Informacja

10.8: Zielone algi — prekursory roślin lądowych — biologia

10.8: Zielone algi — prekursory roślin lądowych — biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Streptofity

Do niedawna wszystkie fotosyntetyczne eukarionty uważano za członków królestwa Plantae. Dzieje się tak, ponieważ oprócz ich zdolności do wychwytywania energii świetlnej i wiązania CO2, brakuje im wielu cech strukturalnych i biochemicznych, które odróżniają rośliny od protistów. Zielone algi zawierają te same karotenoidy i chlorofil a oraz b jako rośliny lądowe, podczas gdy inne glony mają oprócz chlorofilu inne pigmenty pomocnicze i typy cząsteczek chlorofilu a. W związku z tym rośliny lądowe i blisko spokrewnione zielone algi są teraz częścią nowej grupy monofiletycznej zwanej Streptophyta.

Pozostałe zielone glony, które należą do grupy zwanej Chlorophyta, obejmują ponad 7000 różnych gatunków, które żyją w słodkiej lub słonawej wodzie, w wodzie morskiej lub w łatach śniegu. Kilka zielonych alg przetrwa nawet w glebie, pod warunkiem, że jest ona pokryta cienką warstwą wilgoci, w której mogą żyć. Okresowe okresy suszy zapewniają glonom selektywną przewagę, które mogą przetrwać stres wodny. W szczególności niektóre zielone algi mogą już być znajome Spirogyra i desmidy. Ich komórki zawierają chloroplasty o zawrotnej różnorodności kształtów, a ich ściany komórkowe zawierają celulozę, podobnie jak rośliny lądowe. Niektóre zielone algi to pojedyncze komórki, takie jak Chlorella oraz Chlamydomonas, co zwiększa niejednoznaczność klasyfikacji zielenic, ponieważ rośliny są wielokomórkowe. Inne glony, jak Ulva (powszechnie zwana sałatą morską), tworzą kolonie (ryc. 1).

Reprodukcja zielonych alg

Zielone algi rozmnażają się zarówno bezpłciowo, poprzez fragmentację lub rozproszenie zarodników, jak i płciowo, wytwarzając gamety, które łączą się podczas zapłodnienia. W organizmie jednokomórkowym, takim jak Chlamydomonas, nie ma mitozy po zapłodnieniu. W wielokomórkowym Ulva, sporofit rośnie przez mitozę po zapłodnieniu (i tym samym wykazuje przemianę pokoleń). Obie Chlamydomonas oraz Ulva produkują wiciowce gamet.

Charales

Do ramienic zalicza się kilka różnych rzędów glonów, z których każdy sugeruje się, że są najbliższymi krewnymi roślin lądowych: Charales, Zygnematales i Coleochaetales. Historia Charales sięga 420 milionów lat. Żyją w różnych siedliskach słodkowodnych i różnią się wielkością od kilku milimetrów do metra długości. Reprezentatywny rodzaj to Chara (Rysunek 25.8), często nazywany trawą piżmową lub skunkweed ze względu na nieprzyjemny zapach. Duże komórki tworzą plecha: główna łodyga alg. Gałęzie wyrastające z węzłów zbudowane są z mniejszych komórek. Męskie i żeńskie struktury rozrodcze znajdują się w węzłach, a plemniki mają wici. Mimo że Chara wygląda powierzchownie jak niektóre rośliny lądowe, główną różnicą jest to, że łodyga nie ma tkanki podporowej. Jednak Charale wykazują szereg cech, które są istotne dla przystosowania się do życia na lądzie. Wytwarzają związki lignina oraz sporopollenina, i tworzą plasmodesmata, które łączą cytoplazmę sąsiednich komórek. Chociaż cykl życiowy Charales jest haplontyczny (główna forma jest haploidalna, a diploidalne zygoty tworzą się, ale istnieją krótko), jajo, a później zygota, tworzą się w chronionej komorze na haploidalnej roślinie rodzicielskiej.

Coleochaetes są formami wielokomórkowymi rozgałęzionymi lub podobnymi do dysku. Mogą produkować zarówno seksualnie, jak i bezpłciowo, ale cykl życiowy jest zasadniczo haplontyczny. Niedawna obszerna analiza sekwencji DNA ramienic wskazuje, że Zygnematales są bliżej spokrewnione z embriofitami niż Charales czy Coleochaetales. Zygnematales obejmują znany rodzaj Spirogyra, a także desmidy. W miarę udoskonalania technik analizy DNA i pojawiania się nowych informacji na temat genomiki porównawczej, związki filogenetyczne między ramienicami a roślinami lądowymi będą nadal badane, aby uzyskać zadowalające rozwiązanie zagadki pochodzenia roślin lądowych.


Rośliny

U mszaków gametofity są największą i najbardziej rzucającą się w oczy fazą cyklu życiowego.

Gametofit jest haploidalny i wytwarza haploidalne gamety przez mitozę.

Składniki odżywcze są przenoszone z rodzica do zarodka przez komórki transferowe łożyska.

Komórki diploidalne zwane sporocytami przechodzą mejozę, aby wytworzyć haploidalne zarodniki.

Gametangia żeńska, zwana archegonią, wydaje jaja i jest miejscem zapłodnienia.

Ryzoidy zakotwiczają gametofity w podłożu.

Torfowiec lub „mech torfowy” tworzy rozległe złoża częściowo zepsutego materiału organicznego zwanego torfem.

Łyko składa się z żywych komórek i rozprowadza cukry, aminokwasy i inne produkty organiczne.

Umożliwiają roślinom naczyniowym wchłanianie wody i składników odżywczych z gleby.

Liście są podzielone na dwa typy:
Mikrofile, liście jednożyłowe.
Megafile, liście o silnie rozgałęzionym układzie naczyniowym.


Tło

Sterole są niezbędnymi składnikami wszystkich komórek eukariotycznych [1]. W roślinach wyższych odgrywają one strukturalną rolę w żywotności komórek, embriogenezie, tworzeniu wzorców, podziale komórek, biogenezie chloroplastów oraz modulacji aktywności i dystrybucji białek związanych z błoną, takich jak enzymy i receptory [2, 3]. Ponadto sterole są prekursorami wielu cząsteczek sygnałowych, które regulują wzrost i rozwój roślin i zwierząt, takich jak owadzie ekdysteroidowe hormony linienia [4], ssacze hormony steroidowe [5] i roślinne hormony brasinosteroidowe (BR) [6].

