krok 2). Następnie, jak pokazano na rysunku, żel zawierający białka rozdzielone przez ich pIs jest odwracany na bok i nakładany wzdłuż górnej części płyty poliakryloamidowej do SDS-PAGE w celu rozdzielenia na podstawie wielkości (etap 3). Białka w izoelektrycznej matrycy ogniskującej poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym i rozdziela na podstawie wielkości. Produktem tej analizy jest żel 2-D, jak pokazano na Rysunku 8.20. Siła elektroforezy żelowej 2-D polega na tym, że praktycznie każde białko w komórce może być oddzielone i pojawiać się na żelu jako plamka określona przez jego unikalny rozmiar i Liczba Pi. Na rysunku, plamki w lewym górnym rogu odpowiadają dużym białkom naładowanym dodatnio, podczas gdy te w prawym dolnym rogu to małe białka naładowane ujemnie. Każda plamka na żelu 2-D może być eluowana i identyfikowana za pomocą wysokoprzepustowej spektrometrii masowej. Jest to szczególnie silne, gdy porównuje się profile białek między różnymi tkankami lub między próbkami kontrolnymi i traktowanymi z tej samej tkanki.


Rysunek 8.20 - Wynik rozdziału metodą elektroforezy w żelu 2-D. Wikipedia

Porównanie profili białkowych

Porównanie żeli 2-D białek z tkanki nienowotworowej i białek z tkanki nowotworowej tego samego typu pozwala na szybką identyfikację białek, których poziom ekspresji różni się między nimi. Informacje takie jak ta mogą być przydatne w projektowaniu terapii lub w zrozumieniu mechanizmu(ów) rozwoju nowotworu.


Jak działa elektroforeza

W elektroforezie istnieją dwa podstawowe czynniki, które kontrolują, jak szybko cząsteczka może się poruszać i w jakim kierunku. Po pierwsze, opłata za próbkę ma znaczenie. Gatunki naładowane ujemnie są przyciągane do dodatniego bieguna pola elektrycznego, podczas gdy gatunki naładowane dodatnio są przyciągane do bieguna ujemnego. Gatunek obojętny może zostać zjonizowany, jeśli pole jest wystarczająco silne. W przeciwnym razie nie ma to wpływu.

Drugim czynnikiem jest wielkość cząstek. Małe jony i cząsteczki mogą poruszać się w żelu lub cieczy znacznie szybciej niż większe.

Podczas gdy naładowana cząstka jest przyciągana przez przeciwny ładunek w polu elektrycznym, istnieją inne siły, które wpływają na ruch cząsteczki. Tarcie i siła opóźnienia elektrostatycznego spowalniają przechodzenie cząstek przez płyn lub żel. W przypadku elektroforezy żelowej stężenie żelu można kontrolować w celu określenia wielkości porów matrycy żelowej, co wpływa na ruchliwość. Obecny jest również płynny bufor, który kontroluje pH środowiska.

Gdy cząsteczki są przeciągane przez ciecz lub żel, medium się nagrzewa. Może to denaturować cząsteczki, a także wpływać na szybkość ruchu. Napięcie jest kontrolowane w celu zminimalizowania czasu wymaganego do oddzielenia cząsteczek, przy jednoczesnym utrzymaniu dobrego rozdziału i utrzymaniu nienaruszonych związków chemicznych. Czasami elektroforezę wykonuje się w lodówce, aby zrekompensować ciepło.


Jak wykonuje się elektroforezę żelową

Przejrzymy niektóre z podstawowych koncepcji elektroforezy żelowej, aby wyjaśnić powody każdego kroku.

Ta technika jest laboratoryjną metodą oddzielania i analizowania dużych cząsteczek, takich jak białka, DNA i RNA. Chemicy kliniczni używają go do rozdzielania białek według ładunku i wielkości, a biolodzy molekularni do rozdzielania próbek fragmentów DNA i RNA według długości.

Elektroforezę DNA i białek można przeprowadzić przy użyciu tego samego sprzętu iw ten sam sposób. W elektroforezie żelowej poziomej wykorzystuje się żel agarozowy, który pod mikroskopem ma strukturę przypominającą siatkę. Podczas elektroforezy pionowej stosuje się żel poliakrylamidowy. Żele poliakrylamidowe mają rzadszą konsystencję, co może ułatwić oglądanie procesu elektroforezy. Ta technika opiera się na ruchu naładowanych cząsteczek, gdy są one wystawione na działanie pola elektrycznego. Ten ruch odbywa się w poprzek arkusza żelu, lub inaczej mówiąc, w medium żelowym. Ale co ma wspólnego elektryczność z DNA lub białkami?

