Informacja

W jaki sposób RT-PCR reprezentuje zawartość RNA w komórce?

W jaki sposób RT-PCR reprezentuje zawartość RNA w komórce?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Na przykład najpierw zbieramy całą zawartość RNA z linii komórek ssaków. Powiedzmy na przykład, że zbieramy 80 ul RNA o stężeniu 150 ng/ul. Następnie, aby wytworzyć cDNA, pobieramy 1000 ng RNA. Jednak to 1000 ng jest całkowicie losową próbką całkowitego RNA, którą mieliśmy. Jak wygląda ta losowa próbka RNA reprezentująca zawartość RNA pierwotnie w naszych komórkach?


Nie jest do końca jasne, o co pyta pytający, ale…

… jednym ze sposobów myślenia o tym jest pytanie, jakie jest prawdopodobieństwo, że w próbce pobranej z preparacji RNA nie będzie RNA o niskiej liczebności. To sprawiłoby, że próba byłaby niereprezentatywna na poziomie jakościowym.

Pytanie stwierdza, że ​​izoluje się 12 000 ng RNA. Ponieważ nic więcej nie jest określone, zakładam, że jest to całkowite RNA. Zgrubne oszacowanie całkowitego RNA na komórkę eukariotyczną wynosi 20 pg.

Oznacza to, że preparat pochodził z 6 x 105 komórki. (Zakładam 100% wydajność, ale to tak naprawdę nie wpłynie na wnioski.)

Teraz załóżmy, że mRNA o niskiej liczebności występuje w 10 kopiach na komórkę. Całkowity preparat RNA zawiera zatem 6 x 106 kopie tego mRNA o niskiej liczebności.

Z 12 000 ng pobieramy próbkę 1000 ng. Innymi słowy, bierzemy 1/12 od przygotowania RNA. Jeśli ten preparat RNA zawiera 106 kopie mRNA o niskiej liczebności, jakie jest prawdopodobieństwo, że zdarzy się nam pobrać próbkę, która nie zawiera kopii tego mRNA o niskiej liczebności? Tutaj moja matematyka mnie zawodzi, ale intuicyjnie mówię, że prawdopodobieństwo jest bardzo, bardzo mały.

Teraz, jeśli w komórce jest 1000 różnych mRNA o niskiej liczebności, prawdopodobieństwo pominięcia każdego z nich wynosi bardzo, bardzo mały, ale ogólne prawdopodobieństwo pominięcia jednego z nich wynosi 1000 x bardzo, bardzo mały, więc może bardzo mały.

Będę dalej myśleć o tym, jak obliczyć wartość bardzo, bardzo mały, ale jeśli ktoś chce pomóc - z góry dziękuję!


Jakie są różnice między PCR, RT-PCR, qPCR i RT-qPCR?


Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest stosunkowo prostą i szeroko stosowaną techniką biologii molekularnej do amplifikacji i wykrywania sekwencji DNA i RNA. W porównaniu z tradycyjnymi metodami klonowania i amplifikacji DNA, które często mogą trwać kilka dni, PCR wymaga tylko kilku godzin. PCR jest bardzo czuły i wymaga minimalnej matrycy do wykrywania i amplifikacji określonych sekwencji. Podstawowe metody PCR rozwinęły się dalej od prostego wykrywania DNA i RNA. Poniżej przedstawiamy przegląd różnych metod PCR i odczynników, które dostarczamy w Enzo Life Sciences do Twoich potrzeb badawczych. Naszym celem jest pomoc naukowcom w szybkim dostępie do odczynników PCR do wykorzystania w ich następnym projekcie badawczym!

Do standardowego PCR wystarczy polimeraza DNA, magnez, nukleotydy, startery, matryca DNA do amplifikacji i termocykler. Mechanizm PCR jest tak prosty, jak jego cel: 1) dwuniciowy DNA (dsDNA) jest denaturowany termicznie, 2) startery dopasowują się do pojedynczych nici DNA i 3) startery są wydłużane przez polimerazę DNA, w wyniku czego powstają dwie kopie oryginału Nici DNA. Proces denaturacji, wyżarzania i wydłużania w szeregu temperatur i czasów jest znany jako jeden cykl amplifikacji. Każdy etap cyklu powinien być zoptymalizowany pod kątem użytej matrycy i zestawu starterów. Cykl ten powtarza się około 20-40 razy, a następnie amplifikowany produkt można analizować. PCR jest szeroko stosowany do amplifikacji DNA do późniejszego wykorzystania eksperymentalnego. PCR ma również zastosowanie w testach genetycznych lub do wykrywania patogennego DNA.

Ponieważ PCR jest bardzo czułą metodą i do pojedynczych reakcji wymagane są bardzo małe objętości, zaleca się przygotowanie mieszanki głównej dla kilku reakcji. Mieszanka główna musi być dobrze wymieszana, a następnie podzielona według liczby reakcji, zapewniając, że każda reakcja będzie zawierać taką samą ilość enzymu, dNTP i starterów. Wielu dostawców, takich jak Enzo Life Sciences, oferuje również mieszanki PCR, które zawierają już wszystko oprócz starterów i matrycy DNA.