Sterole należą do klasy izoprenoidów pochodzących z pirofosforanu izopentenylu (IPP), uniwersalnego prekursora izoprenoidów. U zwierząt i grzybów szlak cytoplazmatycznego kwasu mewalonowego (MVA) jest jedyną drogą biosyntezy IPP, budulca lanosterolu, który jest następnie metabolizowany do cholesterolu u zwierząt i ergosterolu u grzybów [7]. W roślinach wyższych IPP może pochodzić ze szlaku MVA lub plastydialnego szlaku 1-deoksyksylulozo-5-fosforanu lub fosforanu metyloerytrytolu (MEP), mimo że ten pierwszy jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do biosyntezy steroli [8, 9]. w Arabidopsis, mutanty biosyntezy steroli można podzielić na dwie odrębne grupy: mutanty niezależne od BR, z defektami genów na szlaku od cykloartenolu do 24-metylenofenolu [10] oraz mutanty zależne od BR, z defektami genów w tej ostatniej części szlaku biosyntezy steroli (od 24-metylenofenolu do kampesterolu, uważanego za prekursora BRs) [11]. Oprócz tego, że służą jako prekursory BR, sterole wydają się odgrywać różne funkcje sygnalizacyjne podczas rozwoju roślin, ponieważ fenotypów mutantów biosyntezy steroli nie można uratować przez dodanie egzogennego BR [12].

Współregulacja syntezy steroli i produkcji kwasów tłuszczowych (FA) jest niezbędna do utrzymania równowagi biosynteza-obrotowość błon podczas wzrostu komórkowego [13]. U zwierząt sterole i FA są skoordynowane regulowane przez system sprzężenia zwrotnego, w którym pośredniczy konserwatywna rodzina czynników transkrypcyjnych zwanych białkami wiążącymi elementy regulatorowe steroli (SREBP), które kontrolują kaskadę enzymów biosyntezy endogennego cholesterolu, FA, triacyloglicerolu (TAG) i fosfolipid [14, 15]. Aktywowany SREBP wiąże się z elementami odpowiedzi sterolowej w regionach promotora i/lub wzmacniacza genów docelowych i indukuje transkrypcję co najmniej 30 genów syntezy cholesterolu i lipidów (w szczególności tych kodujących enzymy ograniczające szybkość, takie jak hydroksy-metylo-glutarylo-CoA reduktaza, HMGR i syntaza FA typu I, FAS) [16]. Manipulowanie tą kaskadą regulatorową u myszy transgenicznych spowodowało odpowiednio 6- i 22-krotny wzrost zawartości cholesterolu i zawartości TAG, aw konsekwencji masywną stłuszczenie wątroby [17].

Mikroalgi są obiecującym surowcem do zrównoważonej i skalowalnej produkcji biopaliw [18], jednak niewiele szczepów mikroglonów występujących w naturze jest obdarzonych szeroką gamą cech wymaganych przez wielkoskalowy i ekonomicznie konkurencyjny system produkcji [19]. Dlatego pilne jest zidentyfikowanie cząsteczek i mechanizmów regulujących wzrost, rozwój i reakcje na stres mikroglonów w celu poprawy szczepu. Sterole w mikroglonach wykazują ogromne zróżnicowanie ze względu na wysoki stopień niejednorodności filogenetycznej, ogromną liczbę rodzajów i duży dystans ewolucyjny między wieloma z nich [20, 21]. Od dawna wykazano, że skład steroli w mikroglonach zmienia się w zależności od zmian fazy wzrostu, widma światła lub temperatury, co sugeruje ważną, ale w dużej mierze nieznaną rolę steroli [22]. Dlatego też manipulacja biosyntezą i regulacją steroli oferuje potencjał do inżynierii produkcji lipidów. Badanie mechanizmu regulacyjnego lipogenezy zależnej od steroli w mikroalgach może dostarczyć nowych strategii i celów dla zwiększonej produkcji lipidów w mikroalgach. Jednak niewiele wiadomo na temat roli, biosyntezy i regulacji steroli w mikroalgach, aw szczególności, czy i jak metabolizm steroli i FA jest współregulowany.

Nanochloropsis spp. to rodzaj jednokomórkowych fotosyntetycznych mikroalg należących do heterokontów. Są szeroko rozpowszechnione w środowisku morskim, a także w wodach słodkich i słonawych. Algi te są przedmiotem zainteresowania przemysłowego, ponieważ szybko rosną i mogą syntetyzować duże ilości TAG i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych o wysokiej wartości (np. kwas eikozapentaenowy) [23]. Genomy wielu gatunków roślin oleistych Nanochloropsis spp. zostały zsekwencjonowane i opatrzone adnotacjami [23–27]. Zatrudnienie oleistej mikroalgi przemysłowej N. oceanica IMET1 jako model, badanie to miało na celu określenie składu steroli i ścieżki biosyntezy w mikroglonach, zbadanie roli biosyntezy steroli w fotosyntezie i wzroście, zbadanie wpływu dostarczania światła i azotu oraz zbadanie wpływu poziomów steroli na akumulację FA. Nasze odkrycia poszerzają wiedzę na temat funkcji steroli w mikroalgach i powinny wspierać racjonalną inżynierię genetyczną lub procesową w produkcji biopaliw lub innych bioproduktów o wartości dodanej w oparciu o mikroalgi.


Struktura i mechanizm unikalnego ewolucyjnie enzymu roślinnego izomerazy chalkonowej

Izomeraza chalkonu (CHI) katalizuje wewnątrzcząsteczkową cyklizację chalkonu syntetyzowanego przez syntazę chalkonu (CHS) do (2S)-naringenina, związek niezbędny w biosyntezie pigmentów antocyjanów, induktory ryzobium geny brodawek i fitoaleksyny przeciwdrobnoustrojowe. Struktura krystaliczna o rozdzielczości 1,85 Å lucerny CHI w kompleksie z (2S)-naringenina ujawnia nowy fałd β-kanapkowy o otwartej twarzy. Obecnie białka o homologicznych sekwencjach pierwszorzędowych występują tylko w roślinach wyższych. Topologia szczeliny miejsca aktywnego określa stereochemię reakcji cyklizacji. Analiza struktury i mutacji sugeruje mechanizm, w którym komplementarność kształtu szczeliny wiązania blokuje substrat w ograniczonej konformacji, która umożliwia przebieg reakcji ze stałą szybkości drugiego rzędu zbliżającą się do granicy kontrolowanej dyfuzji. Ta struktura rodzi pytania o historię ewolucyjną tego unikalnego strukturalnie enzymu roślinnego.


