Informacja

Czy mRNA może być używane przez rybosomy więcej niż jeden raz?

Czy mRNA może być używane przez rybosomy więcej niż jeden raz?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Czy mRNA może być używane przez rybosomy więcej niż jeden raz? Chodzi mi o to, czy mRNA może być tłumaczone więcej niż jeden raz? Jeśli nie, co się z nim stanie po tłumaczeniu?


Jest kilka przypadków w tłumaczeniu, o których mogę pomyśleć, w których mRNA jest tłumaczone więcej niż raz: pętla zamknięta model translacji mRNA, ponownej inicjacji translacji i translacji przez polisomy.

Model z zamkniętą pętlą

Oto interesujący artykuł na początek: ncbi

Zasadniczo istnieje teoria, że ​​mRNA może tworzyć zamkniętą pętlę z końcem 3' utrzymywanym na końcu 5' przez różne czynniki. Rybosom gromadzi się w pobliżu początku, przechodzi przez mRNA, translując sekwencję polipeptydową, a następnie dysocjuje w kodonie STOP. Ponieważ „koniec” mRNA znajduje się blisko „początku” mRNA, rybosom może się ponownie złożyć wkrótce po dysocjacji.

Ponowna inicjacja tłumaczenia

Zobacz.

Rybosom dysocjuje niecałkowicie w kodonie STOP, mała podjednostka porusza się dalej po mRNA, a następnie duża podjednostka ponownie przyłącza się w dalszym miejscu startu. Dzieje się tak, gdy mRNA ma wiele ORF.

Polisomy

(Zobacz artykuł w Wikipedii na temat polisomów, aby uzyskać więcej informacji)

Zasadniczo oznacza to, że masz ciąg rybosomów poruszający się wzdłuż mRNA. To samo białko jest wielokrotnie tłumaczone, ale przez różne rybosomy. Jedną naprawdę fajną rzeczą jest to, że faktycznie zaobserwowano ją pod mikroskopem elektronowym!
(źródło: bioninja.com.au)

Aby odpowiedzieć na drugą część twojego pytania… wikipedia

mRNA ulega degradacji w procesie zwanym interferencją RNA (RNAi). Małe interferujące RNA (siRNA) również podlegają transkrypcji i są włączane do kompleksu rybonukleoproteinowego (RISC), który ma aktywność rozszczepiania mRNA. siRNA są komplementarne do segmentów mRNA w celu nadania swoistości RISC.


Chcesz wiedzieć więcej o mRNA przed szczepionką COVID?

autor: Kristina Fiore, dyrektor ds. raportów korporacyjnych i śledczych, MedPage dzisiaj 3 grudnia 2020 r.

Klinicyści zaczną zakasać rękawy już za kilka tygodni, aby otrzymać pierwsze dawki szczepionek COVID-19, z których obie wykorzystują technologię mRNA do wywołania odpowiedzi immunologicznej.

Dla tych, którzy chcą uzyskać więcej informacji na temat historii i nauki o szczepionkach mRNA i środkach terapeutycznych przed zaszczepieniem, oto elementarz.

Jak to działa

Z biologicznego punktu widzenia informacyjne RNA jest transkrybowane z DNA i wędruje do cytoplazmy komórki, gdzie jest tłumaczone przez rybosomy na białka.

W przypadku szczepionek Pfizer/BioNTech i Moderna zsyntetyzowane mRNA jest zamaskowane w nanocząstce lipidowej w celu uniknięcia układu odpornościowego po wstrzyknięciu. Gdy rybosomy znajdą się w komórce, zaczną wypompowywać białko wypustek SARS-CoV-2.

Układ odpornościowy następnie wytwarza odpowiedź na to białko, nadając odporność wirusowi, nigdy nie będąc nim zarażonym.

Zasadniczo, zamiast farmaceutycznej produkcji białek w kosztownym i trudnym procesie, mRNA angażuje organizm do wykonania pracy. Zdolność do tak szybkiego wytwarzania mRNA jest jednym z powodów, dla których te szczepionki są na czele globalnego wyścigu o szczepionkę COVID-19.

Nigdy wcześniej nie robiono?

To nie do końca prawda. Chociaż szczepionka mRNA nigdy nie była dostępna na rynku nigdzie na świecie, szczepionki mRNA były wcześniej testowane na ludziach pod kątem co najmniej czterech chorób zakaźnych: wścieklizny, grypy, cytomegalii i Zika.

W 2017 r. niemiecka firma biotechnologiczna CureVac opublikowała wyniki w Nazwa naukowego czasopisma medycznego w fazie I próby swojej szczepionki mRNA przeciwko wściekliźnie, aw styczniu tego roku firma opublikowała wyniki w komunikacie prasowym z fazy I próby swojej szczepionki o niskiej dawce mRNA przeciwko wściekliźnie.

W ubiegłym roku Moderna i niemieccy naukowcy opublikowali wyniki fazy I dwóch szczepionek mRNA przeciwko grypie. W styczniu Moderna ogłosiła wyniki swoich badań fazy I nad szczepionką mRNA przeciwko wirusowi cytomegalii, a w kwietniu, gdy szalała pandemia, firma przedstawiła wstępne dane dotyczące swojej szczepionki mRNA przeciwko Zika.

W gazecie w Recenzje natury Drug Discoverydr Drew Weissman z University of Pennsylvania w Filadelfii, wczesny pionier technologii mRNA, wraz z kolegami napisał, że wczesne wyniki szczepionek przeciwko wściekliźnie i grypie mRNA „były nieco skromne, co prowadziło do bardziej ostrożnych oczekiwań co do translacji przedkliniczny sukces kliniki”.

Zespół zauważył, że w obu badaniach immunogenność była „skromniejsza u ludzi, niż oczekiwano na podstawie modeli zwierzęcych, zjawisko obserwowane również w przypadku szczepionek opartych na DNA, a skutki uboczne nie były błahe”.

Pewne oznaki immunogenności można również uzyskać z badań nad szczepionką COVID. Końcowe wyniki Topline z Pfizer/BioNTech wykazały 95% skuteczność w zapobieganiu objawowym zakażeniom w ciągu 2 miesięcy od podania drugiej dawki. Szczepionka Moderna wykazała skuteczność 94,1% w końcowych wynikach III fazy. Oba produkty okazały się bardzo skuteczne w zapobieganiu ciężkim chorobom, a także bardziej umiarkowanym przypadkom.

Trwałość tych efektów pozostaje kwestią otwartą. Jednak dalsze dane z badania fazy I produktu Moderna, obejmującego 4 miesiące po pierwszej dawce, wykazały trwałą odpowiedź przeciwciał neutralizujących, choć z niewielkimi spadkami w tym okresie, szczególnie u starszych uczestników.

Co wiemy o bezpieczeństwie?

Chociaż szczepionki przeciw grypie i wściekliźnie wydawały się „bezpieczne i dość dobrze tolerowane”, napisali Weissman i współpracownicy, badania wykazały „umiarkowane, a w rzadkich przypadkach ciężkie reakcje w miejscu wstrzyknięcia lub ogólnoustrojowe”.

Ich główne obawy dotyczące bezpieczeństwa, które, jak powiedzieli, powinny być uważnie obserwowane w przyszłych badaniach, dotyczyły miejscowego i ogólnoustrojowego zapalenia, a także kontrolowania „ekspresjonowanego immunogenu” i wszelkich przeciwciał autoreakcyjnych.

„Możliwym problemem może być to, że niektóre platformy szczepionek oparte na mRNA indukują silne reakcje interferonu typu I, które są związane nie tylko z zapaleniem, ale także potencjalnie z autoimmunizacją” – napisali. „Tak więc identyfikacja osób o zwiększonym ryzyku reakcji autoimmunologicznych przed szczepieniem mRNA może pozwolić na podjęcie rozsądnych środków ostrożności”.

Autorzy zauważyli również, że zewnątrzkomórkowe RNA może przyczyniać się do obrzęku i przytoczyli badanie, które wykazało, że „wspiera krzepnięcie krwi i patologiczne tworzenie skrzepliny”.

„Bezpieczeństwo będzie zatem wymagało ciągłej oceny, ponieważ różne modalności mRNA i systemy dostarczania są stosowane po raz pierwszy u ludzi i są testowane na większych populacjach pacjentów” – napisali w artykule opublikowanym w 2018 roku.

Efekty ogólnoustrojowe były zdecydowanie widoczne w przypadku dwóch szczepionek mRNA COVID, a doniesienia prasowe cytują uczestników, którzy skarżą się na objawy takie jak „zła grypa”. Chociaż firma Pfizer/BioNTech nie zgłosiła żadnych poważnych obaw dotyczących bezpieczeństwa szczepionki przeciw COVID-19, pacjenci odczuwali zmęczenie i ból głowy stopnia 3. w tempie odpowiednio 3,8% i 2%.