Regiony bogate w guaninę/cytozynę (bogate w GC) stanowią wyzwanie w standardowych technikach PCR. Sekwencje bogate w GC są bardziej stabilne niż sekwencje o niższej zawartości GC. Ponadto sekwencje bogate w GC mają tendencję do tworzenia struktur drugorzędowych, takich jak pętle spinki do włosów. W rezultacie podwójne nici bogate w GC są trudne do całkowitego rozdzielenia podczas fazy denaturacji. W konsekwencji polimeraza DNA nie może bez przeszkód syntetyzować nowej nici. Wyższa temperatura denaturacji może to poprawić, a dostosowanie w kierunku wyższej temperatury przyłączania i krótszego czasu przyłączania może zapobiegać niespecyficznemu wiązaniu starterów bogatych w GC. Dodatkowe odczynniki mogą poprawić amplifikację sekwencji bogatych w GC. DMSO, glicerol i betaina pomagają rozerwać drugorzędowe struktury spowodowane interakcjami GC, a tym samym ułatwiają oddzielenie podwójnych nici.


RT-PCR i synteza cDNA amp

Synteza DNA z matrycy RNA, poprzez odwrotną transkrypcję, wytwarza komplementarny DNA (cDNA). Odwrotne transkryptazy (RT) wykorzystują matrycę RNA i starter komplementarny do końca 3' RNA do kierowania syntezą pierwszej nici cDNA, która może być użyta bezpośrednio jako matryca do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Ta kombinacja odwrotnej transkrypcji i PCR (RT-PCR) umożliwia wykrycie małej ilości RNA w próbce i wytwarzanie odpowiedniego cDNA, ułatwiając w ten sposób klonowanie genów o niskiej liczbie kopii. Alternatywnie, pierwsza nić cDNA może być wykonana jako dwuniciowa przy użyciu polimerazy DNA I i ligazy DNA. Te produkty reakcji można stosować do bezpośredniego klonowania bez amplifikacji. W tym przypadku wymagana jest aktywność RNazy H z RT lub z zewnątrz.

Wiele RT jest dostępnych u dostawców komercyjnych. Wirus odwrotnej transkryptazy wirusa ptasiej mieloblastozy (AMV) i wirus odwrotnej transkryptazy Moloneya (M-MuLV, MMLV) to RT powszechnie stosowane w procesach biologii molekularnej. Odwrotna transkryptaza ProtoScript ® II jest rekombinowaną odwrotną transkryptazą M-MuLV o zmniejszonej aktywności RNazy H i zwiększonej termostabilności. Może być stosowany do syntezy pierwszej nici cDNA w wyższych temperaturach niż M-MuLV typu dzikiego. Enzym jest aktywny do 50°C, zapewniając wyższą specyficzność, wyższą wydajność cDNA i więcej produktu cDNA o pełnej długości, do 12 kb długości.

Zastosowanie zmodyfikowanych RT poprawia wydajność tworzenia produktu o pełnej długości, zapewniając, że kopiowanie końca 5&prime transkryptu mRNA jest kompletne i umożliwiając propagację i charakterystykę wiernej kopii DNA sekwencji RNA. Zastosowanie bardziej termostabilnych RT, w których reakcje przebiegają w wyższych temperaturach, może być pomocne w odwrotnej transkrypcji RNA o strukturze drugorzędowej.

Aby uzyskać pomoc w porównaniu dostępnych odczynników do syntezy RT i cDNA, zapoznaj się z naszą tabelą wyboru syntezy RT/cDNA.

Wybierz typ:

Ten produkt jest objęty jednym lub kilkoma patentami, znakami towarowymi i/lub prawami autorskimi będącymi własnością lub kontrolowanymi przez New England Biolabs, Inc (NEB).

Podczas gdy NEB opracowuje i weryfikuje swoje produkty do różnych zastosowań, korzystanie z tego produktu może wymagać od kupującego uzyskania dodatkowych praw własności intelektualnej stron trzecich do niektórych zastosowań.

Aby uzyskać więcej informacji na temat praw handlowych, skontaktuj się z zespołem ds. globalnego rozwoju działalności firmy NEB pod adresem [email protected]

Ten produkt jest przeznaczony wyłącznie do celów badawczych. Ten produkt nie jest przeznaczony do stosowania w celach terapeutycznych lub diagnostycznych u ludzi lub zwierząt.


Przegląd qPCR i RT-qPCR

Ilościowa reakcja PCR, niezależnie od tego, czy obejmuje etap odwrotnej transkrypcji, czy nie, jest rutynowo stosowana w laboratoriach biologii molekularnej i zrewolucjonizowała sposób prowadzenia badań dzięki stosunkowo prostemu procesowi (ryc. 2). Jego przewagi nad standardowym PCR obejmują możliwość wizualizacji, które reakcje zadziałały w czasie rzeczywistym i bez potrzeby stosowania żelu agarozowego. Pozwala także na prawdziwie ilościową analizę. Jednym z najczęstszych zastosowań qPCR jest określenie liczby kopii interesującej nas sekwencji DNA. Korzystając z bezwzględnej oceny ilościowej, użytkownik jest w stanie określić docelową liczbę kopii w odniesieniu do krzywej standardowej o określonym stężeniu w znacznie dokładniejszy sposób niż kiedykolwiek wcześniej. Z drugiej strony, RT-qPCR umożliwia badanie zmian ekspresji genów po potraktowaniu układów modelowych inhibitorami, stymulantami, małymi interferującymi RNA (siRNA) lub modelami knockout itp. Technika ta jest również rutynowo stosowana do wykrywania zmian w ekspresji zarówno przed (jako kontrola jakości) i po (potwierdzeniu zmiany) eksperymentów RNA-Seq.