2. MATERIAŁY I METODY

2.1 Warunki hodowli glonów

P. tricornutum (CCMP2561), otrzymany z kolekcji kultur Narodowego Centrum Kultury Fitoplanktonu Morskiego Provasoli-Guillard, Bigelow Laboratory for Ocean Sciences, utrzymywano i hodowano w pożywce F/2 zawierającej 20 g/L soli morskiej. Szczep oznaczono jako Pt1 o wrzecionowatym morfotypie (De Martino i wsp., 2007). W skrócie, 10 ml płynnej pożywki F/2 zaszczepiono komórkami z płytek agarowych i glony hodowano w warunkach tlenowych w 50 ml kolbach w 23°C przez 6 dni (ręczne wytrząsanie dwa razy dziennie) oświetlone ciągłym światłem 30 µE m − 2 s -1 (zimnobiałe światło świetlówki, od góry). Komórki alg zaszczepiono następnie w stężeniu 10% (obj./obj.) do 250 ml kolb do wzrostu z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr./min w wytrząsarce orbitalnej (Zhichu) i stałym naświetlaniu 30 µE m-2 s-1. Jako nasiona do eksperymentów wykorzystano komórki glonów wyhodowane do późnej fazy wykładniczej.

W celu leczenia pozbawienia azotu (ND), nasiona zebrano, przemyto dwukrotnie pożywką F/2 bez azotu i ponownie zawieszono w tej pożywce. Komórki ponownie zawieszone w pożywce F/2 (nasycone azotem, NR) zastosowano jako kontrolę. Oba miały początkową liczbę komórek 1,5 x 106 ml -1 i hodowano przez 4 dni z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obrotach na minutę i stałym oświetleniu 30 µE m -2 s -1 . Do porównania między szczepami typu dzikiego (WT) i transgenicznymi P. tricornutumkomórki zaszczepiono do wyjściowej liczby komórek 5 x 105 ml -1 i pozostawiono do wzrostu przez 12 dni z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obrotach na minutę i stałym oświetleniu 30 µE m -2 s -1 .

2.2 Klonowanie i analiza in silico P. tricornutum DGAT

Aby uzyskać sekwencję kodującą pełnej długości PtDGAT1, jego nieulegające translacji regiony zostały najpierw określone przez szybką amplifikację końców cDNA (RACE)-PCR 5' i 3' przy użyciu zestawu SMARTer RACE 5'/3' Kit (TaKaRa). Następnie pary starterów zastosowano do amplifikacji pełnej długości sekwencji kodującej, którą zweryfikowano przez sekwencjonowanie i zdeponowano w NCBI GenBank (numer dostępu MN061782). Sekwencje PtDGAT2A Poprzez PtDGAT2D oraz PtDGAT3 zostały pobrane z NCBI GenBank (JX469835, JQ837823, JX469836, JX469837 i XM_002184438).

Dopasowanie sekwencji polipeptydów DGAT z różnych organizmów przeprowadzono przy użyciu ClustalX2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/), a drzewo filogenetyczne wygenerowano przy użyciu MEGA6 (Tamura i wsp., 2013). Transbłonowe helisy PtDGATs przewidywano przy użyciu TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).

2.3 Izolacja RNA i ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym

Ekstrakcję całkowitego RNA (z około 107 komórek alg) i usuwanie skażonego DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu do ekstrakcji RNA roślinnego (TaKaRa). Po syntezie cDNA przeprowadzono ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) na systemie 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) z SYBR ® Premix Ex Taq™ II (TaKaRa), zgodnie z naszymi wcześniej opisanymi procedurami (Wei i in. ., 2017 ). Sekwencje starterów stosowane do qPCR wymieniono w Tabeli S1. Poziom ekspresji mRNA PtDGAT geny znormalizowano stosując gen aktynowy jako kontrolę wewnętrzną.

2.4 Funkcjonalne uzupełnienie PtDGAT w drożdżach z niedoborem TAG

Sześć PtDGAT geny amplifikowano metodą PCR stosując cDNA jako matrycę i klonowano do drożdżowego wektora ekspresyjnego pYES2-CT (Invitrogen), stosując zestaw In Fusion Advantage PCR Cloning Kit (TaKaRa). Startery PCR do klonowania wymieniono w Tabeli S1. Każdy z rekombinowanych plazmidów, po potwierdzeniu przez sekwencjonowanie, wprowadzono do szczepu poczwórnego mutanta H1246 z niedoborem TAG Saccharomyces cerevisiae (Sandager i wsp., 2002). Pusty wektor (EV) pYES2-CT zastosowano jako kontrolę negatywną. Transformanty drożdży, po zweryfikowaniu metodą Colony PCR, hodowano w pożywce SD/-Ura zawierającej 2% (wag./obj.) galaktozy w celu indukcji ekspresji transgenu. W eksperymencie z wolnymi kwasami tłuszczowymi, kwas linolowy (C18:2), kwas α-linolenowy (C18:3n3) i kwas eikozapentaenowy (C20:5n3) były podawane do hodowli drożdży po indukcji galaktozy w stężeniu 100 µM, jako opisane przez Mao i in. (2019). Po 2 dniach hodowli hodowle drożdży zebrano do analizy lipidów i barwienia fluorescencyjnego.

2.5 Test in vitro PtDGAT

Indukcja heterologicznej ekspresji PtDGAT geny w H1246 i preparat mikrosomów z tych szczepów drożdży zawierających PtDGAT przeprowadzono zgodnie z naszymi wcześniej opisanymi procedurami (Liu i wsp., 2017). Każdą z przygotowanych frakcji mikrosomalnych ponownie zawieszono w buforze do przechowywania (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glicerol) do dalszych testów in vitro.

Test DGAT in vitro przeprowadzono w układzie reakcyjnym 200 µl, który składa się z 20 µg białka mikrosomalnego, 250 µM obu substratów acylo-CoA i DAG oraz 10 mM MgCl2 w buforze fosforanu potasu (Liu i wsp., 2017 ). Jako akceptor acylowy zastosowano DAG (16:1/16:1), natomiast jako donor acylowy zastosowano 16:0-CoA, 16:1-CoA i C20:5-CoA, wszystkie zakupiono od Larodan Fine Chemicals.

2.6 Nadekspresja PtDGAT w P. tricornutum

Sekwencje kodujące PtDGAT1, PtDGAT2A Poprzez PtDGAT2D oraz PtDGAT3 były subklonowane do P. tricornutum wektor ekspresyjny peGFP (Zhang & Hu, 2014), przy użyciu zestawu In Fusion Advantage PCR Cloning Kit (TaKaRa). Startery PCR do klonowania wymieniono w Tabeli S1. Transformacja P. tricornutum za pomocą elektroporacji zgodnie z naszymi wcześniej opisanymi protokołami (Zhang i Hu, 2014). Przypuszczalne transformanty wyselekcjonowane na stałym podłożu F/2 zawierającym 75 μg/ml zeocyny zweryfikowano za pomocą genomowej PCR. Następnie przeprowadzono qPCR w celu określenia poziomu ekspresji transgenów w wybranych transformantach. Do dalszych eksperymentów wybrano dwa szczepy o najwyższym poziomie ekspresji dla każdego transgenu.