Moderna nie opublikowała danych dotyczących zdarzeń niepożądanych w ogłoszeniu ostatecznych wyników topline, ale stwierdziła, że ​​„nie ma nowych poważnych obaw dotyczących bezpieczeństwa”. Wstępne dane z firmowego badania fazy III, analizowane po odnotowaniu 95 infekcji, obejmowały częstość zdarzeń niepożądanych: zmęczenie (9,7%), bóle mięśni (8,9%), bóle stawów (5,2%), ból głowy (4,5%), ból (4,1 %), oraz rumień/zaczerwienienie w miejscu wstrzyknięcia (2,0%).

Dlaczego wcześniejsze szczepionki zatrzymywały się?

„Głównym czynnikiem jest to, że nie ma poczucia pilności” – powiedział dr Dennis Burton z Scripps Translational Research Clinic w La Jolla w Kalifornii. MedPage dzisiaj.

Zika został stosunkowo ograniczony, szczepionki przeciwko wściekliźnie są już wystarczająco skuteczne, a grypa pozostaje trudnym celem, powiedział Burton.

Chociaż tolerancja mogła być problemem, bezpieczeństwo nie było, powiedział. „Nie ma ryzyka włączenia się do chromosomów gospodarza, a poziom mRNA i białka spadnie i zniknie”.

„Wiemy ogólnie, że ogólne podejście jest dość bezpieczne” – powiedział Burton, ale zauważył, że ważne jest, aby zdarzenia niepożądane były monitorowane i śledzone.

Ostrzegł, że tylko na podstawie samej liczby osób, które zostaną zaszczepione na COVID-19, nastąpią zdarzenia i najprawdopodobniej będą niezwiązane ze szczepionką. Jeśli ludzie czują, że obawy związane z tymi wydarzeniami są odpowiednio rozwiązane, powinni być mniej skłonni do obaw przed przyjęciem szczepionki i bardziej skłonni do pomocy w osiągnięciu poziomu odporności stada potrzebnego do zakończenia pandemii.

„Jedną z rzeczy, o które najbardziej się martwimy, jest to, że ludzie nie zostaną zaszczepieni” – powiedział. „Ale ryzyko tej choroby będzie znacznie wyższe niż ryzyko związane ze szczepieniem”.

Co jeszcze muszę wiedzieć?

Wprowadzenie syntetycznego mRNA do komórek jest również obiecującym rodzajem terapii zastępczej w przypadku chorób, w których wytwarzanie żywotnych białek jest niewystarczające lub wadliwe. Może więc mieć przewagę nad terapiami genowymi i zastępowaniem białek: mniej ryzykownym niż pierwsze, rzadsze dawkowanie niż drugie i tańsze niż oba.

Prace przedkliniczne nad terapeutycznym mRNA sięgają co najmniej 1990 roku, kiedy to u myszy zaobserwowano udaną produkcję białek. Dwa lata później badanie wykazało, że mRNA wstrzyknięte do podwzgórza szczurów z mutacją genetyczną umożliwiło produkcję wazopresyny i cofnęło ich cukrzycę.

Jednak te wczesne wyniki nie wzbudziły znacznego zainteresowania terapią mRNA ze względu na obawy dotyczące niestabilności mRNA, wysokiej wrodzonej immunogenności i nieefektywnego dostarczania, napisali Weissman i współpracownicy. „Zamiast tego pole poszukiwało podejść terapeutycznych opartych na DNA i białkach”.

Wreszcie w 2005 r. Weissman i Katalin Kariko, która jest obecnie starszym wiceprezesem BioNTech, zmodyfikowali mRNA, aby mogło uniknąć wykrycia układu odpornościowego i zwiększyć produkcję białka, zgodnie z artykułem w STATYSTYKA. Jest to uważane za jeden z przełomowych momentów w terapii mRNA, powiedzieli eksperci STATYSTYKA.

Od tego czasu technologia ta jest wykorzystywana nie tylko w szczepionkach przeciwko chorobom zakaźnym, ale także jako sposób na wzmocnienie układu odpornościowego do walki z rakiem. mRNA może celować w antygeny związane z nowotworem wyrażane głównie przez komórki rakowe, takie jak niektóre czynniki wzrostu. Te terapeutyczne – a nie profilaktyczne – szczepionki zostały przetestowane w szeregu nowotworów, w tym ostrej białaczce szpikowej, szpiczaku mnogim, glejaku wielopostaciowym, czerniaku, raku prostaty i innych.

Jest mniej prób regularnych terapii, ale jedną, która zwróciła pewną uwagę jest terapia niewydolności serca mRNA opracowana przez Moderna i AstraZeneca, która koduje czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A. Badania przedkliniczne wykazały tworzenie nowych naczyń krwionośnych i poprawę funkcji serca oraz badanie I fazy u chorych na cukrzycę opublikowane w Komunikacja przyrodnicza w 2019 roku wykazał zwiększony przepływ krwi, co może wskazywać na „potencjał terapeutyczny dla angiogenezy regeneracyjnej”.

Nie wiadomo, czy pozorny sukces szczepionek Pfizera i Moderny wywoła falę rozwoju terapii mRNA, ale Burton ostrzegł, że białko kolce koronawirusa „wydaje się szczególnie łatwym celem”.

„Czy RNA zadziała dla wszystkich szczepionek? Nie sądzę, że możemy to jeszcze powiedzieć” – powiedział Burton. „To ogromny krok naprzód. Jest bardzo szybki i ma wiele zalet. Myślę jednak, że SARS-CoV-2 jest łatwym testem w porównaniu z niektórymi innymi wirusami, z którymi mamy do czynienia”.


Tło

Translacja mRNA to wszechobecny proces obserwowany w prawie wszystkich systemach biologicznych. W tym procesie kodony genetyczne ulegają translacji z mRNA do białka przez translokację rybosomów, po przepisaniu informacji genetycznej zawartej w DNA na mRNA. Proces translacji mRNA obejmuje trzech głównych graczy: mRNA (szablon genetyczny), rybosom (maszynę składania) i RNA przenoszące aminoacylo (aa-tRNA) i jest koncepcyjnie podzielony na trzy etapy: inicjacja, elongacja i terminacja. W szczególności rybosom najpierw przyłącza się do mRNA (inicjacja), odczytuje kodon mRNA po kodonie (od końca 5' mRNA do końca 3'), rekrutuje odpowiedni aa-tRNA i łączy ostatni aminokwas w powstającym łańcucha peptydowego, uwalnia uwolnione tRNA (elongacja), a ostatecznie uwalnia kompletne białko z mRNA, gdy rybosom osiągnie koniec mRNA (terminacja) [1]. Translacja mRNA przebiega zasadniczo według tego samego wzoru u bakterii i eukariontów, z pewnymi różnicami w mechanizmach regulacyjnych.

Doniesiono o obszernych badaniach nad mechanizmami translacji mRNA, które czerpią z wielu podejść i narzędzi, takich jak eksperymentalna biologia komórki, bioinformatyka, biologia teoretyczna i obliczeniowa, a ostatnio także biologia systemów i biologia syntetyczna [2–9]. Jednakże, mimo że podstawowe mechanizmy leżące u podstaw translacji mRNA są stosunkowo jasne, wiele szczegółowych mechanizmów regulacyjnych jest dopiero odkrywanych, których pełne zrozumienie będzie wymagało wzajemnego oddziaływania między eksperymentami a modelowaniem. Dlatego, aby wyjaśnić mechanizm i funkcje translacji mRNA, konieczne jest dogłębne zrozumienie na poziomie systemu, co w konsekwencji wymaga dobrze zdefiniowanych modeli ilościowych. Ponadto zrozumienie uzyskane z tych modeli ilościowych stanowi ważną podstawę do badań biologii syntetycznej [10–15].

Matematyczne modelowanie translacji mRNA ma długą historię i cieszy się ponownym zainteresowaniem w ostatnich latach wraz z rozwojem systemów i biologii syntetycznej [16–28]. Modele translacji mRNA są wprowadzane za pomocą różnych sformułowań na różnych poziomach abstrakcji i można je podzielić na, mówiąc z grubsza, modele oparte na zwyczajnych równaniach różniczkowych (ODE) oraz modele typu Totally Asymmetric Simple Exclusion Process (TASEP) [29–31]. .