DNA jest naładowane ujemnie. Wynika to z obecności grup fosforanowych. Helisa DNA składa się nie tylko z czterech zasad adenozyny (A), guaniny (G), cytozyny (C) i tyminy (T). Jego szkielet zawiera miliardy grup fosforanowych, z których każda ma niewielki ujemny ładunek elektryczny. Obecność grup fosforanowych nadaje DNA spiralny kształt.

W helisie RNA i innych rodzajach białek znajdują się również grupy fosforanowe. Białka na ogół mają ładunki ujemne. Mniejsze białka mają mniejsze ładunki, a większe mają większe ładunki elektryczne.
Przygotowanie żeli agarozowych jest bardzo proste.

Żele agarozowe są przygotowywane na poziomej tacce do odlewania. Taca będzie potrzebować taśmy lub zdejmowanych gumowych zderzaków zakrywających dwa otwarte końce, aby utworzyć formę na arkusz. Tacki odlewnicze będą miały wcięcia na grzebień do elektroforezy. Grzebienie występują we wszystkich rozmiarach i kolorach, mogą mieć zęby z jednej strony lub być dwustronne. Te zęby stworzą dołki do wprowadzenia próbek.

Agaroza, która pochodzi z wodorostów, rozpocznie się w postaci proszku. Proszek jest rozpuszczany w buforze do elektroforezy o specyficznym pH. Wybór buforu zależy od tego, czy zostaną użyte próbki DNA, czy białka. Zwykłe gotowanie agarozy i buforu do elektroforezy rozpuści agarozę. Następnie ostrożnie wlej roztwór agarozy do tacki do odlewania, jak wlewając formę Jell-O. Gdy agaroza wciąż paruje i jest płynna, wsuń grzebień do agarozy w miejscu, w którym znajduje się tacka do odlewania. Następnie agaroza będzie musiała ostygnąć i zestalić się. Gdy żel będzie gotowy, będzie stały i będzie miał jędrną konsystencję podobną do galaretki. Bardzo ostrożnie zdejmij grzebień, aby odsłonić dołki, a następnie usuń taśmę lub zderzaki tak, aby oba końce stałego materiału agarozowego były odsłonięte. Tradycyjna komora do elektroforezy będzie miała elektrodę ujemną i dodatnią, pomiędzy którymi znajduje się przestrzeń umożliwiająca ułożenie materiału. Elektrody połączą się z górną częścią do wyjmowania i włączą się do źródła zasilania.

Umieścić tackę do odlewania z agarozą na swoim miejscu w komorze do elektroforezy. Jeśli dołki znajdują się bliżej jednego końca żelu, umieść dołki bliżej elektrody ujemnej. Używając tego samego buforu do elektroforezy specyficznego dla pH, wlej bufor do komory, aż pokryje wierzch żelu.

Ostrożnie wprowadzić jedną przygotowaną próbkę do każdego dołka za pomocą mikropipetora. Wielokrotnie próbki będą czyste, dlatego zaplamiony marker lub barwnik zostanie załadowany do dedykowanej studzienki. Po załadowaniu wszystkich próbek, załóż pokrywę komory i włącz zasilanie, aby rozpocząć cykl elektroforetyczny.

Zasilacze można ustawić na różne napięcia. Kluczem jest pilnowanie przebiegu elektroforetycznego. Zbyt wysoki prąd (lub napięcie) może stopić żel.
Gdy zaplamiony marker znajdzie się około jednego centymetra od krawędzi żelu, wyłącz zasilanie, a następnie zdejmij pokrywę komory.

Kiedy patrzysz na materiał przez mikroskop, widzisz strukturę przypominającą siatkę. Rozmiar porów w materiale jest prawie stały przez cały czas. Gdy fragmenty o różnej wielkości są wystawione na ładunek elektryczny w całym materiale, mniejsze fragmenty szybciej wydostają się z porów, a większe fragmenty potrzebują więcej czasu, aby przejść przez pory.