2.7 Analizy mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej

Do obserwacji neutralnych lipidów w P. tricornutum i komórki drożdży, najpierw wybarwiono fluorescencyjnym BODIPY™ 505/515 (Invitrogen) o stężeniu roboczym 1 µg/ml przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie zwizualizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym Olympus BX51 (Olympus) ze wzbudzeniem w 488 nm i emisja od 505 do 530 nm. W celu podkomórkowej lokalizacji PtDGAT, odpowiednie transgeniczne szczepy alg wizualizowano pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym Leica TCS SP8. Fluorescencję GFP obserwowano przy wzbudzeniu przy 488 nm i emisji przy 500–525 nm, a autofluorescencję chlorofilu przy wzbudzeniu przy 488 nm i emisją przy 650–750 nm. Aby obserwować jądro komórek alg, wybarwiono je Hoechst 33342 (Invitrogen) w stężeniu 5 µM przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie uwidoczniono z wzbudzeniem przy 405 nm i emisją przy 425–475 nm.

2.8 Metody analityczne

Liczenie komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym i grawimetryczne oznaczanie suchej masy dla P. tricornutum postępował zgodnie z naszymi wcześniej opisanymi procedurami (Liu i wsp., 2019). Maksymalna wydajność kwantowa PSII, Fv/Fm lub FmFo/Fm, zmierzono za pomocą fluorometrii z modulacją amplitudy impulsu (PAM) (Water-PAM, Walz), stosując 2-godzinną komórkę algową przystosowaną do ciemności (Liu i wsp., 2019): Fo został zarejestrowany w słabym świetle (<10 μmol m -2 s -1 , pik przy 650 nm) i Fm był pod nasycającym impulsem (0,8 s) światła czerwonego (3000 μmol m-2 s-1, maksimum przy 660 nm). Zawartość białka w P. tricornutum komórki określono według Meijera i Wijffelsa (1998), stosując liofilizowane próbki alg. Zawartość węglowodanów w P. tricornutum komórki oznaczono metodą kolorymetryczną (Renaud et al., 1999 ), po hydrolizie liofilizowanych próbek alg 4 MH2WIĘC4.

Lipidy z drożdży i P. tricornutum komórki wyekstrahowano chloroformem–metanolem (2:1, v/v), jak wcześniej opisali Mao i in. (2019). Do analizy metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) wyekstrahowane lipidy rozdzielono na płytce TLC z żelem krzemionkowym 60 (Merck) przy użyciu mieszaniny heksan/eter tert-butylometylowy/kwas octowy (80/20/2, obj.) jako faza ruchoma (Liu i in., 2016 ). Po rozdzieleniu, TAG na płytce TLC wizualizowano za pomocą pary jodu, odzyskiwano i transestryfikowano 1,5% kwasem siarkowym w metanolu w 85°C przez 2,5 godz. Całkowite lipidy z P. tricornutum a kultury drożdży i produkty reakcji z testów DGAT in vitro poddano bezpośredniej transestryfikacji.

Estry metylowe kwasów tłuszczowych otrzymane z transestryfikacji lipidów analizowano przy użyciu kapilarnego chromatografu gazowego Agilent 7890 wyposażonego w detektor spektrometrii masowej 5975 C i kolumnę kapilarną HP-88 (60 m × 0,25 mm Agilent Technologies), zgodnie z naszymi wcześniej opisanymi procedurami (Liu i in., 2016).


Eksperymentalne procedury

Materiał roślinny i warunki wzrostu

Zmutowane i transgeniczne rośliny Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) znajdowały się na tle dzikiego typu Col-0. Nasiona Arabidopsis wysiano na kompoście, rozwarstwiono przez 3 dni w temperaturze 4°C i hodowano w temperaturze 20°C, w atmosferze CO o temperaturze otoczenia2 (może. 400 μmol/mol), przy wilgotności względnej 70% i poniżej 100 μmol fotonów/m2/s w cyklach 12 godzin światła/12 godzin ciemności, o ile nie zaznaczono inaczej.

Do analizy linii transgenicznych porównywano homozygotyczną insercję lub linie outsegregant typu dzikiego (T3). Tam, gdzie nie były dostępne outsegreganty typu dzikiego, homozygotyczne linie insercyjne porównywano z roślinami Col-0 z zasobów nasion w tym samym wieku, wytworzonych w podobnych warunkach. Rośliny tytoniowe (Nicotiana benthamiana L.) hodowano w warunkach szklarni (minimum 20°C, naturalne światło uzupełnione, aby zapewnić co najmniej 12 godzin światła). Białka znakowane przez Wenus eksprymowano w dzikim szczepie Chlamydomonas cMJ030 (CC-4533) (Zhang i inni., 2014 ). Komórki utrzymywano w stałym słabym świetle (

10 μmol fotonów/m2/s) w temperaturze pokojowej na 1,5% (wag./obj.) płytkach agarowych zawierających Tris–octan–fosforan (TAP) (Kropat i inni., 2011 ). Do obrazowania komórki hodowano w płynnej pożywce TAP do stężenia 106 komórek/ml, osadzonych przez odwirowanie (1000 g, 4 min), ponownie zawieszony w pożywce minimalnej Tris-fosforan (T-P) (Kropat i inni., 2011 ) i hodowane przez 24 h w otaczającym CO2 przed obrazowaniem.

Klonowanie i ekspresja składników CCM w Chlamydomonas

Otwarte ramki odczytu (ORF) genów Chlamydomonas poddano ekspresji w ramce z Wenus z PsaD promotor przy użyciu wektora pLM005. ORF amplifikowano z genomowego DNA przy użyciu polimerazy Phusion Hotstart II (Thermo Fisher Scientific, www.thermofisher.com) z odpowiednimi oligonukleotydami w tabeli S1. Pocięty przez HpaI wektor pLM005 i produkty PCR oczyszczono na żelu i złożono przez montaż Gibsona (Gibson i inni., 2009 ). Ze względu na dużą długość genu HLA3, sklonowano go w dwóch fragmentach, a następnie złożono w wektorze pLM005 przez składanie Gibsona. Wektor pLM005 zawiera gen AphVIII odpowiedzialny za oporność na paromomycynę u Chlamydomonas i oporność na ampicylinę do selekcji bakteryjnej. Wszystkie połączenia konstruktów zweryfikowano za pomocą sekwencjonowania Sangera. Konstrukty zostały przekształcone w Chlamydomony przez elektroporację, jak w Zhang i inni. (2014). W skrócie, 250 µl 2 x 108 komórek/ml transformowano 14,5 ng/kbp plazmidu pociętego EcoRV w 16°C. Komórki rozprowadzono na 86 ml płytkach agarowych TAP zawierających paromomycynę (20 μg/ml) i trzymano w słabym świetle (

10 μmol fotonów/m 2 /s) aż kolonie były

Średnica 2-3 mm. Płytki przesiano pod kątem kolonii fluorescencyjnych za pomocą skanera fluorescencyjnego Typhoon TRIO (GE Healthcare, www.gelifesciences.com) z długościami fal wzbudzenia/emisji 532 nm/520-555 nm dla Wenus i 633 nm/630-670 nm dla autofluorescencji chlorofilu.