Przebieg standardowego eksperymentu qPCR i RT-qPCR. Po izolacji próbki integralność jest analizowana przed wygenerowaniem cDNA i rozpoczęciem testu qPCR przy użyciu barwników interkalujących lub sond hydrolizy. Fluorescencja jest wykrywana podczas cykli PCR i wykorzystywana do generowania krzywej amplifikacji, która jest wykorzystywana do ilościowego oznaczenia docelowej próbki podczas analizy danych.

Przygotowanie próbki

Najważniejszym etapem procesu qPCR i RT-qPCR jest prawdopodobnie izolacja próbki. Bez względu na to, jak dobry jest projekt Twojego testu, jeśli materiał wyjściowy jest zanieczyszczony lub zdegradowany, nie otrzymasz dokładnych wyników. Próbka dobrej jakości to początkowy blok danych dobrej jakości. Podczas izolowania DNA do qPCR ważne jest, aby był wolny od zanieczyszczeń, które mogą hamować reakcję. Najczęściej ekstrakcja odbywa się za pomocą dostępnych na rynku zestawów, które mają tę zaletę, że są przyjazne dla użytkownika, proste i szybkie, zwłaszcza gdy są zintegrowane z systemem robotycznym. Rodzaj przeprowadzonej ekstrakcji RNA zależy od rodzaju wymaganego RNA. Najczęściej stosowaną metodą ekstrakcji są zestawy do ekstrakcji całkowitego RNA. To izoluje informacyjny RNA (mRNA prekursor syntezy białek), transferowy RNA (tRNA dekoduje mRNA podczas translacji z rybosomem) i rybosomalny RNA (rRNA odczytuje kolejność aminokwasów podczas translacji i łączy je z rybosomem), ale często (nie zawsze ) nie izoluje mniejszych RNA, takich jak niekodujący RNA (funkcjonalny RNA ncRNA transkrybowany z DNA, ale nie ulegający translacji na białka) i mikroRNA (miRNA regulują ekspresję genów poprzez hamowanie translacji mRNA). Wraz z eksplozją zainteresowania wzmacniaczami RNA (małe RNA eRNA podlegające transkrypcji z wzmacniaczy), które mogą znacznie różnić się długością, konieczne jest dokładne rozważenie metod ekstrakcji, aby zapewnić izolację interesującego RNA. Oprócz rozważań dotyczących ekstrakcji, istotne jest, aby RNA nie było zanieczyszczone DNA, ponieważ nie można go odróżnić od cDNA w reakcji qPCR. Aby to przezwyciężyć, większość protokołów opiera się na zastosowaniu obróbki DNazą I, która trawi dowolny DNA.

Podczas izolacji zawsze istnieje możliwość degradacji próbki. W związku z tym każdy dobry rurociąg będzie obejmował etap kontroli jakości w celu oceny integralności próbki. Można to zrobić szybko, oceniając stosunek A260/280 (porównanie absorbancji przy 260 vs 280 nm, miara zanieczyszczenia białkami) i stosunek A260/230 (260 vs 230 nm, wskazanie na obecność zanieczyszczeń organicznych) próbki nie jest to jednak bardzo dokładne i podlega wpływom kilku czynników. Bardziej dokładnym pomiarem jest zastosowanie systemu wirtualnej elektroforezy żelowej, takiego jak Aligent Bioanalyser. Ten system działa przy użyciu chipa, który oddziela RNA na podstawie wielkości i wykrywa RNA za pomocą barwników fluorescencyjnych. Jest to następnie tłumaczone na komputer, który przy użyciu algorytmu generuje numer integralności RNA (RIN), który reprezentuje jakość próbki, przy czym 10 jest najwyższą wartością.

Ostatnim etapem przygotowania próbki do RT-qPCR jest wygenerowanie cDNA. cDNA wykorzystuje RT-PCR (Figura 1) do generowania cDNA z matrycy RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy. Można to zrobić stosując startery oligo(dT), które hybrydyzują z ogonem poliA RNA, lub stosując losowe heksamery (startery o długości od sześciu do dziewięciu zasad, które hybrydyzują w wielu punktach wzdłuż transkryptu RNA). Ogólnie uważa się, że mieszanina dwóch starterów jest najlepsza, ponieważ umożliwia amplifikację ogona RNA poliA (głównie mRNA) i RNA nie zawierającego poliA (tRNA, rRNA itp.). Oprócz rozważenia startera, generowanie cDNA może być częścią eksperymentu qPCR (nazywanego jednoetapowym RT-qPCR) lub jest generowane oddzielnie od qPCR (dwuetapowy RT-qPCR), jak pokazano na rysunku 3. Zaleta jednoetapowa RT-qPCR oznacza mniejszą zmienność eksperymentalną i mniejsze ryzyko zanieczyszczenia, a także umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe, dlatego ta opcja jest zwykle stosowana w badaniach klinicznych. Oznacza to jednak, że próbka może być użyta tylko ograniczoną liczbę razy, podczas gdy dwuetapowa RT-qPCR umożliwia więcej reakcji na próbkę i elastyczne opcje uruchamiania i jest zwykle preferowaną opcją w analizie ekspresji genów na szeroką skalę, ale nie wymagają większej optymalizacji.