W tym momencie może być trudno zobaczyć próbki, ponieważ od początku były jasne. Dostępnych jest wiele barwników, które uwidaczniają próbki, co zależy od tego, czy użyto próbek DNA, czy białek. Plama zwiąże się z próbką, aby były widoczne na podświetlanym pudełku lub w świetle ultrafioletowym. W przypadku próbek DNA dobrym wyborem jest błękit metylenowy lub bromek etydyny. Podczas gdy białka zwykle używają Coomassie Blue lub buforu do wywoływania koloru. Ponieważ DNA i białka wykorzystują ten sam proces do elektroforezy, również używają tego samego procesu do barwienia.

Aby zabarwić żel wystarczy zanurzyć go w wybranej plamie na kilka minut. Następnie spłucz przez zanurzenie w wodzie. Żele barwione błękitem metylenowym, błękitem Coomassie lub buforem do wywoływania koloru można umieścić bezpośrednio na podświetlanym pudełku i można je zobaczyć gołym okiem. Próbki będą miały kolor niebiesko-fioletowy. Żele barwione bromkiem etydyny wymagają do oglądania światła ultrafioletowego i bursztynowych okularów blokujących promieniowanie UV.

Jak określić wielkość fragmentów lub próbek na żelu? Wystarczy porównać ze znanymi rozmiarami pasków lub rozmiarami barwników załadowanymi do dedykowanego zagłębienia znacznika. W przypadku DNA zostanie zastosowana drabinka DNA z prążkami o określonych rozmiarach. W przypadku białek do stworzenia efektu drabiny zostanie użytych kilka białek lub barwników o znanej masie cząsteczkowej lub ładunku.

Elucja może być wykorzystana do pobrania fragmentu próbki z materiału do wykorzystania w przyszłości. Proces elucji jest bardzo prostym wycięciem fragmentu z żelu i przepuszczeniem go przez sitko w wirówce, aby usunąć agarozę, ale zachować wszystko w porach. Po tym procesie pozostajesz z roztworem DNA lub białka rozpuszczonym w buforze do elektroforezy. Elucję przeprowadza się w taki sposób, że poszczególne fragmenty DNA można wykorzystać do dalszej obróbki, takiej jak sekwencjonowanie genomu.


8.3: Elektroforeza - Biologia

Elektroforeza żelowa to technika stosowana do rozdzielania cząsteczek kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), kwasu rybonukleinowego (RNA) lub białek za pomocą prądu elektrycznego przyłożonego do żel matryca. DNA Elektroforeza żelowa jest ogólnie.
Cały artykuł >>>

Agaroza elektroforeza żelowa to metoda stosowana w biochemii i biologii molekularnej do oddzielania cząsteczek DNA lub RNA według rozmiaru. Osiąga się to poprzez przenoszenie ujemnie naładowanych cząsteczek kwasu nukleinowego przez macierz agarozową.
Cały artykuł >>>

żel elektroforeza n. Elektroforeza wykonywane w żel składający się z agarozy, poliakrylamidu lub . Żel elektroforeza jest szeroko stosowaną techniką dla .
Cały artykuł >>>

Agaroza żel elektroforeza Cyfrowy obraz 3 trawienia restrykcyjnego plazmidu przeprowadzonego na 1% w/v agarozie żel, 3 V/cm, barwiony bromkiem etydyny
Cały artykuł >>>

Eksperyment 2: Żel Elektroforeza DNA. Co jest Elektroforeza? Elektroforeza to technika stosowana w laboratorium. Dowiedzmy się, „robiąc” a żel. .
Cały artykuł >>>

Agaroza Żel Elektroforeza DNA. Przygotowanie i prowadzenie standardowych żeli DNA agarozowego . Wlać żel, proszek agarozowy miesza się z elektroforeza bufor do .
Cały artykuł >>>

Laboratorium wirtualne: Agaroza Żel Elektroforeza fragmentów restrykcyjnych . symulacja agarozy żel elektroforeza konfiguracja, która pozwala na .
Cały artykuł >>>

Żel elektroforeza jest ważnym i szeroko stosowanym narzędziem w analizie biologicznej. męskość mokrego laboratorium żel elektroforeza działalność. .
Cały artykuł >>>

„SDS poliakrylamid” żel elektroforeza2000 J.V. Maizel, Jr.Trends. Detal: Nowy gradient denaturujący żel elektroforeza metody są opisane. .
Cały artykuł >>>