Klonowanie i ekspresja składników CCM w tytoniu i Arabidopsis

Geny sklonowano z cDNA pochodzącego z Chlamydomonas (szczep CC-4886, Chlamydomonas Resource Center). Startery zostały zaprojektowane z sekwencji dostępnych w Phytozome v10.2 (Chlamydomonas reinhardtii v5.5 [Augustus u11.6], http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii) (szczegóły dotyczące oligonukleotydów patrz Tabela S1). Sekwencje genów dla LCIA oraz HLA3 zostały zoptymalizowane pod kątem kodonów pod kątem ekspresji w roślinach wyższych i zsyntetyzowane de novo (DNA2.0, CA, USA) (Figura S7), następnie sklonowane do wektorów wejścia Gateway (pCR® 8/GW/TOPO® TA Cloning® Kit) przy użyciu Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen™ Life Technologies, www.lifetechnologies.com), a następnie sklonowane do docelowych wektorów binarnych pK7FWG2,0 (Karimi i inni., 2002 ) lub pGWB5 (Nakagawa i inni., 2009 ). Zespół Gibsona wykorzystano do wygenerowania fuzji genów peptydu tranzytowego. Wektory binarne zostały przekształcone w Agrobacterium tumefaciens (AGL1) dla przejściowej ekspresji genów w liściach tytoniu (Schöb i inni., 1997) lub stabilne wstawienie do roślin Arabidopsis przez zanurzanie kwiatów (Clough i Bent, 1998). Badania koekspresji przeprowadzono z wektorem WAVE131 zestawu markerów „falowych” (Geldner i inni., 2009 ) i wektor mt-rb (Nelson i inni., 2007 ) odpowiednio dla lokalizacji błony plazmatycznej i mitochondriów.

Ekstrakcja DNA, PCR i analiza białek

Do przeszukiwania transgenicznych linii Arabidopsis, genomowy DNA wyekstrahowano z dojrzałych, nie kwitnących rozet roślin T1, jak opisano w Li i Chory (Li i Chory, 1998). PCR przeprowadzono jak w McCormick i Kruger (2015). Tam, gdzie to możliwe, lokalizację wstawek genów potwierdzono metodą TAIL PCR, jak opisał Liu i inni. ( 1995 ). Homozygotyczne linie insercyjne zidentyfikowano w pokoleniu T2 albo przez PCR albo przez stosunki segregacji siewek na zawierających kanamycynę płytkach Murashige i Skoog (MS) (0,5x) zawierających kanamycynę.

Względne poziomy białek LCIA:GFP i HLA3:GFP w liściach potwierdzono metodą immunoblot. Około 10 μg białka z całych 28-dniowych rozet (100 mg świeżej masy) frakcjonowano metodą SDS-PAGE na 10% (wag./obj.) żelu akrylamid:bisakrylamid (40:1) przeniesionym na membranę PVDF, badaną myszą IgG anty-GFP2a w rozcieńczeniu 1:1000 (Santa Cruz, http://www.scbt.com/) i uwidoczniono za pomocą koziego anty-mysiego IgG sprzężonego z HRP2a przy rozcieńczeniu 1:50 000. Aktywność HRP wykryto przy użyciu Supersignal Ultra (Pierce, www.piercenet.com) zgodnie z instrukcjami producenta.

Testy ekspresji w oocytach i wychwytu wodorowęglanów

Zsyntetyzowane sekwencje genów dla dojrzałych LCIA (mLCIA) lub HLA3 pozbawione kodonu stop wklonowano do wektora ekspresyjnego Vivid Colors™ pcDNA™ 6.2/EmGFP (Invitrogen™ Life Technologies) w celu wytworzenia fuzji mLCIA- lub HLA3-GFP. W przypadku LCIA, peptyd N-końcowej sekwencji tranzytowej (73 aa) został usunięty i zastąpiony sekwencją „GACATG”, aby dodać sekwencję Kozaka i nowy kodon start. W przypadku HLA3 bezpośrednio przed kodonem start dodano „GAC”. Aby wygenerować równoważne wektory pozbawione znacznika fluorescencyjnego, zastosowano złożenie Gibsona w celu dodania kodonu stop do mLCIA lub HLA3 i usunięcia sekwencji GFP (720 pz). Plazmidy linearyzowano za pomocą AvrII lub StuI (Roche, www.roche.co.uk) i zsyntetyzowano mRNA z czapeczką stosując zestaw mMESSAGE mMACHINE® T7 Transscription Kit (Ambion® Life Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta. Dojrzały mRNA LCIA lub HLA3 ulegał ekspresji w oocytach, jak opisał Feng i inni. (2013). Oocytom Xenopus wstrzyknięto 50 nl mRNA (1 μg/μl) lub wodę potraktowaną pirowęglanem dietylu (DEPC) jako kontrolę. Testy wychwytu wodorowęglanów i obrazowanie konfokalne przeprowadzono 3 dni po wstrzyknięciu zgodnie z protokołem zaadaptowanym z Mariscal i inni. (2006). Oocyty inkubowano w świeżej pożywce MBS (88 m m NaCl, 1 m m KCl, 2,4 m m NaHCO3, 0,71 mln m CaCl2, 0,82 mln m MgSO4 i 15 m m HEPES, pH 7,4), zawierający 0,12 m m NaHCO3 (1,85 GBq/mol NaH 14 CO3). Po 10 minutach oocyty przemyto trzykrotnie lodowatym MBS i poddano lizie w 200 µl SDS (10% [w/v]) i zmierzono radioaktywność zatrzymaną w poszczególnych oocytach.

Kwantyfikacja chlorofilu

Chlorofil wyekstrahowano ze sproszkowanych krążków liści w lodowatym 80% (obj./obj.) acetonie i 10 mm Tris–HCl, a stężenie zmierzono według Porra i inni. ( 1989 ).