Eozynofile ludzkie i mysie mają działanie przeciwwirusowe przeciwko wirusowi paragrypy

Wirusy układu oddechowego powodują zaostrzenia astmy. Ponieważ eozynofile są głównymi leukocytami w drogach oddechowych 60–70% pacjentów z astmą, oceniliśmy wpływ eozynofili na powszechny wirus oddechowy, paragrypy 1, w płucach. Eozynofile rekrutowane do dróg oddechowych myszy typu dzikiego po uczuleniu na albuminę jaja kurzego i prowokacji istotnie zmniejszyły RNA wirusa paragrypy w płucach 4 dni po zakażeniu w porównaniu ze zwierzętami nieuwrażliwionymi. Ten efekt przeciwwirusowy był również obserwowany u transgenicznych myszy IL-5 z dużą ilością eozynofili w drogach oddechowych (NJ.1726), ale został utracony u transgenicznych myszy z niedoborem eozynofili (PHIL) i u transgenicznych myszy IL-5 skrzyżowanych z myszami z niedoborem eozynofili (NJ). .1726-PHIL). Utrata peroksydazy eozynofilowej białka ziarnistego eozynofili przy użyciu transgenicznych myszy z niedoborem peroksydazy eozynofilów nie zmniejszyła działania przeciwwirusowego eozynofilów. Zbadano również mechanizmy przeciwwirusowe eozynofilów in vitro. Wyizolowane ludzkie eozynofile znacząco obniżyły miana wirusa paragrypy. Efekt ten nie obejmował degradacji wirusowego RNA przez RNazy ziarniste eozynofili. Jednak eozynofile potraktowane inhibitorem syntazy tlenku azotu utraciły swoją aktywność przeciwwirusową, co sugeruje, że eozynofile łagodzą zakaźność wirusa poprzez wytwarzanie tlenku azotu. W konsekwencji mierzono produkcję eozynofilowego tlenku azotu za pomocą wewnątrzkomórkowej sondy fluorescencyjnej. Eozynofile wytwarzały tlenek azotu w odpowiedzi na wirusa i syntetycznego agonistę wykrywającego wirusa wrodzonego receptora odpornościowego, receptora Toll-podobnego (TLR) 7. IFNγ zwiększał ekspresję eozynofilowego TLR7 i wzmagał indukowaną przez TLR7 produkcję tlenku azotu. Wyniki te sugerują, że eozynofile promują usuwanie wirusa w płucach i przyczyniają się do wrodzonej odpowiedzi immunologicznej przeciwko infekcjom wirusowym układu oddechowego u ludzi.

Ludzkie i mysie eozynofile działają przeciwwirusowo przeciwko wirusowi paragrypy poprzez wytwarzanie tlenku azotu i służąc jako martwy gospodarz dla infekcji wirusowej, ale nie poprzez wytwarzanie ziarnistych RNaz eozynofilów lub peroksydazy eozynofilowej. Eozynofile mogą mieć niedocenianą rolę przeciwwirusową w zakażeniach dróg oddechowych u ludzi.

Stwierdzono, że eozynofile naciekają drogi oddechowe około dwóch trzecich pacjentów z astmą (1) i zostały eksperymentalnie powiązane z nadreaktywnością dróg oddechowych (2) i przebudową dróg oddechowych (3). Zrozumiałe jest, że doprowadziło to do założenia, że ​​eozynofile są wyłącznie nieprzystosowane w astmie, a zatem wiele metod leczenia astmy ma na celu zmniejszenie zapalenia eozynofilowego (4–7). Ta strategia przyniosła zmienne rezultaty. Wielu pacjentów z astmą pozostaje słabo kontrolowanych pomimo maksymalnej terapii (8). Zaostrzenia objawów astmy nadal powodują znaczną zachorowalność, wydatki na opiekę zdrowotną i śmierć (9, 10). Co więcej, zapobieganie i leczenie najczęstszej przyczyny zaostrzeń astmy, infekcji wirusowej układu oddechowego, praktycznie nie istnieje (11). Te braki podkreślają naszą ograniczoną wiedzę na temat biologii eozynofili i skłoniły do ​​podjęcia badań nad określeniem roli eozynofili podczas infekcji wirusowych dróg oddechowych w astmie. Na przykład myszy transgeniczne IL-5 z podwyższonymi ogólnoustrojowymi eozynofilami miały niższe miana wirusa RSV w porównaniu z myszami typu dzikiego (12), podczas gdy myszy transgeniczne IL-5 z eozynofilią dróg oddechowych miały niższe miana wirusa zapalenia płuc u myszy w porównaniu z elementami sterującymi (13). Podobnie stwierdziliśmy, że eozynofile rekrutowane do dróg oddechowych po uczuleniu na albuminę jaja kurzego były związane z mniejszą liczbą wirusa paragrypy 1 w płucach świnek morskich, chociaż eksperymenty te nie zostały zaprojektowane w celu ustalenia roli przyczynowej eozynofilów (14). Podsumowując, badania te sugerują, że eozynofile przyczyniają się do odporności przeciwwirusowej w płucach.