Translacja mRNA jest wynikiem szeregu przejść (które można konceptualizować jako reakcje), które zazwyczaj można modelować jako zestaw ODE [32–39]. Takie podejście oparte na ODE korzysta z rozbudowanych narzędzi modelowania i analizy dostępnych dla ODE. Model oparty na ODE zwykle traktuje każdy etap elongacji jako jeden ODE (prawdopodobnie wiele ODE, ponieważ każdy etap elongacji jest wynikiem interakcji wielu graczy, w tym mRNA, aa-tRNA i kilku czynników elongacji [40]), a następnie Proces translacji białek jest opisany w sposób kompleksowy [33, 35]. Jednak model oparty na ODE nie odzwierciedla niektórych unikalnych cech translacji mRNA, to znaczy, że wiele rybosomów na mRNA nie może jednocześnie zajmować jednego kodonu. W rezultacie, pomimo ich użyteczności, modele oparte na ODE niekoniecznie są domyślnym wyborem do modelowania translacji mRNA, chociaż są dominującymi podejściami w modelowaniu innych bioprocesów, takich jak transkrypcja genów, transdukcja sygnału [41–43]. Ponieważ jednak translacja mRNA obejmuje przede wszystkim ruch rybosomów wzdłuż mRNA, w wielu przypadkach można ją badać bez uwzględniania szczegółowych reakcji/podprocesów biochemicznych. Ten uproszczony problem transportu można zatem modelować za pomocą TASEP, modelu zwykle używanego w fizyce nierównowagi [17, 23, 44–48], aby ilościowo zrozumieć transport cząstek w jednowymiarowej sieci. Choć uproszczone, modele oparte na TASEP zostały wykorzystane do uzyskania takich informacji o stanie stacjonarnym, jak średnie zajęcie każdego kodonu w mRNA, szybkość translacji mRNA, które są kluczowe w zrozumieniu translacji mRNA. Wreszcie, choć rzadko spotykane, istnieją inne metodologie modelowania translacji mRNA, na przykład uproszczony, deterministyczny model oparty na sieci Petriego, który traktuje zdarzenia inicjacji, elongacji i terminacji w translacji mRNA jako przejścia w sieci Petriego w czasie [49], oraz uproszczona wersja TASEP nazwana „modelem przepływu rybosomów”, w której kodony na mRNA są gruboziarniste na większe segmenty [50, 51].

Jeśli chodzi o cały proces translacji mRNA, konieczne i pożądane jest modelowanie kodonowe, czyli modele uwzględniające dynamikę rybosomów w każdym kodonie mRNA. Wszystkie te modele, oparte na ODE, oparte na TASEP i oparte na sieci Petriego, mogą być używane w ten sposób, ale z różnymi zaletami i wadami. Dlatego konieczne jest zbadanie wszystkich tych metodologii modelowania w celu znalezienia odpowiedniej metodologii modelowania, aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące tłumaczeń i regulacji tłumaczeniowych. W tej pracy badamy i porównujemy modele stochastyczne oparte na kodonach, modele ODE i modele sieci Petriego. Staramy się rygorystycznie zdefiniować modele oparte na kodonach i związane z nimi algorytmy symulacyjne, wyjaśnić różne zasady aktualizacji, domyślnie przyjęte w tych modelach. Proponujemy również nowy probabilistyczny model oparty na sieci logicznej (PBN) i porównujemy wszystkie te metodologie. Na koniec zbadamy, jak te modele można wykorzystać w sytuacjach, które wiążą się z dodatkową złożonością i jak wiele metodologii może pomóc nam lepiej zrozumieć proces translacji mRNA. Podsumowując, analiza ta zapewnia systematyczną platformę modelowania do wykorzystania w zrozumieniu procesu tłumaczenia w wielu kontekstach.


Bioinspirowane podejście do dostarczania RNA

Dostarczając do komórek nici materiału genetycznego znane jako informacyjne RNA (mRNA), naukowcy mogą pobudzać komórki do wytwarzania dowolnego białka kodowanego przez mRNA. Technika ta ma ogromny potencjał do podawania szczepionek lub leczenia chorób, takich jak rak, ale osiągnięcie skutecznego dostarczania mRNA okazało się wyzwaniem.

Teraz zespół inżynierów chemicznych z MIT, zainspirowany sposobem, w jaki komórki przekształcają własne mRNA na białka, zaprojektował syntetyczny system dostarczania, który jest czterokrotnie skuteczniejszy niż samo dostarczanie mRNA.

„Jeśli chcemy być w stanie dostarczyć mRNA, potrzebujemy mechanizmu, który będzie w tym skuteczniejszy, ponieważ wszystko, co do tej pory zastosowano, daje bardzo mały ułamek tego, co byłoby optymalną wydajnością”, mówi Paula Hammond, David H. Koch Profesor inżynierii, kierownik Wydziału Inżynierii Chemicznej MIT i członek Instytutu Kocha w MIT ds. Integracyjnych Badań nad Rakiem.

Hammond jest starszym autorem artykułu, który ukazał się w: Angewandte Chemie. Głównymi autorami artykułu są doktor Jiahe Li i doktorant Yanpu He. Innymi współautorami artykułu są Wade Wang, Connie Wu i Celestine Hong z laboratorium Hammonda.

Maszyny białkowe

Komunikator RNA przenosi instrukcje genetyczne z DNA, które nie może opuścić jądra komórkowego, do rybosomów komórki, które składają białka na podstawie sekwencji mRNA. Komunikator RNA jest atrakcyjny jako potencjalny nośnik do leczenia choroby lub dostarczania szczepionek, ponieważ po translacji nici mRNA do pożądanego białka ostatecznie ulega degradacji.

„To nie zmienia kodu genetycznego” – mówi Hammond. „Nie ma szans na włączenie genu, więc współczynnik bezpieczeństwa jest znacznie wyższy”.

Aby to podejście zadziałało, mRNA musi sprawnie dostać się do komórek, a gdy już się tam znajdzie, musi dotrzeć do rybosomów, aby zostać przetłumaczone na białko. W poprzednim badaniu naukowcy z MIT odkryli, że mogą poprawić szybkość translacji mRNA, dołączając czapeczkę białkową do jednego końca nici mRNA. Kapturek ten pomaga mRNA utworzyć kompleks potrzebny do zainicjowania translacji.

W nowym badaniu naukowcy skupili się na drugim końcu cząsteczki mRNA. Naturalnie występujące mRNA ma zwykle długi „ogon poli-A”, składający się z długiej sekwencji powtórzeń adenozyny, który stabilizuje cząsteczkę i pomaga jej nie rozkładać się przez enzymy w komórce.

Zespół MIT zdecydował o przyłączeniu do tego ogona białka zwanego białkiem wiążącym poli-A. To białko, które naturalnie występuje w komórkach, pomaga mRNA wiązać się z rybosomami i rozpoczynać proces translacji.

Następnie naukowcy pokryli ten kompleks rodzajem polimeru znanego jako polipeptyd, który jest sekwencją zmodyfikowanych aminokwasów połączonych w łańcuch. Polipeptyd ten służy jako rusztowanie do utrzymywania białka wiążącego poli-A i mRNA w bliskim kontakcie i pomaga zneutralizować ujemnie naładowany mRNA. Bez tej neutralizacji mRNA nie byłoby w stanie przejść przez błony komórkowe, które również są naładowane ujemnie.

Gdy powleczony polimerem mRNA dostanie się do komórki, białko wiążące poli-A chroni je przed rozpadem i pomaga w łączeniu się z rybosomami. mRNA tworzy zamkniętą pętlę, dzięki czemu rybosom może przechodzić przez nią wiele razy, wytwarzając wiele kopii docelowego białka. W ten sposób efekt mRNA, który jest bardzo kosztownym genetycznym środkiem terapeutycznym, można znacznie wzmocnić poprzez połączenie ze znacznie tańszymi syntetycznymi polipeptydami i białkami.

„Tradycyjne podejście polega po prostu na dostarczaniu mRNA do komórek” – mówi Li. „Ale gdy mRNA dostanie się do komórek, może ulec degradacji, więc tworzymy kompleks, który ma kluczowe znaczenie dla inicjacji translacji mRNA”.

Wyższa ekspresja białka

Naukowcy przetestowali ten system, dostarczając do płuc myszy mRNA kodujący gen lucyferazy, świecącego białka. Odkryli, że przy tego rodzaju dostarczaniu komórki wytwarzały cztery razy więcej białka niż wtedy, gdy tylko mRNA było pakowane z tym samym polipeptydem do dostarczania.

Naukowcy uważają, że jednym z powodów, dla których ten system jest bardziej wydajny, jest to, że eliminuje on potrzebę znajdowania przez mRNA białek wiążących poli-A w zatłoczonym środowisku cytoplazmy po wejściu mRNA do komórki.