Pomiar parametrów fotosyntezy

Wskaźniki wymiany gazów określono za pomocą przenośnego analizatora gazów na podczerwień LI-6400 (LI-COR Biosciences, http://www.licor.com/) na szóstym lub siódmym liściu dojrzałego, niekwitnącego wieku od 35 do 45 dni. rozety wyhodowane w dużych doniczkach w celu wygenerowania powierzchni liści wystarczającej do pomiarów wymiany gazowej (Flexas i inni., 2007 ). Odpowiedź netto fotosyntetycznego CO2 asymilacja (A) do substomatycznego CO2 koncentracja (Ci) zmierzono zmieniając zewnętrzny CO2 stężenie od 0 do 1000 μmol/mol pod stałym aktywnym promieniowaniem fotosyntetycznym 1500 μmol fotonów/m 2 /s (zapewnianym przez czerwono-niebieskie źródło światła przymocowane do komory liściowej). Dane dotyczące wymiany gazu zostały skorygowane o CO2 dyfuzja jak w Bellasio i inni. (2015). Temperaturę liści i wilgotność względną komory utrzymywano odpowiednio na poziomie 21°C i 70%. Aby obliczyć maksymalną szybkość karboksylacji (Vc, maks.), maksymalny przepływ transportu elektronów (Jmaks) i przewodnictwa mezofilowego (gm), dane A/Ci zostały dopasowane do C3 model fotosyntezy (Farquhar i inni., 1980 ) z modyfikacjami w celu uwzględnienia szacunków dla gm jak opisali Ethier i Livingston (2004).

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa

Do obrazowania liści i oocytów zastosowano laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica TCS SP2 (Leica Microsystems) z zanurzoną w wodzie soczewką obiektywu (HCX IRAPO 25,0x0,95). Długości fali wzbudzenia/emisji wynosiły 488 nm/500-530 nm dla GFP, 543 nm/590-620 nm dla mCherry i 488 nm/680-750 nm dla autofluorescencji chlorofilu. Obrazy uzyskano przy użyciu oprogramowania Leica LAS AF (http://www.leica-microsystems.com/). Przed obrazowaniem białek znakowanych przez Wenus w Chlamydomonas, 15 μl komórek dodano do studzienki 96-studzienkowej płytki optycznej (Brooks Life Science Systems, http://www.brooks.com) i pokryto 150 μl 1,5% agaroza o niskiej temperaturze topnienia zawierająca TP (

35°C). Do barwienia mitochondriów CCP1: Wenus i CCP2: Linie wyrażające Wenus hodowano w płynnej pożywce T-P z paromomycyną (2 μg/ml) do stężenia 2–4 ​​× 106 komórek/ml. Hodowle inkubowano z MitoTracker Red CMXRos (Thermo Fisher Scientific) do końcowego stężenia 1 μm przez 10 min, a następnie naniesiono na szkiełko pokryte polilizyną w celu obrazowania. Komórki obrazowano za pomocą specjalnie dostosowanego mikroskopu konfokalnego (Leica DMI6000) z ustawieniami 514 nm/532–555 nm dla Wenus, 561 nm/573–637 nm do barwienia za pomocą Mitotracker Red CMXRos i 561 nm/665–705 nm do autofluorescencji chlorofilu . Obrazy analizowano przy użyciu oprogramowania Fiji (http://fiji.sc/Fiji).

Analiza statystyczna

Różnice w odpowiedzi między genotypami oceniano za pomocą analizy wariancji (ANOVA) lub testu Studenta T-testy, po których następuje test post hoc Tukey'a HSD (uczciwa istotna różnica) (SPSS Statistics 18, http://www.ibm.com/). Różnice dla których P < 0,05 są uważane za znaczące.


Bibliografia

Bock, R.(ed) Biologia komórkowa i molekularna plastydów (Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, 2007).

Gray, MW Pochodzenie i ewolucja genomów organelli. Aktualn. Opinia. Genet. Odw. 3, 884–890 (1993).

Zoschke, R. & Bock, R. Chloroplast Tłumaczenie: Organizacja strukturalna i funkcjonalna, kontrola i regulacja operacyjna. Komórka roślinna 30, 745–770 (2018).

Barkan, A. Ekspresja genów plastydów: opracowania specyficzne dla organelli na rusztowaniu prokariotycznym. Fizjol roślin. 155, 1520–1532 (2011).

Woodson, JD i Chory, J. Koordynacja ekspresji genów między genomami organellarnymi i jądrowymi. Nat. Ks. Genet. 9, 383–395 (2008).

Choquet, Y. & Wollman, F.A. in Chlamydomonas Książka źródłowa Drugie wydanie (red. E.H. Harris i wsp.) 1027–1064 (Academic Press, Oxford, 2009).

Nickelsen, J., Bohne, A.V. & Westhoff, P. in Biologia plastydów. Postępy w biologii roślin (red. S. Theg i FA Wollman) Chloroplast Gene Expression — Translation (Springer, New York, NY, 2014).

Brar, GA i Weissman, JS Profilowanie rybosomów ujawnia, co, kiedy, gdzie i jak synteza białek. Nat. Ks. Mol. Biol. 16, 651–664 (2015).

Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. & Weissman, J. S. Analiza translacji in vivo w całym genomie z rozdzielczością nukleotydów przy użyciu profilowania rybosomów. Nauki ścisłe 324, 218–223 (2009).

Zoschke, R., Watkins, K. P. & Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. Komórka roślinna 25, 2265–2275 (2013).

Chotewutmontri, P. & Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS Genet. 12, e1006106 (2016).

Zoschke, R. & Barkan, A. Genome-wide analysis of thylakoid-bound ribosomes in maize reveals principles of cotranslational targeting to the thylakoid membrane. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 112, E1678–1687 (2015).

Lukoszek, R., Feist, P. & Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Biol. 16, 221 (2016).

Gawronski, P., Jensen, P. E., Karpinski, S., Leister, D. & Scharff, L. B. Plastid ribosome pausing is induced by multiple features and is linked to protein complex assembly. Fizjol roślin. 176, 2557–2569 (2018).

Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nat. Ks. Genet. 15, 205–213 (2014).

Schwarz, C., Elles, I., Kortmann, J., Piotrowski, M. & Nickelsen, J. Synthesis of the D2 protein of photosystem II in Chlamydomonas is controlled by a high molecular mass complex containing the RNA stabilization factor Nac2 and the translational activator RBP40. Komórka roślinna 19, 3627–3639 (2007).

Nickelsen, J., Fleischmann, M., Boudreau, E., Rahire, M. & Rochaix, J. D. Identification of cis-acting RNA leader elements required for chloroplast psbD ekspresja genów w Chlamydomonas. Komórka roślinna 11, 957–970 (1999).

Boudreau, E., Nickelsen, J., Lemaire, S. D., Ossenbühl, F. & Rochaix, J. D. The Nac2 gen Chlamydomonas encodes a chloroplast TPR-like protein involved in psbD mRNA stability. Embo J. 19, 3366–3376 (2000).

Klinkert, B., Elles, I. & Nickelsen, J. Translation of chloroplast psbD mRNA in Chlamydomonas is controlled by a secondary RNA structure blocking the AUG start codon. Kwasy nukleinowe Res. 34, 386–394 (2006).