Eozynofile wykrywają inwazyjne wirusy za pomocą kilku mechanizmów, w tym interakcji receptora Toll-podobnego (TLR) – ligandu (15). TLR7 wiąże jednoniciowy RNA, który jest powszechnym motywem genomowym wielu wirusów układu oddechowego (16). Ligacja TLR7 wyzwala pierwotną odpowiedź różnicowania szpiku 88 (MyD88) zależną od białka adaptacyjnego, która promuje odpowiedź przeciwwirusową eozynofilów (12). Jednak mediatorzy odpowiedzialni za działanie przeciwwirusowe eozynofilów są przedmiotem dyskusji. Po aktywacji eozynofile uwalniają różne białka ziarniste, które mogą działać przeciwwirusowo. Białko kationowe eozynofili i neurotoksyna pochodząca z eozynofilów są członkami nadrodziny RNazy A i sugeruje się, że mają działanie wirusobójcze poprzez degradację genomów wirusowego RNA (13, 17, 18). Peroksydaza eozynofilowa jest również uwalniana z ziarnistości eozynofili i przyczynia się do wytwarzania przeciwdrobnoustrojowych reaktywnych form tlenu (19). To, czy eozynofile celują we wszystkie wirusy tymi białkami, czy też za pomocą unikalnych mechanizmów, wymaga dalszych badań.

Wirus paragrypy jest jednym z kilku wirusów, o których wiadomo, że powodują zaostrzenia astmy (20). Paragrypa jest wykrywana w drogach oddechowych do 18% dorosłych w ostrych zaostrzeniach astmy (21). Jego rozpowszechnienie jest podobne do grypy i koronawirusa, a znacznie większe niż RSV u dorosłych. Biorąc pod uwagę, że szacunkowo 16 milionów ostrych wizyt z powodu zaostrzeń astmy ma miejsce rocznie [22], zaostrzenia wywołane paragrypą stanowią znaczne obciążenie chorobowe, jednak interakcja między wirusem paragrypy a eozynofilami nie jest jasno określona.

W tym badaniu zbadaliśmy hipotezę, że eozynofile hamują infekcję płuc wirusem paragrypy. Opisane tutaj eksperymenty oceniały wpływ eozynofili na usuwanie wirusa paragrypy in vivo i ocenił rolę potencjalnych mediatorów przeciwwirusowych. Zbadaliśmy również wpływ IFNγ na odpowiedzi przeciwwirusowe eozynofilów jako potencjalny mechanizm zwiększania aktywności przeciwwirusowej, w której pośredniczą eozynofile.

Myszy z ekspresją IL-5 w nabłonku dróg oddechowych (NJ.1726) (23), myszy z niedoborem eozynofili (PHIL) (24) i myszy z niedoborem peroksydazy eozynofilów (25) utrzymywano przez krzyżowanie wsteczne na tle C57BL/6. Zwierzęta były traktowane zgodnie z amerykańską ustawą o dobrostanie zwierząt. Protokoły zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committees of Oregon Health & Science University (Portland, OR) oraz Mayo Clinic (Scottsdale, AZ).

Wirus paragrypy (wirus Sendai ATCC, Manassas, VA) hodowano w pojedynczych warstwach komórek nerki małpy rezus (RMK), oczyszczono przez odwirowanie gęstości sacharozy i oznaczono miano w komórkach RMK (26) (zobaczyć internetowych materiałów i metod). Miana wyrażono jako wielokrotności 50% dawki zakaźnej hodowli tkankowej (TCID50 ilość wirusa wymagana do zainfekowania 50% monowarstw RMK).

Samice myszy w wieku 6-8 tygodni uczulono przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,04 μg i 0,2 μg albuminy jaja kurzego (Sigma, St. Louis, MO) z ałunem odpowiednio w 1. i 14. dniu. W dniach 24, 26 i 28 myszy znieczulano ketaminą (45 mg/kg) i ksylazyną (8 mg/kg) i prowokowano dotchawiczo 2% owoalbuminą. Myszy zarażono paragrypą (2,8 × 104 TCID50 jednostek) donosowo w dniu 27. W dniu 31 płuca były płukane i homogenizowane (zobaczyć internetowych materiałów i metod).

RNA białka macierzy paragrypy w homogenatach płuc zostało zamplifikowane przez RT-PCR w czasie rzeczywistym i znormalizowane do 18S. Względna ekspresja RNA została przekształcona w bezwzględne powtórzenia RNA przy użyciu standardowej krzywej RNA paragrypy (zobaczyć internetowych materiałów i metod).

Eozynofile wyizolowano do ponad 99% czystości i ponad 99% żywotności z krwi zdrowych ludzkich ochotników przez wirowanie gęstościowe przy użyciu Ficoll-Paque Plus (Sigma) i selekcję negatywną (zobaczyć internetowych materiałów i metod). Protokół został zatwierdzony przez Institutional Review Board. Uczestnicy dostarczyli pisemną świadomą zgodę.