„Zdaliśmy sobie sprawę, że komórki prawdopodobnie wytwarzają wystarczającą ilość tego białka wiążącego poli-A, aby przetłumaczyć swoje własne mRNA” – mówi. „Kiedy dostarczysz nadmiar mRNA, komórka nie ma wystarczającej ilości tego białka pomocniczego, aby je przetłumaczyć. Zdaliśmy sobie sprawę, że musimy dać jej więcej białka pomocniczego, wstępnie złożyć je z naszymi polipeptydami, aby naśladować strukturę syntezy białek, a następnie -dostarcz ten inspirowany biologią zestaw do komórki”.

W tym badaniu cząsteczki mRNA akumulowały się w płucach z powodu dodatniego ładunku polipeptydu, co pozwoliło cząstkom przyczepić się do czerwonych krwinek i złapać drogę do płuc. Jednak naukowcy planują teraz zbadać modyfikację cząstek polimerami, które skierują je do innych miejsc w ciele, w tym guzów.

Pracują również nad dalszą poprawą stabilności cząsteczek polipeptydu poprzez dodanie hydrofobowego ogona na jednym końcu i dołączenie polimeru zwanego PEG. Obie te modyfikacje powinny pomóc cząsteczkom dłużej krążyć w organizmie, umożliwiając im dotarcie do zamierzonych miejsc.


Wiadomość w butelce

Chociaż dziesiątki prób testują informacyjne RNA w celu uzbrojenia układu odpornościowego przed wirusami lub rakiem, tylko kilka firm rozpoczęło małe próby kliniczne innych terapii – takich jak mRNA w celu zastąpienia brakujących lub wadliwych białek. Oto kilka.

Stan: schorzenieBiałko kodowane przez mRNADroga podaniaFirma sponsorująca
MukowiscydozaCFTR, który utrzymuje równowagę płynów w błonachWdychanyPrzetłumacz biografię
Niewydolność sercaVEGF-A, który stymuluje wzrost naczyń krwionośnychZastrzyk nasierdziowyAstraZeneca
Niedobór transkarbamylazy ornitynyOTC, który pomaga usuwać azot z organizmuDożylnyTerapia Arcturus
kwasica propionowaKarboksylaza propionylo-CoA, potrzebna do prawidłowego metabolizmuDożylnyNowoczesna
Amyloidoza transtyretynowaCas9, który tnie DNA w celu usunięcia wadliwego genuDożylnyTerapeutyka Intellia

Jednak wiele innych leków zawierających mRNA musi znaleźć drogę do określonego miejsca w organizmie poprzez krwioobieg. Na przykład w przypadku niedoboru transkarbamylazy ornityny (OTC) brakujący enzym powoduje gromadzenie się amoniaku we krwi, co może prowadzić do drgawek, śpiączki i śmierci. Aby temu zapobiec, lek mRNA musi dotrzeć do komórek w wątrobie.

Firma Arcturus Therapeutics zajmująca się lekami mRNA, której celem jest leczenie niedoboru OTC, zmaksymalizowała ilość leku, która trafia do wątroby, częściowo poprzez dostosowanie rozmiaru i ładunku elektrycznego nanocząstek lipidowych, mówi szef firmy Joseph Payne. Firma Arcturus zakończyła wstępne badanie bezpieczeństwa na około 30 zdrowych ochotnikach, aw tym miesiącu podała dawkę pierwszemu z 12 planowanych uczestników, u których występuje niedobór.

Firma zdecydowała się skoncentrować na niedoborze OTC po części dlatego, że wątroba w naturalny sposób wyłapuje i akumuluje cząsteczki z krwioobiegu, w tym nanocząsteczki terapeutyczne. Inne tkanki są jeszcze trudniejsze do dotarcia z mRNA, mówi James Dahlman, inżynier biomedyczny z Georgia Institute of Technology. Wiele zespołów modyfikuje strukturę nanocząstek lipidowych lub ozdabia je cząsteczkami, które kierują je do określonego narządu lub typu komórki.

Laboratorium Dahlmana i firma, którą założył, Guide Therapeutics, opracowały technikę śledzenia trajektorii tysięcy chemicznie unikalnych nanocząstek u zwierząt poprzez oznaczanie ich „kodami kreskowymi” DNA. Ale ustalenie związku między strukturą nanocząstki lipidowej a jej miejscem docelowym „potrwa dekadę”, mówi.

Drugą dużą różnicą między szczepionkami a terapeutykami mRNA jest to, że szczepionki wymagają tylko jednej lub kilku dawek. Gdy układ odpornościowy zostanie wyszkolony do atakowania danego zagrożenia, białko wytwarzane z mRNA ulega degradacji i nie wymaga uzupełniania. W większości leki mRNA, które do tej pory weszły do ​​badań klinicznych, to takie, „w których działanie leku trwa dłużej niż lek”, mówi Dahlman. Odnosi się to również do terapii, które wykorzystują mRNA do kodowania białek, takich jak enzym Cas9, który może wycinać genom w celu wprowadzenia trwałych zmian. Intellia Therapeutics, firma redakcyjna CRISPR, opracowuje jedną z takich terapii opartych na mRNA dla dziedzicznej amyloidozy transtyretynowej. Firma dawkowała swojemu pierwszemu uczestnikowi badania klinicznego w zeszłym miesiącu.

Ale kiedy potrzebne są powtarzane dawki mRNA, aby uzupełnić białko przez całe życie, skutki uboczne — potencjalnie spowodowane nagromadzeniem się nanocząsteczek lipidów w organizmie lub odpowiedzią zapalną na obcy RNA — stają się większe. Ludzie mogą zaakceptować dzień lub dwa bolesności i gorączki po otrzymaniu szczepionki przeciw COVID-19, mówi Ann Barbier, dyrektor medyczny w firmie terapeutycznej mRNA Translate Bio. Ale „jeśli doświadczasz tego co 3 tygodnie przez resztę swojego życia, to jest to inna propozycja”.

Aby wielokrotne dawki były bardziej tolerowane, Translate Bio i inni projektują mRNA tak, aby wyglądało jak najbardziej naturalnie dla organizmu i dostarczało je w biodegradowalnych nanocząsteczkach. Terapia mRNA firmy Translate Bio dla mukowiscydozy jest obecnie w fazie testów klinicznych. Pojedyncza dawka terapii nie wykazała poważnych skutków ubocznych, u niektórych pacjentów wystąpiła gorączka, bóle mięśni lub bóle głowy, które były krótkotrwałe i możliwe do opanowania, podała firma. Trwająca próba testuje wiele dawek.

Poprawa ilości białka wytwarzanego przez organizm z dawki mRNA zmniejszyłaby częstotliwość i wielkość wymaganych dawek. Jednym z podejść, mówi Sahay, jest zwiększenie zdolności nanocząstek lipidowych do „ucieczki” z błoniastych woreczków, których komórki używają do ich wciągania. W ten sposób więcej ładunku mRNA nanocząstek ma szansę na interakcję z maszynerią komórki białka. Jego zespół poinformował w lutym, że w testach na komórkach, zamiana naturalnie występujących chemicznych wariantów cholesterolu w nanocząsteczkach lipidów uczyniła z nich lepszych artystów uciekających.

Wyścig o szczepionkę mRNA przeciwko COVID-19 nie rozwiązał problemów z dostarczaniem i dawkowaniem, z jakimi borykają się terapie mRNA, ale mógł wygładzić ich ścieżkę na inne sposoby. Po pierwsze, producenci szczepionek wykazali, że w krótkim czasie można wyprodukować miliardy nanocząstek i nici mRNA. Zespół Sahay wciąż zastanawia się nad najlepszymi nanocząsteczkami lipidowymi, aby eskortować mRNA do najdalszych zakątków ciała. „Ale dzień, w którym ktoś to zrozumie, będzie to transformujące”, mówi, ponieważ kroki prowadzące do dostarczenia mRNA do kliniki „są teraz tak wyraźnie zgodne”.


Ci autorzy wnieśli równy wkład: Matthieu Simeoni, Théo Cavinato, Daniel Rodriguez.

Afiliacje

Centrum Genomiki Integracyjnej, Uniwersytet w Lozannie, Lozanna, Szwajcaria

Matthieu Simeoni, Théo Cavinato, Daniel Rodriguez i David Gatfield

Możesz również wyszukać tego autora w PubMed Google Scholar

Możesz również wyszukać tego autora w PubMed Google Scholar

Możesz również wyszukać tego autora w PubMed Google Scholar

Możesz również wyszukać tego autora w PubMed Google Scholar

Składki

Pierwszy szkic został napisany przez M.S., T.C. i D.R. (kurs „Napisz recenzję” w ramach programu magisterskiego z zakresu Molecular Life Sciences na Uniwersytecie w Lozannie, promotor: D.G.). D.G. dalej dostosował tekst rękopisu i ryciny. Wszyscy autorzy zrecenzowali ostateczny rękopis.