Żel Elektroforeza. Z zestawu DNA. Za pomocą procesu znanego jako żel elektroforezafragmenty DNA można rozdzielić. Żel Elektroforeza W skrócie .
Cały artykuł >>>

Agaroza Żel Elektroforeza. Wprowadzenie: Agaroza żel elektroforeza jest . Patrząc na żel powyżej można oszacować wielkość cząsteczkową plazmidu.
Cały artykuł >>>

Żel elektroforeza jest szeroko stosowaną techniką oddzielania naładowanych elektrycznie cząsteczek. . Żel Elektroforeza - Oddzielenie DNA i Rna.
Cały artykuł >>>

Siarczan dodecylu sodu-poliakrylamid żel elektroforeza (SDS-PAGE) jest najbardziej . rozdzielczość żel elektroforeza (zobacz Koncentracja aplikacji na .
Cały artykuł >>>

Agaroza żel elektroforeza oddziela fragmenty DNA według ich wielkości. . enzymy restrykcyjne i agaroza żel elektroforeza służy jako diagnostyka.
Cały artykuł >>>

Żel elektroforeza to metoda rozdzielania cząsteczek, takich jak DNA. Do jakich celów używają naukowcy? żel elektroforeza? .
Cały artykuł >>>

. w biologii molekularnej i biochemii jest żel. elektroforeza. . Podstawowa teoria kryjąca się za elektroforeza jest umieszczenie próbki w a żelpodobny materiał .
Cały artykuł >>>

Żel elektroforeza. Porównanie typu agarozy (loci niepolimorficzne) . Elektroforeza czas był około 1,6-1,7 razy dłuższy dla zwykłej agarozy (SeaKem LE) żel. .
Cały artykuł >>>


Jaka jest zasada elektroforezy?

Zasada elektroforezy mówi, że w obecności pola elektrycznego naładowana cząstka porusza się w kierunku obszaru o przeciwnym ładunku. Kiedy cząstka ma nierówny rozkład ładunku w wiązaniach chemicznych, dopasowuje się do potencjału elektrycznego.

Elektroda to dowolny materiał przewodzący, który wytwarza pole elektryczne, aby umożliwić przepływ prądu. Dodatni koniec elektrody nazywany jest anodą, podczas gdy ujemny koniec nazywany jest katodą. Kiedy ujemnie naładowana cząstka porusza się wzdłuż pola elektrycznego, ma tendencję do migracji w kierunku anody i poruszania się wbrew sile tarcia. Im większa cząsteczka, tym wolniej się porusza.

W dziedzinie biologii molekularnej i biochemii elektroforeza jest użyteczną techniką analityczną, w której oddzielane są makrocząsteczki o różnych rozmiarach i gęstościach. Złożone białka i kwasy nukleinowe poddawane elektroforezie przechodzą przez żelową matrycę, która składa się głównie ze spolimeryzowanej agarozy lub poliakrylamidu. Agaroza to polisacharyd, który po rozpuszczeniu we wrzącej wodzie tworzy substancję podobną do żelatyny. Poliakrylamid to rodzaj stałego żelu, który powstaje w wyniku polimeryzacji roztworów akryloamidu poprzez dodanie nadsiarczanu amonu sprzężonego z tetrametylenodiaminą.

Żel agarozowy służy głównie do oddzielania złożonych cząsteczek białek i fragmentów DNA lub RNA. Większe cząsteczki zostają uwięzione w porowatym materiale, podczas gdy mniejsze cząsteczki łatwo przechodzą. Współcześni badacze preferują stosowanie żelu poliakrylamidowego. Inne formy elektroforezy żelowej obejmują ogniskowanie izoelektryczne, elektroforezę 2D, elektroforezę kapilarną i western blotting.


8.3: Elektroforeza - Biologia

×Używasz an przestarzały przeglądarka.
Zaktualizuj przeglądarkę, aby poprawić swoje wrażenia.

Wózek sklepowy

Twój koszyk jest obecnie pusty.