Rott, M. et al. ATP synthase repression in tobacco restricts photosynthetic electron transport, CO2 assimilation, and plant growth by overacidification of the thylakoid lumen. Komórka roślinna 23, 304–321 (2011).

Berry, J. O., Mure, C. M. & Yerramsetty, P. Regulation of Rubisco gene expression in C4 plants. Aktualn. Opinia. Roślina Biol. 31, 23–28 (2016).

Kovtun, Y. & Daie, J. End-product control of carbon metabolism in culture-grown sugar beet plants (molecular and physiological evidence on accelerated leaf development and enhanced gene expression). Fizjol roślin. 108, 1647–1656 (1995).

Zoschke, R., Qu, Y., Zubo, Y. O., Börner, T. & Schmitz-Linneweber, C. Mutation of the pentatricopeptide repeat-SMR protein SVR7 impairs accumulation and translation of chloroplast ATP synthase subunits in Arabidopsis thaliana. J. Plant Res. 126, 403–414 (2013).

Grahl, S. et al. ten Arabidopsis protein CGLD11 is required for chloroplast ATP synthase accumulation. Mol. Zakład 9, 885–899 (2016).

Eberhard, S., Drapier, D. & Wollman, F. A. Searching limiting steps in the expression of chloroplast-encoded proteins: Relations between gene copy number, transcription, transcript abundance and translation rate in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii. Roślina J. 31, 149–160 (2002).

Cavaiuolo, M., Kuras, R., Wollman, F. A., Choquet, Y. & Vallon, O. Small RNA profiling in Chlamydomonas: Insights into chloroplast RNA metabolism. Kwasy nukleinowe Res. 45, 10783–10799 (2017).

Maul, J. E. et al. ten Chlamydomonas reinhardtii plastid chromosome: Islands of genes in a sea of repeats. Komórka roślinna 14, 2659–2679 (2002).

Sato, S., Nakamura, Y., Kaneko, T., Asamizu, E. & Tabata, S. Complete structure of the chloroplast genome of Arabidopsis thaliana. DNA Res. 6, 283–290 (1999).

Shinozaki, K. et al. The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome: Its gene organization and expression. EMBO J. 5, 2043–2049 (1986).

Ueda, M. et al. Substitution of the gene for chloroplast RPS16 was assisted by generation of a dual targeting signal. Mol. Biol. Ewol. 25, 1566–1575 (2008).

Schwenkert, S. et al. PsbI affects the stability, function, and phosphorylation patterns of photosystem II assemblies in tobacco. J. Biol. Chem. 281, 34227–34238 (2006).

Swiatek, M. et al. The chloroplast gene ycf9 encodes a photosystem II (PSII) core subunit, PsbZ, that participates in PSII supramolecular architecture. Komórka roślinna 13, 1347–1367 (2001).

Umate, P. et al. Deletion of PsbM in tobacco alters the QB site properties and the electron flow within photosystem II. J. Biol. Chem. 282, 9758–9767 (2007).

Finazzi, G., Drapier, D. & Rappaport, F. in The Chlamydomonas Sourcebook 2nd edn (eds E.H. Harris et al.) 639–670 (Academic Press, Oxford, 2009).

Seelert, H., Dencher, N. A. & Müller, D. J. Fourteen protomers compose the oligomer III of the proton-rotor in spinach chloroplast ATP synthase. J. Mol. Biol. 333, 337–344 (2003).

Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C. & Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Komórka 157, 624–635 (2014).

Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Ewol. 2, 13–34 (1985).

Sugiura, M. Plastid mRNA translation. Metody Mol. Biol. 1132, 73–91 (2014).

Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D. & Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Komórka 165, 976–989 (2016).

Minai, L., Wostrikoff, K., Wollman, F. A. & Choquet, Y. Chloroplast biogenesis of photosystem II cores involves a series of assembly-controlled steps that regulate translation. Komórka roślinna 18, 159–175 (2006).

Loizeau, K. et al. Small RNAs reveal two target sites of the RNA-maturation factor Mbb1 in the chloroplast of Chlamydomonas. Kwasy nukleinowe Res. 42, 3286–3297 (2014).

Vaistij, F. E., Goldschmidt-Clermont, M., Wostrikoff, K. & Rochaix, J. D. Stability determinants in the chloroplast psbB/T/H mRNAs of Chlamydomonas reinhardtii. Roślina J. 21, 469–482 (2000).

Levey, T., Westhoff, P. & Meierhoff, K. Expression of a nuclear-encoded psbH gene complements the plastidic RNA processing defect in the PSII mutant hcf107 w Arabidopsis thaliana. Roślina J. 80, 292–304 (2014).

Komenda, J. et al. Accumulation of the D2 protein is a key regulatory step for assembly of the photosystem II reaction center complex in Synechocystis PCC 6803. J. Biol. Chem. 279, 48620–48629 (2004).

Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M. & Ikeuchi, M. PSII-Tc protein plays an important role in dimerization of photosystem II. Fizjol komórek roślinnych. 45, 1809–1816 (2004).

Liu, X. Q., Xu, H. & Huang, C. Chloroplast chlB gene is required for light-independent chlorophyll accumulation in Chlamydomonas reinhardtii. Roślina Mol. Biol. 23, 297–308 (1993).

Ramundo, S., Rahire, M., Schaad, O. & Rochaix, J. D. Repression of essential chloroplast genes reveals new signaling pathways and regulatory feedback loops in Chlamydomonas. Komórka roślinna 25, 167–186 (2013).

Sun, Y. & Zerges, W. Translational regulation in chloroplasts for development and homeostasis. Biochim. Biofizyka. Acta 1847, 809–820 (2015).

Börner, T., Aleynikova, A. Y., Zubo, Y. O. & Kusnetsov, V. V. Chloroplast RNA polymerases: Role in chloroplast biogenesis. Biochim. Biofizyka. Acta 1847, 761–769 (2015).

Barkan, A. & Small, I. Pentatricopeptide repeat proteins in plants. Annu. Wielebny Biol. 65, 415–442 (2014).

Hammani, K. et al. Helical repeats modular proteins are major players for organelle gene expression. Biochimie 100, 141–150 (2014).

Idoine, A. D., Boulouis, A., Rupprecht, J. & Bock, R. The diurnal logic of the expression of the chloroplast genome in Chlamydomonas reinhardtii. PLoS ONE 9, e108760 (2014).

Nakamura, Y., Gojobori, T. & Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Kwasy nukleinowe Res 28, 292 (2000).

Morton, B. R. Chloroplast DNA codon use: Evidence for selection at the psbA locus based on tRNA availability. J. Mol. Ewol. 37, 273–280 (1993).