Autor do korespondencji


MRNA nie zmienia DNA, kropka

Aby zostać lekarzem, potrzeba wielu lat kursów biologii. Minęło dużo czasu, odkąd siedziałem na pierwszym kursie biologii, ale przysięgam, że w ciągu pierwszych kilku dni uczy się o mRNA i DNA. Kiedyś uczyłem biologii pierwszego roku, więc pozwól, że nauczę cię wszystkiego, co musisz wiedzieć o mRNA i DNA – jeśli nie chcesz być lekarzem, to lepiej, żebyś nauczył się dużo więcej niż to, co ci tutaj mówię.

Jak większość z nas już wie, szczepionki Pfizer i Moderna Therapeutics COVID-19 są szczepionkami mRNA, które opierają się na cząsteczce mRNA lub informacyjnej RNA w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej. Jednak nie robi tego bezpośrednio.

Użyję powyższej grafiki, aby poprowadzić nas przez proces działania mRNA w komórkach. Zrobię to krok po kroku, abyśmy wszyscy mogli być na tej samej stronie.

  1. Podczas procesu zwanego transkrypcją polimeraza RNA tworzy kopię genu z DNA na chromie – ta kopia to mRNA. Proces transkrypcji rozpoczyna się, gdy komórka sygnalizuje, że musi zacząć produkować białko, którego potrzebuje organizm, powiedzmy insulinę lub jeden z tysięcy enzymów lub cokolwiek innego.
  2. Podobnie jak w DNA, informacja genetyczna w mRNA jest zawarta w sekwencji nukleotydów, które są ułożone w kodony składające się z trzech rybonukleotydów każdy. Każdy kodon koduje jeden konkretny aminokwas, z wyjątkiem kodonów stop, które kończą syntezę białka.
  3. Sekwencje mRNA są „odbiciem lustrzanym” sekwencji DNA, które zawierają dane o tym, jak wytwarzać białko.
  4. rybosom, organella w komórce do translacji, w którym tryplety tRNA, kodujące jeden aminokwas, przyłączają się do odpowiedniej trójki mRNA, dodając jeden aminokwas do łańcucha białkowego.
  5. Kilka wirusów, takich jak HIV, ma enzym zwany “odwrotną transkryptazą”, który może powodować zmiany mRNA w DNA, ale jego prawdziwym celem jest stworzenie kopii samego siebie. U ludzi istnieje również enzym zwany telomerazą, który dodaje bardzo specyficzny fragment kodu do chromosomów, ale nie wykorzystuje on unoszącego się w pobliżu mRNA, wykorzystuje RNA, które nosi w sobie. Żaden z nich nie mógł pobrać mRNA ze szczepionek i zmienić naszego DNA.

Oto wideo (zwykle nie myślę dużo o YouTube dla nauki, ale to działa dla mnie), które pokazuje, jak działa tłumaczenie i transkrypcja:

Chcę w tym miejscu wyjaśnić – mRNA nie robi nic z nicią DNA w twoich genach – po prostu odzwierciedla sekwencję DNA.

Jeśli nadal chcesz wierzyć, że mRNA w tych szczepionkach może magicznie zmienić twoje DNA, istnieją inne powody, dla których nie może.

  1. Genom Twojej komórki (DNA) jest zawarty w jądrze komórki, które jest otoczone podwójną błoną. Ta błona pozwala dużym cząsteczkom, takim jak mRNA, który właśnie odczytał DNA, opuścić jądro, ale blokuje wejście do jądra dużymi cząsteczkami.
  2. Even if the mRNA molecule could affect the DNA and even if it could get into the nucleus, there are all kinds of error correction machinery in our DNA to keep out random bits of code. With trillions of cells in each human, each containing billions of DNA base pairs, there are naturally a lot of errors that could kill a human if the quality control machinery of the DNA didn’t keep close watch over errors.
  3. Similarly, this mRNA cannot get into the mitochondria (which have their own DNA) and cause damage to its DNA. Even though the mitochondrion lacks a cell nucleus, it does have its own ribosomes and genes, and they would react to the S-protein mRNA in the same ways as the cell – it would not change its DNA.

Once the mRNA has created a protein, it is then broken down by enzymes in the cell into individual nucleotides, which then move into the nucleus to be reused in a new mRNA strand. The cellular machinery of translating DNA into proteins is constantly recirculating itself.

The Pfizer and Modern mRNA strands only undergo the transcription process to produce spike proteins, that’s it. It can’t get into the cell, and mRNA just does not change the DNA.

The mRNA sequences in the Pfizer and Moderna vaccines enter the cell (in a complex manner that is just more cell biology than I think you’d want to read), and heads to the ribosomes to create the SARS-CoV-2 antigens. These antigens will depart the cell and will trigger the body’s adaptive immune system to produce antibodies effective against the actual target, in this case, the S-protein or spike on the SARS-CoV-2 virus.

One more thing – the antigens produced by these mRNA sequences are biologically inert. They will induce an immune response, but they will not cause any other biological effect including becoming pathogenic.

So, let’s summarize. The mRNA vaccines make use of the cell’s ribosome to create the S-protein of the SARS-CoV-2 virus. That antigen induces an adaptive immune system response that will “remember” that antigen allowing the immune system to quickly attack the virus if it shows up.


What takes message from DNA to the ribosomes?

The type of RNA that contains the information for making a protein is called messenger RNA (mRNA) because it carries the information, or wiadomość, od DNA out of the nucleus into the cytoplasm. The mRNA interacts with a specialized complex called a rybosom, which "reads" the sequence of mRNA bases.

Furthermore, does RNA transfer messages from DNA to ribosomes? Messages w DNA (and the mRNA) are coded such that rybosomy have to use a key to translate them. Rybosomy call upon a particular type of RNA to serve as their tool for decoding mRNA. This special tool is known as tRNA (transfer RNA, because it's involved in the przenosić of amino acids to a newly forming protein).

Similarly, you may ask, what carries the coded message to the ribosome?

A chemical called messenger RNA (mRNA) is made in the nucleus and niesie a copy of the DNA base sequence of a specific gene to the cytoplasm. Rybosomy attach to the mRNA and the instructions it niesie are used to assemble amino acids in the correct order to make a specific protein.

What is translation in DNA?

Tłumaczenie is the process that takes the information passed from DNA as messenger RNA and turns it into a series of amino acids bound together with peptide bonds. The ribosome is the site of this action, just as RNA polymerase was the site of mRNA synthesis.


Decaying RNA molecules tell a story

Once messenger RNA (mRNA) has done its job – conveying the information to produce the proteins necessary for a cell to function – it is no longer required and is degraded. Scientists have long thought that the decay started after translation was complete and that decaying RNA molecules provided little biological information.

IMAGE: V.Pelechano/EMBL – see full version below

Now a team from EMBL Heidelberg and Stanford University led by Lars Steinmetz has turned this on its head in an article published in Komórka. The researchers have shown that one end of the mRNA begins to decay while the other is still serving as a template for protein production. Thus, studying the decaying mRNA also provides a snapshot of how proteins are produced.

The discovery was made almost by accident. As part of research into how DNA is transcribed into mRNA, co-researchers Vicent Pelechano and Wu Wei developed an in vivo method to count decaying mRNA molecules in the cell. mRNA has a protective ‘cap’ that prevents it from being degraded – once that cap is removed, the decay begins. The researchers spotted a pattern in the distribution of the ‘cap-less’ RNA that they didn’t expect.

The enzyme that degrades messenger RNA follows the ribosomes and stops every three nucleotides. IMAGE: V.Pelechano/EMBL

Vicent Pelechano, from the Steinmetz group at EMBL Heidelberg, explains: “The decaying RNA was thought to be of little interest biologically, so we were really surprised to see a pattern. We looked more deeply into it because it appeared to be linked to the genetic code, but we never expected it to lead to a completely new understanding of how mRNA and ribosomes interact.”

We never expected it to lead to a completely new understanding of how mRNA and ribosomes interact.

Proteins are produced from mRNA by ribosomes – ‘molecular machines’ that pass successively along the mRNA to translate its nucleotides into amino acids. It was thought that the mRNA only started to decay once the final ribosome had left it and translation was complete. In fact, the researchers were able to determine that the protective ‘cap’ is removed and degradation begins even while ribosomes are still associated with the mRNA.