Tris-boran-EDTA (TBE) Bufor w proszku 1x (pH 8.3) Ƒ L) ྪ woreczki)

Opis produktu

Produkty Medicago AB są dostępne na całym świecie

W biologii molekularnej proszek buforowy Tris-boran-EDTA (TBE) i bufory TAE są często stosowane w procedurach z udziałem kwasów nukleinowych, z których najczęstsze to elektroforeza w żelu agarozowym i poliakrylamidowym. Roztwory tris-kwasów są skutecznymi buforami w lekko zasadowych warunkach, które utrzymują DNA w stanie odprotonowanym i rozpuszczalnym w wodzie. EDTA jest środkiem chelatującym dwuwartościowe kationy, zwłaszcza magnez (Mg 2+ ). Ponieważ jony te są niezbędnymi kofaktorami dla wielu enzymów, w tym zanieczyszczających nukleaz, jednym z zadań EDTA jest ochrona kwasów nukleinowych przed enzymatyczną degradacją przez nukleazy. Jednakże, ponieważ Mg2+ jest również kofaktorem dla wielu enzymów modyfikujących DNA, takich jak enzymy restrykcyjne i polimerazy DNA, jego stężenie w buforach TBE lub TAE jest ogólnie utrzymywane na niskim poziomie.

Boran jest silnym inhibitorem wielu enzymów, co sprawia, że ​​jego obecność w buforze do TBE jest bardzo popularna: próbka DNA badana w buforze do TBE może lepiej zachować swoją integralność, co odpowiada celowi wielu przebiegów elektroforezy w żelu agarozowym, tj. analizie wielkości Fragmenty DNA.

Bufor TBE jest często używany do elektroforezy w żelu agarozowym i poliakrylamidowym podczas analizy fragmentów DNA z amplifikacji PCR, protokołów izolacji DNA lub eksperymentów klonowania DNA. Jest szczególnie przydatny do rozdzielania mniejszych fragmentów DNA (mniej niż 1500 pz na 0,8% żelu agarozowym), np. małe produkty trawienia enzymami restrykcyjnymi. TBE ma większą pojemność buforowania i zapewnia ostrzejszą rozdzielczość niż TAE. Fragmenty DNA poruszają się również szybciej w TBE niż w buforze TAE. Jednak żele TBE na ogół dają słabe odzyskiwanie kwasów nukleinowych w porównaniu z żelami TAE. TBE hamuje również ligazę DNA, co może powodować problemy, jeśli planowane są kolejne etapy oczyszczania DNA i ligacji.

Bufor TBE dostarczany jest w 3 stężeniach. Wstępnie zważone proszki dają roztwory podstawowe 10x i 5x lub roztwór roboczy 1x.


Zawartość

Test przesunięcia ruchliwości polega na rozdzielaniu elektroforetycznym mieszaniny białko-DNA lub białko-RNA na żelu poliakrylamidowym lub agarozowym przez krótki okres (około 1,5-2 godz. w przypadku żelu o średnicy 15 do 20 cm). [4] Szybkość, z jaką różne cząsteczki (i ich kombinacje) poruszają się w żelu, zależy od ich wielkości i ładunku oraz, w mniejszym stopniu, od ich kształtu (patrz elektroforeza żelowa). Ścieżka kontrolna (sonda DNA bez obecności białka) będzie zawierać pojedynczy prążek odpowiadający niezwiązanemu fragmentowi DNA lub RNA. Jednak zakładając, że białko jest zdolne do wiązania się z fragmentem, ścieżka z obecnym białkiem będzie zawierać inny prążek, który reprezentuje większy, mniej ruchliwy kompleks sondy kwasu nukleinowego związanego z białkiem, które jest „przesunięte” w górę na żelu (ponieważ porusza się wolniej).

W prawidłowych warunkach doświadczalnych interakcja między DNA (lub RNA) a białkiem jest stabilizowana, a stosunek związanego do niezwiązanego kwasu nukleinowego w żelu odzwierciedla frakcję wolnych i związanych cząsteczek sondy, gdy reakcja wiązania wchodzi do żelu. Ta stabilność wynika częściowo z „efektu klatkowego”, polegającego na tym, że białko otoczone macierzą żelową nie jest w stanie dyfundować z sondy przed ich rekombinacją. [5] Jeśli znane są wyjściowe stężenia białka i sondy oraz jeśli znana jest stechiometria kompleksu, można określić widoczne powinowactwo białka do sekwencji kwasu nukleinowego. [6] O ile kompleks nie żyje bardzo długo w warunkach żelowych lub nie bierze się pod uwagę dysocjacji podczas elektroforezy, otrzymaną liczbą jest pozorna Kd. Jeśli stężenie białka nie jest znane, ale stechiometria kompleksu jest, stężenie białka można określić przez zwiększenie stężenia sondy DNA, aż dalsze przyrosty nie zwiększają frakcji związanego białka. Porównując zestaw standardowych rozcieńczeń wolnej sondy na tym samym żelu, można obliczyć liczbę moli białka. [4]

Do tej mieszaniny można dodać przeciwciało, które rozpoznaje białko, aby stworzyć jeszcze większy kompleks z większym przesunięciem. Ta metoda jest określana jako test supershifti służy do jednoznacznej identyfikacji białka obecnego w kompleksie białko – kwas nukleinowy.