Ludzkie eozynofile inkubowano przez noc z lub bez IFNγ (300 U/ml). Usunięto podłoże i paragrypy (1 × 105 TCID50) dodano przez 2 godziny. Niektóre kultury zostały wstępnie potraktowane inhibitorem syntazy tlenku azotu, chlorowodorkiem estru metylowego Nω-nitro-L-argininy ([ l -NAZWA] 100 μM Sigma) 30 minut przed zaszczepieniem. Zakaźność wirusową oznaczono ilościowo w komórkach RMK w teście hemadsorpcji. Miana zakaźne są wyrażone jako TCID50 U/ml supernatantu hodowli.

Ludzkie eozynofile obciążono sondą fluorescencyjną wykrywającą tlenek azotu (Strem, Newburyport, MA) i wystawiono na działanie paragrypy lub syntetycznego agonisty TLR7, zobaczyć internetowe materiały i metody . Fluorescencję mierzono 60 minut później za pomocą czytnika płytek.

Ludzkie eozynofile zaszczepiono wirusem paragrypy (1 × 105 TCID50) przez 2 godziny, przemywano w celu usunięcia niezwiązanego wirusa i utrzymywano w świeżej pożywce przez 72 godziny. Wirusowe RNA w supernatantach hodowli oznaczano ilościowo co 24 godziny metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym (zobaczyć internetowych materiałów i metod).

Ekspresję eozynofilowego TLR7 oceniano za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym i immunofluorescencji (zobaczyć internetowych materiałów i metod).

Dane porównano za pomocą jednokierunkowej analizy ANOVA z testem Bonferroniego post hoc test. Dane przedstawiono jako średnie (±SEM). A P wartość mniejszą niż 0,05 uznano za istotną.

Myszy C57BL/6, uczulone i prowokowane albuminą jaja kurzego, miały znacząco zmniejszone (o około 90%) RNA wirusa paragrypy w płucach 4 dni po zakażeniu w porównaniu ze zwierzętami nieuwrażliwionymi (Figura 1A). Uczulenie i prowokacja owoalbuminą spowodowały znaczny wzrost liczby eozynofili w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, jak również makrofagów i neutrofili (Figura 1B).

Rysunek 1. Uczulanie na albuminę jaja kurzego i prowokacja zwiększa usuwanie infekcji wirusem paragrypy w płucach in vivo. (A) Myszy C57BL/6 uczulono (dootrzewnowo, dni 1 i 14) i prowokowano (dotchawiczo, dni 24, 26 i 28) owoalbuminą i zakażono wirusem paragrypy (donosowo, dzień 27). RNA wirusa paragrypy oznaczono ilościowo metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym 4 dni po zakażeniu. Uczulone i prowokowane myszy miały znacznie zmniejszone RNA wirusa paragrypy w płucach w porównaniu z nieuwrażliwionymi myszami kontrolnymi zakażonymi paragrypą. (b) Uczulenie i prowokacja owoalbuminą zwiększyło całkowitą liczbę komórek zapalnych, makrofagów (MΦ), eozynofili (Eos) i neutrofili (Neut) w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w porównaniu z nieuczulonymi kontrolami. Nie było różnic w limfocytach (limfocytach) między grupami (n = 5). *P < 0,05 w porównaniu z nieuwrażliwionymi myszami kontrolnymi zakażonymi paragrypą. Dane przedstawiono jako średnie (±SEM).

Myszy NJ.1726 (↑Eos ↑IL-5) konstytutywnie wyrażają IL-5 w nabłonku płuc i mają podwyższoną liczbę eozynofili w płucach (23). W 4 dni po zakażeniu, RNA paragrypy uległo znacznemu zmniejszeniu w płucach myszy NJ.1726 w porównaniu z kontrolnymi osobnikami z tego samego miotu typu dzikiego (Figura 2A). Myszy transgeniczne NJ.1726 IL-5 skrzyżowano z myszami PHIL (ØEos), które są wrodzone pozbawione eozynofili, aby odróżnić wpływ eozynofili od IL-5. Zawartość RNA paragrypy w płucach myszy NJ.1726-PHIL z ekspresją IL-5 z niedoborem eozynofili (ØEos ↑IL-5) była podobna do tej u zakażonych myszy typu dzikiego, co wskazuje, że eozynofile, a nie IL-5, pośredniczyły działanie przeciwwirusowe. Podobnie, same myszy PHIL z niedoborem eozynofili miały poziomy RNA wirusa paragrypy porównywalne z zakażonymi myszami typu dzikiego (Figura 2A). Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe potwierdziło znaczny wzrost liczby eozynofili w drogach oddechowych myszy NJ.1726 w porównaniu z kontrolami myszy z tego samego miotu typu dzikiego oraz brak eozynofili u myszy PHIL i NJ.1726-PHIL (Figura 2B). Nie było istotnych różnic w całkowitej liczbie leukocytów lub innych podzbiorów komórek zapalnych w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych między grupami (Figura 2C).