They demonstrated that the enzyme degrading mRNA follows closely behind the ribosome, pausing at set points along the mRNA, usually after each group of three nucleotides, the section of code that relates to one amino acid. The team believes that this shows the enzyme pausing while translation goes on – allowing the ribosome to do its work and move on – before starting to degrade the mRNA previously protected by the ribosome.

This novel approach also opens up new avenues to study ribosomes. “Researchers studying ribosome activity usually use drugs to stall the ribosomes in place. This can alter the way we perceive their activity. We are simply looking for the molecules remaining from mRNA decay and determining their distribution. We believe this shows a more accurate picture of what is happening to the mRNA and the ribosome than was previously possible,” explains Wu Wei of Stanford University.


Materiały i metody

Various sources of information

TRNA copy numbers

The tRNA copy numbers of S. cerevisiae were downloaded from [40] other tRNA copy numbers were downloaded from [41].

Coding sequences

The coding sequences of the analyzed organisms were downloaded from the FTP site of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Protein abundance

Protein abundance measurements were downloaded from [42].

Gene Ontology associations

The Gene Ontology (GO) associations of S. cerevisiae genes are from [43].

Ekspresja genu

mRNA levels of E coli were downloaded from [18] mRNA levels of S. cerevisiae were downloaded from [15] mRNA levels of C. elegans come from the Gene Expression Omnibus (GEO) [44] (GDS1786).

Lists of ribosomal proteins

The lists of ribosomal proteins were downloaded from [43].

Measurements of mRNA folding

Measurements of mRNA folding in S. cerevisiae genes are from [28].

Ribosomal densities

We used two data sources of ribosomal density in S. cerevisiae. The first dataset comes from Arava i inni. [13] and includes measurements of ribosome number on each mRNA molecule (without information about the per-codon density) they were used to generate Figure 2. To obtain ribosomal densities, we normalized these values by the length of the ORFs.

The second dataset [15] includes measurements of ribosomal density at a single nucleotide resolution. This dataset is noisy at the single gene level (for example, the ribosomal density along a gene may change from a positive number to zero and, again, to a positive number) but when considering large enough sets of genes, it enables a good estimation of the spatial ribosomal density trend.

Data generated in this paper

The data that were generated in this study can be downloaded from [45].

Computing folding

Folding energy was calculated using the Vienna package [46].

Computing the tRNA adaptation index

We computed the tAI similarly to the way it was computed in the work of dos Reis i inni. [25]. This measure gauges the availability of tRNAs for each codon along an mRNA. As codon-anti-codon coupling is not unique due to wobble interactions, several anti-codons can recognize the same codon, with different efficiency weights (see dos Reis i inni. for all the inter-codon-anti-codon relations).

Pozwolić n i be the number of tRNA isoacceptors recognizing codon i. Pozwolić tCGNij be the copy number of the J-th tRNA that recognizes the i-th codon, and let S ij be the selective constraint on the efficiency of the codon-anti-codon coupling. We define the absolute adaptiveness, W i, for each codon i jak:

Z W i we obtain w i, which is the relative adaptiveness value of codon i, by normalizing the W i values (dividing them by the maximum of all 61 W i wartości).

The final tAI of a gene g, is the following geometric mean:

gdzie i kg is the codon defined by the k-th triplet on gene g oraz lg is the length of the gene (excluding stop codons).

We implemented one alteration compared to the computations of dos Reis i inni. we re-inferred the S ij values (appearing in the equation above) by performing a hill-climbing optimization of the Spearman correlation between protein abundance and translation efficiency in S. cerevisiae.

To this end we used the protein abundance measurements mentioned above.

ten S ij values can be organized in a vector (S vector) as described in [25] each component of this vector is related to one wobble nucleoside-nucleoside pairing: I:U, G:U, G:C, I:C, U:A, I:A, and so on.

Computing profiles of tRNA adaptation index, folding and charge

The local folding profile of a gene was defined as the vector of the folding values assigned to the sliding windows of length 40 nucleotides, that is:

gdzie FE is the folding energy.

All the genes in the genome were lined up once according to their start codon, and once according to their stop codon. The two profiles of mean folding energy were calculated as:

oraz Geny i is the number of genes with at least i + 1 40-nucleotide windows.

Local profiles of amino acid charge were computed in a similar way. First, we computed for each gene a vector of the charge assigned to the amino acids of the gene (+1 for a positive charge, -1 for a negative charge, 0 for a neutral amino acid). Next, we lined up the genes once according to their start codon, and once according to their stop codon, and computed the mean charge at each position.

The local profiles of tAI were computed in a similar way [8]. First, we computed for each gene a vector of the tAI assigned to the codons of the gene. Next, we lined up the genes once according to their start codon, and once according to their stop codon, and computed the mean tAI at each position (codon).

When we computed the reported profiles we considered all the genes (that is, we did not filter short genes) as we believe that the important feature in our context is the distance from the ATG in codons and not in percentage of the coding sequences (see also [8]). Most of the analyzed genes are longer than 200 codons in S. cerevisiae, for example, less than 20% of the genes are shorter than 200 codons (1,119 out of 5,861 a histogram of the S. cerevisiae gene lengths is shown in Figure S46 in Additional file 2).

Computing the profile of ribosomal density

The data for the ribosomal density profile were kindly supplied to us by Dr Ingolia. He sent us the data that were used for generating Figure 2d in their paper [15]. The data included read density at single nucleotide resolution as a function of position along the gene for well-expressed genes. The read density of each gene was normalized compared to itself (see details in [15]). We averaged the ribosomal density values of the nucleotides of each codon (as the data of Ingolia i inni. was at the at single nucleotide resolution) in each gene to obtain a per-codon measurement of ribosomal density. The genomic ribosomal density profile was computed in a way similar to the tAI, folding energy and charge profiles (the values of each codon were averaged over all the relevant genes).

Profiles of tRNA adaptation index, folding and charge for groups of genes

Profiles of coding sequence determinants for specific gene groups (for example, ribosomal proteins and GO slim groups) were computed as reported above. In these cases, however, we only considered the genes in the group.

The tRNA adaptation index as a predictor of protein abundance

Highly expressed genes have more efficient codons to improve their translation rate, the allocation of ribosomes, and the fitness of the organism [7, 14]. Thus, it is not surprising that in many organisms measures of codon bias such as the tAI exhibit significant correlation with protein abundance [5, 14, 40, 47]. w S. cerevisiae, for example, the correlation between tAI and protein abundance is higher than 0.6 [5, 40].

Linear regression and partial correlations

Pozwolić x oraz Tak denote two variables and Z = [Z1, Z2, Z3. ] denote a set of variables. The non-parametric multivariate analysis that is reported in this paper includes partial Spearman correlations of the from r(X,Y|Z). Roughly, if such a correlation is significant, it means that there is a relationship between x oraz Tak that can not be explained by the variables in Z. Specifically, we computed the correlation between ribosomal density (x) and one of the three coding sequence determinants (Tak tAI, charge, or folding energy) given the rest of the coding sequence's determinants. This analysis was performed by the commercial MATLAB software (see more details in MATLAB help. Founded in 1984, MathWorks employs 2200 people in 15 countries, with headquarters in Natick, Massachusetts, USA).

Pozwolić rxy denote the matrix of the correlation coefficient corresponding to the vectors x oraz tak. The partial correlation for two variables (x oraz tak) when controlling for a third variable (z), rxy_z, is computed according to the following formula (see, for example, [48]):

When we want to control for more than one variable we can use the formula above in a recursive way. For example, the correlation between x, y when controlling for z oraz w (the case that was reported in the paper) is:

In Equation 2, rxy_z, rwy_z, ryw_z, rxw_z, oraz ryw_z are computed using Equation 1.

ten P-values are computed for linear and rank partial correlations using a Student's T distribution for a transformation of the correlation. This is exact for linear partial correlations when the variables are normal, but if this is not the case it is a large-sample approximation. We also computed an empirical P-value that was based on 100 permutations of x oraz tak (the variables that are not controlled for). Empiryczne P-value is the frequency of the times that the partial correlation of the permutated vector was larger than the original one (it was significant for all variables).

The regressor mentioned in the main text is a linear regressor, where the explained variable is the ribosomal density and it is explained by the three coding sequence determinants (tAI, charge, and folding energy). As we mentioned above, the ribosomal density data are noisy thus, we utilized the smoothed version of all the profiles (five-point moving average the default parameter in MATLAB), but obtained very similar results without smoothing.