Morton, B. R. & Levin, J. A. The atypical codon usage of the plant psbA gene may be the remnant of an ancestral bias. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 94, 11434–11438 (1997).

Nixon, P. J., Michoux, F., Yu, J., Boehm, M. & Komenda, J. Recent advances in understanding the assembly and repair of photosystem II. Anny. Nerw. 106, 1–16 (2010).

Hirose, T. & Sugiura, M. Multiple elements required for translation of plastid atpB mRNA lacking the Shine–Dalgarno sequence. Kwasy nukleinowe Res. 32, 3503–3510 (2004).

Kuroda, H. et al. Translation of psbC mRNAs starts from the downstream GUG, not the upstream AUG, and requires the extended Shine–Dalgarno sequence in tobacco chloroplasts. Fizjol komórek roślinnych. 48, 1374–1378 (2007).

Scharff, L. B. et al. Shine-Dalgarno sequences play an essential role in the translation of plastid mRNAs in tobacco. Komórka roślinna 29, 3085–3101 (2017).

Nakamura, M. & Sugiura, M. Translation efficiencies of synonymous codons are not always correlated with codon usage in tobacco chloroplasts. Roślina J. 49, 128–134 (2007).

Nakamura, M. & Sugiura, M. Translation efficiencies of synonymous codons for arginine differ dramatically and are not correlated with codon usage in chloroplasts. Gen 472, 50–54 (2011).

Li, G. W., Oh, E. & Weissman, J. S. The anti-Shine–Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Natura 484, 538–541 (2012).

Pechmann, S. & Frydman, J. Evolutionary conservation of codon optimality reveals hidden signatures of cotranslational folding. Nat. Struktura. Mol. Biol. 20, 237–243 (2013).

Schroda, M., Vallon, O., Wollman, F. A. & Beck, C. F. A chloroplast-targeted heat shock protein 70 (HSP70) contributes to the photoprotection and repair of photosystem II during and after photoinhibition. Komórka roślinna 11, 1165–1178 (1999).

Harris, E. H., Boynton, J. E. & Gillham, N. W. Chloroplast ribosome biogenesis in Chlamydomonas. Selection and characterization of mutants blocked in ribosome formation. J. Cell Biol. 63, 160–179 (1974).

Mettler, T. et al. Systems analysis of the response of photosynthesis, metabolism, and growth to an increase in irradiance in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii. Komórka roślinna 26, 2310–2350 (2014).

Sharp, P. M. & Li, W. H. The codon Adaptation Index—A measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Kwasy nukleinowe Res. 15, 1281–1295 (1987).

Puigbo, P., Bravo, I. G. & Garcia-Vallve, S. E-CAI: A novel server to estimate an expected value of Codon Adaptation Index (eCAI). Bioinformacje BMC. 9, 65 (2008).

Willmund, F. & Schroda, M. HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii. Fizjol roślin. 138, 2310–2322 (2005).

Liu, C. et al. J-domain protein CDJ2 and HSP70B are a plastidic chaperone pair that interacts with vesicle-inducing protein in plastids 1. Mol. Biol. Komórka 16, 1165–1177 (2005).


Wnioski

Here, we identified 92 COMT genes from blueberry and 425 COMT genes from 15 other species. According to phylogenetic analysis of COMTs, we divided the COMTs into two groups, which indicated the existence of two ancestor genes. DSD and WGD were revealed to be the major forces of blueberry evolution. The Ka/Ks ratios of the gene duplication patterns for the COMTs from the four plant species were less than 1, indicating that the COMTs have experienced strong purifying selection. According to the qRT-PCR results for 22 VcCOMTs, VcCOMT40, VcCOMT92 were highly expressed and may play important roles in the synthesis of lignin of blueberry fruit. The results of this study will build foundations for breeding blueberry cultivars with higher fruit firmness and longer shelf life.


We acknowledge funding of this research project by the Research Council of Norway (RCN) and the University of Hamburg (Hamburg, Germany). We are grateful to Prof. C. Benning (Michigan State University, East Lansing, United States) for providing the expression vector pNoc ox Venus. We also would like to thank Elke Wölken (Department of Aquatic Ecophysiology and Phycology, University of Hamburg) for analyses of immunogold-labeled N. oceanica transformants by transmission electron microscopy.

aa, amino acid ALNS, allantoin synthase ASW, artificial sea water At, Arabidopsis thaliana CaMV, cauliflower mosaic virus DC, decarboxylase DECR, 2,4-dienoyl-CoA reductase DHNS, 1,4-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA synthase dpt, days post transformation EMB8, embryogenesis-associated protein 8 EPA, eicosapentaenoic acid EYFP/GFP, enhanced yellow/green fluorescent protein HIT, histidine triad family protein HIUase, 5-hydroxyisourate hydrolase IndA, indigoidine synthase A MDH, malate dehydrogenase MLS, malate synthase Ng, Nannochloropsis gaditana OHCU, 2-oxo-4-hydroxy-4-carboxy-5-ureidoimidazoline PEX, peroxin PfkB, 6-phosphofructokinase PGL3, 6-phosphogluconolactonase 3 PKT, peroxisomal 3-ketoacyl thiolase PTS1/2, peroxisomal targeting signal type 1/2 PUFA, polyunsaturated fatty acid PUKI, pseudouridine kinase PUMY, pseudouridine monophosphate glycosylase TEM, transmission electron microscopy.


Wyniki

Proteome profile changes in P. pateny under ABA treatment

Changes in the proteome profile between control and ABA treated plants suggested that exogenous ABA could trigger one or more responses in P. pateny. In order to ensure statistically results, the experiments were carried out in triplicate. After CBB R-250 staining, more than 1,300 protein spots could be detected for each sample. Representative gels from control and ABA-treated plants and proteins showing altered abundance are presented in Figure ​ Figure1. 1 . Two-dimensional images were analyzed using ImageMaster™ 2D Platinum software. The volume percentage of each spot was estimated and compared across the gels. In the samples following ABA treatment, we repeatedly analyzed 89 protein spots, whose relative abundance was at least 1.5-fold different from the control. The proteins associated with 65 of these protein spots were subsequently identified using LC-MS/MS. Among them, 13 protein spots (D1-D13) were down-regulated, 52 protein spots (U1-U52) were up-regulated by ABA treatment including four protein spots (U22, U24, U40, U43) which were only present in the ABA-treated samples (Figure ​ (Figure1). 1 ). Quantitative analysis indicated that the abundance of these proteins changed [see Additional File 1: Supplemental Table S1] in response to ABA treatment (Figure ​ (Figure2) 2 ) suggesting that different physiological and biochemical processes are modified following ABA treatment.


Obejrzyj wideo: Algi warte miliony (Sierpień 2022).