Rysunek 2. Eozynofile wspomagają usuwanie wirusa paragrypy w płucach myszy in vivo. Myszy kontrolne typu dzikiego (WT) (C57BL/6), myszy transgeniczne z wysokim poziomem eozynofili w płucach z powodu nadekspresji IL-5 przez promotor specyficzny dla płuc (NJ.1726 ↑Eos ↑IL-5), myszy transgeniczne z wysokim poziomem płuc IL-5, ale pozbawione eozynofili (NJ.1726-PHIL ØEos ?IL-5) i myszy z niedoborem eozynofili (myszy transgeniczne PHIL ØEos) zostały zakażone wirusem paragrypy (donosowo). (A) Zawartość RNA paragrypy w płucach oznaczono ilościowo za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym 4 dni po zakażeniu. Myszy NJ.1726 (↑Eos ↑IL-5) miały znacznie zmniejszone RNA paragrypy w porównaniu z myszami kontrolnymi (WT). Myszy NJ.1726-PHIL (ØEos ↑IL-5) i myszy PHIL (ØEos) miały poziomy RNA paragrypy porównywalne z WT. (b) Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe od myszy NJ.1726 zakażonych paragrypą (↑Eos ↑IL-5) zawierało znacznie więcej eozynofili w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami. Nie wykryto eozynofili w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych u myszy PHIL (ØEos) lub NJ.1726-PHIL (ØEos ↑IL-5). (C) Nie było różnic w innych typach komórek zapalnych między grupami (n = 7–10). *P <0,05. Dane przedstawiono jako średnie (±SEM).

Peroksydaza eozynofilowa jest ziarnistym białkiem uwalnianym przez eozynofile. Myszy typu dzikiego i transgeniczne z niedoborem peroksydazy eozynofilowej uwrażliwiono i prowokowano albuminą jaja kurzego oraz zakażono wirusem paragrypy. RNA wirusa paragrypy oznaczono ilościowo z homogenizowanego płuca metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym 4 dni po zakażeniu. Uczulenie i prowokacja owoalbuminą były związane ze znacznie zmniejszonym RNA wirusa paragrypy zarówno u myszy typu dzikiego, jak i z niedoborem peroksydazy eozynofilów w porównaniu z nieuwrażliwionymi kontrolami (Figura 3A), co wskazuje, że działanie przeciwwirusowe zależne od eozynofilów nie było zależne od uwalniania peroksydazy eozynofilowej. Uczulone i prowokowane myszy typu dzikiego iz niedoborem peroksydazy eozynofilowej miały znacząco podwyższony poziom eozynofili w drogach oddechowych w porównaniu z nieuwrażliwionymi myszami typu dzikiego iz niedoborem peroksydazy eozynofilowej (Figury 3B i 3C).

Rysunek 3. Peroksydaza eozynofilowa nie jest wymagana do działania przeciwwirusowego eozynofilów in vivo. (A) Myszy WT i myszy pozbawione peroksydazy eozynofili (EPX -/- ) uczulono i prowokowano (S/C) albuminą jaja kurzego i zakażono wirusem paragrypy. Wirusowe RNA oznaczono ilościowo metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym 4 dni po zakażeniu. Uczulone i prowokowane myszy WT (WT S/C) i EPX -/- (EPX -/- S/C) miały znacznie zmniejszone RNA paragrypy w płucach w porównaniu z nieuwrażliwionymi, zakażonymi paragrypą myszami kontrolnymi. (b) Uczulenie owoalbuminy i prowokacja zwiększyły eozynofile w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego u myszy WT i EPX -/- w porównaniu z nieuczulonymi kontrolami. (C) Nie było różnic w innych typach komórek zapalnych między grupami (n = 4–5). *P <0,05. Dane przedstawiono jako średnie (±SEM).

Wyizolowane ludzkie eozynofile inokulowano paragrypą przez 2 godziny, a następnie płukano w celu usunięcia niezwiązanego wirusa i hodowano w świeżej pożywce przez 72 godziny, aby ocenić, czy paragrypy bezpośrednio infekuje eozynofile, a jeśli tak, czy eozynofile wspomagają wytwarzanie potomstwa wirusa. RNA paragrypy, oznaczone ilościowo metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym z supernatantów hodowli, stopniowo wzrastało w ciągu 72 godzin (Figura 4, lewa oś), wskazując, że wirus jest zdolny do infekowania eozynofili i wytwarzania transkryptów wirusowych. Jednak pomimo replikacji miana wirusa paragrypy, określone w teście hemadsorpcji, pozostały niewykrywalne w tych punktach czasowych (Figura 4, prawa oś), wskazując, że eozynofile nie sprzyjają wytwarzaniu zakaźnego wirusa.

Rysunek 4. Eozynofile zakażone paragrypą wytwarzają wirusowe potomstwo, które nie jest zakaźne. Ludzkie eozynofile izolowano z krwi obwodowej i infekowano wirusem paragrypy przez 2 godziny, płukano w celu usunięcia niezwiązanego wirusa i utrzymywano w hodowli przez 72 godziny. RNA paragrypy z supernatantów eozynofili oznaczano ilościowo metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym co 24 godziny (pełny kwadrat, lewa oś). Równocześnie miana zakaźnego wirusa paragrypy oceniano w teście hemadsorpcji przy użyciu komórek nerki małpy rezus i wyrażano jako 50% dawkę zakaźną dla hodowli tkankowej (TCID50) j/ml (otwarty krąg, prawa oś) (n = 4). Dane przedstawiono jako średnie (±SEM).