Simulation of ribosomal movement

The ribosomal movement model was based on the work of [34] (Figure 4c). According to this model, the nominal translation time of a codon is determined by the charge of the amino acid encoded by the codon (and the charge of the amino acids encoded by the neighboring codons upstream), the co-adaptation of the codon to the tRNA pool, and the strength of mRNA folding near (upstream of) the codon (see more details in the next section).

The actual translation time of a codon is also related to the potential presence of a ribosome downstream of it. If there is a proximal ribosome in front of it, the ribosome translating the codon is delayed until the ribosome downstream of it proceeds.

Other parameters of the simulations are: the minimum distance between two consecutive ribosomes (that is, the size of the ribosome) the ribosome binding time (initiation time) and the termination time (the time required for the ribosome to release the mRNA). The properties (for example, translation time) of the ribosome movement regime were computed at steady state (that is, when there was a negligible change in the translation time between consecutive ribosomes and after at least one ribosome completed the translation).

Stochastic model of translation elongation

This model is based on [36]. We model an mRNA with N codons as a chain of sites, each of which is labeled by i. The first and last codons, i = 1, i = N, are associated with the start and stop codons, respectively. At any time, T, attached to the mRNA are m(T) ribosomes. Each ribosome will cover ja codons. Any codon may be covered by a single ribosome or none. To locate a ribosome, we arbitrarily assume that the codon being translated is the one in the middle of the ribosome. For example, if the first (l + 1)/2 codons are not covered, a ribosome can bind to the first codon on the mRNA strand, and then it is said to be 'on codon i = 1'. A complete specification of the configuration of the mRNA strand is given by the codon occupation number: n i = 1 if codon i is being translated and n i = 0 otherwise. Note that when n i = 1 the (l - 1)/2 codons before and after codon i are covered by the ribosome that is on site i but since they are not the ones being translated the codon occupation number for them is equal to zero.

We will now specify the dynamics of this model. A free ribosome will attach to codon i = 1 with rate λ, provided that the first (l + 1)/2 codons on the mRNA are empty. An attached ribosome located at codon i will move to the next codon i + 1 with rate λ i, provided codon i + (l + 1)/2 is not covered by another ribosome. In case i + (l + 1)/2 > N (the ribosome is bulging out of the mRNA strand) an attached ribosome will move to the next codon with rate λ i. The translation rates λ i are inversely proportional to the mean translation times T i.

In order to simulate these dynamics, we assume that the time between initiation attempts is distributed exponentially with rate λ. Similarly, the time between jump attempts from site i do i + 1 is assumed to be exponentially distributed with rate λ i. Note that in the case of i = N the jump attempt is in fact a termination step. We define an 'event' as an initiation, jump attempt, or termination step. From our definition it follows that the time between events is exponentially distributed (minimum of exponentially distributed random variables) with rate:

Note that a jump attempt from codon i can only be made if there is a ribosome translating this codon and hence the rate μ(<n i>) depends on the set of site occupation numbers.

The probability that a specific event was an initiation attempt is given by λ/μ(<n i>). Similarly, the probability that a specific event was a jump attempt (or termination event) from site i to site i + 1 is given by n i λ i/μ(<n i>).

At each step of the simulation, we determine the nature of the event and the time passed till its occurrence by these rules. The set of site occupation numbers is then updated accordingly and the simulation proceeds to the next event. For example, if an initiation attempt was made, we check if the first (ja + 1)/2 codons on the mRNA are not covered. If so, we set n i = 1, otherwise the attempt fails and n i remains as is. If a jump attempt from codon i to codon i + 1 was made, we check if site i + (ja + 1)/2 is not covered. If so, we set n i = 0 i n i+1 = 1, otherwise the attempt fails and n i, n i+1 remain as is.

Starting with an empty mRNA strand we simulated the system for 250,000 steps. The system was then simulated for an additional 1,000,000 steps where we kept track of the total number of terminations and the total time that have passed from the point this phase started. The steady state rate of protein production was determined by dividing the number of termination events by the total time that has passed. The number of steps in the second stage was taken after observing that increasing the number of steps fourfold had a negligible effect on the predicted protein production rate.

Simulation of ribosomal movement: translation time of a codon

The translation time (or rate) of a codon (or the nominal speed of its translation) is based on three features of the coding sequence. First is the co-adaptation of the codon to the tRNA pool this value was based on the tAI. Second is the charge of the amino acids corresponding to the 31 neighboring upstream codons. The exit tunnel of a ribosome has negative charge and its length is around 31 amino acids [24] thus, amino acids with positive charge should slow the translation time of a ribosome [24]. At the beginning of the gene we considered the ja < 32 amino acids before the codon. Third is the folding energy of the neighboring downstream mRNA (40 nucleotides from the start of the codon). Stronger folding should slow the ribosome [49, 50]. When the ribosome translates a codon the A site of the ribosome lies in the middle of a stretch of mRNA that is physically occupied and unwound by the ribosome however, we are interested in modeling the delay/speed of the ribosome when it is translating this codon. At this stage, the mRNA folding before the ribosome is not relevant (the ribosome already translated these codons) the mRNA folding after the ribosome is relevant as this part of the mRNA should be unfolded by the helicase before the ribosome continues and moves forward.

The non-normalized time corresponding to the adaptation to the tRNA pool of the organism (tAIi) of codon i is: 1/tAIi.

The non-normalized time corresponding to the charge upstream of codon i is the sum of 'amino acid charges' among the 32 amino acids before the codon (where a neutral amino acid adds 0 to the sum, a positively charged amino acid adds 1 to the sum, and a negatively charged amino acid adds -1 to the sum the amino acids with positive charge are Arg and His, and Lys, while the amino acids with negative charge are Asp and Glu).

The non-normalized time corresponding to the folding energy downstream of codon i is the folding energy of the 40-nucleotides starting from the beginning of the codon (at the end of the sequence consider the 3' UTR).

The three normalized times were computed as follows: for each of the three features we divide their non-normalized value by their mean value along all the coding sequences and all windows, such that the mean of each of the normalized features will be 1.

Pozwolić Ntai(i) denote the 'normalized tRNA pool adaptation time' of codon i pozwolić Nch(i) denote the 'normalized charge time' of codon i pozwolić Nfe(i) denote the 'normalized folding energy time' of codon i.

The total time corresponding to the the i-th codon is a 1 N t a i ( i ) ⋅ e a 2 ⋅ N c h ( i ) + a 3 ⋅ N f e ( i ) .

We checked a1, a2, a3 in the range 0[1] and chose the values that optimized the correlation between the prediction of the ribosomal movement model (with the times above) and the actual ribosomal density. The correlation was based on the smoothed version of the real and predicted profiles (five-point moving average).

We obtained similar correlations when we used charge and folding before or after the codon, probably since the charge and folding in close windows in a gene tend to be similar and thus correspond to relatively similar speeds.

The size of the ribosome

Based on previous studies [8, 15, 30, 34, 51], the footprint of the ribosome on the transcript is 10 to 20 codons. As was mentioned before, the exit channel, which is in a different compartment of the ribosome, is longer (31 codons).

Profiles of mRNA secondary structure robustness

An mRNA sequence is robust to errors (point mutations) if point mutations tend to maintain its two dimensional structure (compared to random sequences with similar features).

We computed profiles of secondary structure robustness by performing the following steps for each window of length 40 nucleotides in each mRNA sequence. First, compute the folding structure and folding energy for each of the 40 × 3 one-nucleotide point mutations of the sub-sequence. Second, compute the distance of each mutated sequence from the original one in terms of absolute change in folding energy and the number of changes in the base-pair connections required for transferring one structure to the other (see, for example, [33]) we also plotted the mean number of point mutations (errors) that do not change the mRNA structure. Third, average the distances for each window.

As a control, we generated a randomized genome maintaining the codon bias and the amino acid sequences in the original genome. We compared the distribution of robustness obtained in the original genome and the randomized one.

To control for folding energy we divided the windows into five groups of equal size each group includes windows (over all genes) with similar folding energy. We plotted the profiles of folding energy robustness for each group separately.

To manage the extensive amount of computations needed for performing so many predictions of secondary structure, we employed a cluster of eight computers (each of which had an AMD Opteron(tm) 252 2. GHz processor, two cores, and 6 GB RAM) and a six-core computer (AMD Phenom(tm) II X6 1090T 3.2 GHz processor, six cores, 16 GB RAM) for several weeks.

Profiles of tRNA adaptation index and charge robustness

tRNA adaptation index and charge robustness profiles were computed in a similar manner. In the case of the charge, we computed for each window of 13 codons the number of point mutations that change the charge of the corresponding amino acids, and the mean change in the charge due to point mutations. In the case of the tAI, we computed for each window of 13 codons the average (over all point mutations) change in the tAI score of the codon, and the number of mutations that do not change the tAI of the codon. At the next step, we plotted the corresponding genomic profiles of robustness as was described for the folding energy robustness.