Często dodatkowa ścieżka jest uruchamiana z konkurencyjnym oligonukleotydem w celu określenia najkorzystniejszej sekwencji wiążącej dla białka wiążącego. Zastosowanie różnych oligonukleotydów o określonej sekwencji umożliwia identyfikację dokładnego miejsca wiązania przez współzawodnictwo (nie pokazane na schemacie). Warianty testu kompetycyjnego są przydatne do pomiaru specyficzności wiązania i pomiaru kinetyki asocjacji i dysocjacji. Zatem EMSA może być również wykorzystana jako część eksperymentu SELEX do selekcji oligonukleotydów, które faktycznie wiążą dane białko. [ wymagany cytat ]

Po ustaleniu wiązania DNA z białkiem in vitro, szereg algorytmów może zawęzić poszukiwania identyfikacji czynnika transkrypcyjnego. Oligonukleotydy o sekwencji konsensusowej dla interesującego czynnika transkrypcyjnego będą zdolne do konkurowania o wiązanie, eliminując przesunięty prążek i muszą być potwierdzone przez supershift. Jeśli przewidywana sekwencja konsensusowa nie współzawodniczy o wiązanie, identyfikację czynnika transkrypcyjnego może wspomóc EMSA Multiplexed Competitor EMSA (MC-EMSA), przy czym duże zestawy sekwencji konsensusowych są multipleksowane w każdej reakcji, a gdy jeden zestaw konkuruje o wiązanie, poszczególne sekwencje konsensusowe z tego zestawu są uruchamiane w dalszej reakcji. [7]

Dla celów wizualizacji fragment kwasu nukleinowego jest zwykle znakowany znacznikiem radioaktywnym, fluorescencyjnym lub biotynowym. Standardowe barwienie bromkiem etydyny jest mniej czułe niż te metody i może brakować czułości w wykrywaniu kwasu nukleinowego, jeśli w tych doświadczeniach stosuje się małe ilości kwasu nukleinowego lub jednoniciowego kwasu nukleinowego (kwasów nukleinowych). W przypadku stosowania znacznika biotynowego do wykrywania fragmentu DNA stosuje się streptawidynę sprzężoną z enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa. [8] [9] Chociaż znakowanie izotopowego DNA ma niewielki lub żaden wpływ na powinowactwo wiązania białek, zastosowanie znaczników nieizotopowych, w tym fluoroforów lub biotyny, może zmienić powinowactwo i/lub stechiometrię interakcji białek będących przedmiotem zainteresowania. Współzawodnictwo między sondą znakowaną fluoroforem lub biotyną a niewyznakowanym DNA o tej samej sekwencji można zastosować do określenia, czy znacznik zmienia powinowactwo wiązania lub stechiometrię.


Wspomniałem już o protokole elektroforezy w żelu agarozowym. Możesz użyć protokołu elektroforezy w żelu agarozowym w swoim rutynowym laboratorium i jest to nasz standardowy protokół.

      • Proszek agarozowy jest niebezpieczny, dlatego podczas przygotowywania żelu agarozowego zawsze noś rękawiczki, maskę na twarz i okulary.
      • Podczas gotowania agarozy nosić rękawice kuchenne (żaroodporne). Nie używaj plastikowych rękawiczek, spalisz rękę.
      • EtBr jest rakotwórczy i mutagenny, dlatego przed użyciem należy podjąć niezbędne środki ostrożności.

      Osobiście wolę proszek agarozowy Seakem, który jest opłacalny i daje piękny efekt.

      Czy możemy wykonać instrument do elektroforezy w naszym laboratorium? pomyśl o tym i daj mi znać w polu komentarza.


      Obejrzyj wideo: Elektroforeza DNA w żelu agarozowym (Sierpień 2022).