Robustness profiles: control for folding, tRNA adaptation index, and charge

To make sure that the robustness profiles are not trivially a result of the fact that the folding, tAI, and charge values are more extreme at the beginning of the coding sequences, we also analyzed the robustness profiles when considering only windows in certain ranges of folding, tAI, and charge, respectively (five bins of equal size).

It is also important to note that the codons (and similarly the folding or the charge) at the beginning of the coding sequence are less optimal than those at the end of it that is, relative to the immediate context, these codons are not necessarily the universally least efficient ones. For example, in highly expressed genes, these codons can be more efficient than all the codons of lowly expressed genes (Figure 2c).

Robustness profiles: assuming different probabilities of transition and transversion errors assuming that translation errors are relatively rare in the second position of the codons

To consider the fact that transcription errors that result in transition may have higher probability than transcription errors that result in transversion, we gave higher weights to the first type of errors when we computed the robustness scores. For example, if we assume that the probability of a transition error is twice the probability of a transversion error, the weight of such an error/mutation in the folding/charge/tAI robustness score of an mRNA window is two times the weight of transversion.

Similarly, in the case of charge robustness, to consider the fact that translation errors are very rare in the second position of codons [35], the weight of such an error/mutation in the charge robustness score of a mRNA window is lower (for example, 0.1) than the weight of an error in the first/third positions of the codons.

The length of the ramps

The length of the ramp (for a profile of tAI, charge, folding energy, or robustness) was computed similarly to [8] by comparing the mean (KS test) of sliding windows of length 13 codons to the mean of the rest of the corresponding profile (we considered the first 200 codons). The region at the beginning corresponding to a set of consecutive windows with a mean value significantly lower (P ≤ 0.05) than the mean of the entire profile was defined as the length of the ramp (the length of the ramp is the number of significant consecutive windows plus 12). We allowed this region to begin in the first five codons (if there was no significant window in this region, we declared that there is no ramp).

P-values for the folding, charge, and tAI profiles and the corresponding robustness profiles

We performed two statistical tests to check if the coding sequence determinants of a certain position were significant.

In the first test we checked if the value is more extreme than in other positions. This test does not take into account constraints on amino acid sequences. Firstly, however, we believe that selection for translation efficiency can also occur at the amino acid level - that is, there are many pairs of amino acids that, when substituted, do not change the function of the protein but can improve translation (see, for example, [52–54] about various distances between amino acids). The effect on translation and the coding sequence function is determined by the position of the codon along the coding sequence. Secondly, the effect of the various features of a codon on the translation rate of the ribosome can be significant, even though these profiles are not selected for.

The first test was performed by comparing (KS test) all the values in the positions within the ramp (see the previous section) to the rest of the positions. A similar test was performed also while testing subgroups of genes (for example, ribosomal proteins and GO groups).

In the second test we checked if the value is more extreme than the randomized version of the position. The randomized version of the genome was generated by maintaining the amino acid composition of each coding sequence and the codon bias of the genome, and sampling for each gene, a randomized version under these constraints. In this case, we compared the values of the positions within the ramp of the real genome and the randomized one by a KS test.

Predicted ribosomal density versus real ribosomal density in single genes

We used the linear regressor and the model that gave the best genomic ribosomal density to predict the ribosomal density at a resolution of single codons in each of the S. cerevisiae geny. Next, we plotted the graph (histograms) of distances between the window with the highest ribosomal density, and the window with highest predicted ribosomal density. We show that the distances tend to be small. We compared the distribution of distances corresponding to the real genome to a randomized genome, where the vectors of ribosomal densities were randomly permutated and show (by KS test) that the original mean is significantly smaller than the randomized mean.

Cross-validation tests and evaluation of the ribosomal movement model and the regressor

We compared the model and regressor with all three features to models that include only some of the features (for example, only charge and tAI without folding) by performing 20 cross-validation tests. In each test the model was trained based on 50% of the data (training sets) and was implemented on the second 50% of the data (test sets). We performed correlations between the ribosomal density and the predicted ribosomal density (by the model or the regressor) for the test sets in the full model and compared them to the correlations obtained for the partial models. Empiryczne P-value was computed as percentage of cases where the partial model was better then the full one on the same test set. Differences (between pairs of correlations) larger than 0.4% were assumed to be significant. We also compared, in a similar manner, the absolute sum of distances between the predicted and real genomic profile of ribosomal density.

In the case of the predicted profile of ribosomal density in single genes, we divided the genes into two groups as before, inferred the parameters of the model based on one of the groups and applied it to the second group (as reported above).

Site-by-site comparisons of predicted versus real ribosomal density

We wanted to test whether there is a direct relationship between the coding sequence determinants and the ribosomal translation rate (speed). Thus, we aimed at showing a significant relationship between local density of ribosomes [15] and charge, tAI, and folding profiles in single genes. Such a task comes with several caveats: 1) as mentioned, the measurements of ribosomal density are very noisy 2) ribosomes may interact with each other (jam) 3) often, the rate-limiting step may be initiation, which varies across genes.

To overcome these problems, we searched for the window with the highest ribosomal density in each individual gene and compared its position to the position with the slowest translation rate based on the three genomic features. This relationship should hold also when initiation is rate limiting and varies among genes, or when there are interactions between ribosomes.

Randomized profiles

To show that the genomic profiles reported in this study (the three ramps at the beginning of genes and the increased robustness to transcription errors at the beginning of genes) are not due to amino acid bias, we compared the genomic profile of folding energy with a profile of folding energy observed for a randomization of the genome. The genome was randomized in the following manner. Each codon was replaced by a random codon, according to the distribution (frequency) of codons coding the same amino acid in the genome of the organism. Thus, the randomized genomes maintained both the amino acid content of each coding sequence and the codon frequencies of the original genome.

Genomic profiles based on measurements of mRNA folding

We downloaded the mRNA measurement data from [28]. These data include for each nucleotide, in thousands of S. cerevisiae transcripts, the log ratio between the probability that it is in a double-stranded conformation and the probability that it is in a single-stranded conformation (parallel analysis of RNA structure (PARS) score [28]). If this value is higher, the position is involved in a double-stranded conformation and this is related to a higher folding energy. At the first stage (Figure S2 in Additional file 2), we computed for each position the mean PARS score (over all the genes) and plotted two profiles: 1) a simple average and 2) a weighted average (in which the weight of G or C, which are involved in pairings with three hydrogen bonds, is 3, while the weight of A or T, which are involved in pairings with two hydrogen bonds, is 2). We performed a KS test and compared each position to the remaining 600 'first' positions along the genes. We found that the first three positions have a significantly low PARS score (weak mRNA folding) while the next two positions have a significantly high PARS score (strong mRNA folding).

At the second stage we plotted this profile for highly expressed genes (top 10% of the genes in terms of mRNA-levels × ribosomal density) and lowly expressed genes (bottom 10% of the genes in terms of mRNA-levels × ribosomal density) and demonstrated that the high/low PARS score reported above is stronger for highly expressed genes (Figure S2 in Additional file 2 similar results were obtained for the weighted profile).

One problem of the PARS score is that it is global and not local (like the predicted local folding energy measure reported in this study) - a nucleotide has a higher PARS score even if it is connected to another nucleotide inside or outside the 40-nucleotide window. Thus, we used the inferred folding of complete mRNA sequences of yeast based on the PARS scores that are reported in the study of Kertesz i inni. [28]. We computed for each sliding window in each gene how many pairs of nucleotides where both nucleotides are within the window are connected. We plotted the mean genomic graph of these values (as we did with the predicted folding energy). The new graphs indeed look similar to the graph obtained based on predictions of mRNA folding (Figure S2 in Additional file 2).

Genomic profiles of pairs of identical slow codons

To study the distribution of pairs of identical slow codons along the coding sequences, we divided the codons into slow (the lowest 10% in terms of the tAI) and fast ones (the remaining codons). We computed the profile of the mean number of pairs of identical slow codons in each position in E coli oraz S. cerevisiae. We compared this profile to those obtained under two randomization regimes: 1) when controlling for amino acid content and codon bias as mentioned above and 2) when permutating only the slow codons in each gene (that is, a control that considers the fact that there are positions, such as the ramp, with more slow codons). We also computed this profile separately for highly and lowly expressed genes in these organisms.


Obejrzyj wideo: COVID-19. Szczepionki mRNA - zagrożenia czy nadzieje? (Sierpień 2022).