Poziomy RNA kodującego trzy białka strukturalne wirusa paragrypy (tj. białko macierzy, białko fuzyjne i nukleoproteinę) porównano 2 godziny po zaszczepieniu między zakażonymi wirusami hodowlami eozynofilów i hodowlami z pożywką zaszczepioną wirusem, aby określić, czy działanie przeciwwirusowe za pośrednictwem eozynofili wynikało z uwolnienia RNaz w granulkach eozynofilów. Jednocześnie w tym momencie w komórkach RMK oceniano miana wirusa paragrypy za pomocą testu hemadsorpcji. Eozynofile znacząco zmniejszyły miana wirusa paragrypy w porównaniu z hodowlami zaszczepionymi wirusem bez eozynofili, pokazując, że eozynofile zmniejszają zakaźność wirusa paragrypy (Figura 5A). Dalsze zmniejszenie miana wirusa zaobserwowano, gdy eozynofile wstępnie potraktowano IFNγ. Jednak ilości RNA dla wszystkich trzech białek strukturalnych wirusa paragrypy były podobne między hodowlami zawierającymi eozynofile zakażone wirusem i hodowlami zakażonymi wirusem pozbawionymi eozynofili (Rysunek 5B), co wskazuje, że zmniejszona zakaźność nie była spowodowana degradacją genomu wirusowego RNA przez RNazy w granulkach eozynofilów.

Rysunek 5. Aktywność przeciwwirusowa eozynofilów przeciwko paragrypie nie obejmuje ziarnistych RNaz. Ludzkie eozynofile wyizolowano z krwi obwodowej i zakażono wirusem paragrypy. (A) Zakaźność wirusa została oceniona 2 godziny po zaszczepieniu za pomocą testu hemadsorpcji i wyrażona jako wirusowy TCID50 U/ml. Zakaźność paragrypy była prawie niewykrywalna w supernatantach hodowanych granulocytów eozynochłonnych (Eos) i granulocytów eozynochłonnych wstępnie traktowanych IFNγ (Eos + IFNγ) w porównaniu z wirusem paragrypy hodowanym w pożywce bez granulocytów eozynochłonnych (Podłoże + IFNγ). (b) RNA kodujący białka strukturalne wirusa paragrypy, macierz, fuzję i nukleoproteinę (NP) oznaczono ilościowo w supernatantach eozynofili metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym 2 godziny po zaszczepieniu. Nie wykryto różnic między żadnym z trzech genów, co sugeruje, że zmniejszenie zakaźności paragrypy nie było spowodowane degradacją wirusowego RNA przez RNazy ziarniste eozynofilów (n = 4–7). *P <0,05. Dane przedstawiono jako średnie (±SEM).

Wirus paragrypy inkubowano w obecności wyizolowanych ludzkich eozynofili przez 2 godziny, a następnie oznaczono ilościowo zakaźność wirusa przez miareczkowanie w komórkach RMK (za pomocą testu hemadsorpcji). Jak pokazano na Figurze 6A, eozynofile znacząco obniżyły miana wirusa paragrypy w porównaniu z paragrypą inkubowaną w pożywce bez eozynofili. Eozynofile hodowano z inhibitorem syntazy tlenku azotu, l -NAZWA, aby określić, czy działanie przeciwwirusowe, w którym pośredniczą eozynofile, było spowodowane wytwarzaniem tlenku azotu. Eozynofile leczone l -NAME lost their ability to reduce virus titers, indicating that, upon exposure to virus, eosinophils attenuate viral infectivity through the production of nitric oxide ( Figure 6A ). The quantity of nitric oxide produced by eosinophils was evaluated with a copper-conjugated intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe 1 hour after addition of virus. Eosinophils exposed to parainfluenza virus had significantly increased fluorescence, indicating that eosinophils produce nitric oxide in response to parainfluenza infection. This increased fluorescence was blocked by l -NAME, confirming that nitric oxide was the mediator responsible ( Figures 6B and 6C ).

Rysunek 6. Eosinophil-derived nitric oxide reduces parainfluenza virus infectivity. Human eosinophils isolated from peripheral blood were cultured overnight with IFNγ. (A) Eosinophils were treated with the nitric oxide synthase inhibitor Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride ( l -NAME 100 μM) or vehicle for 30 minutes, then infected with parainfluenza virus. Virus infectivity was quantified 2 hours after infection by hemadsorption assay and expressed as viral TCID50 U/ml. Parainfluenza virus infectivity was significantly decreased in the presence of eosinophils. Eosinophils treated with l -NAME lost their antiviral activity (n = 4). (b) Nitric oxide production was assessed using an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils loaded with the probe were treated with l -NAME or vehicle and infected with parainfluenza for 1 hour. Eosinophil fluorescence increased significantly in response to parainfluenza infection, indicating an increase in nitric oxide production by eosinophils. ja -NAME treatment prevented parainfluenza-induced nitric oxide production by eosinophils (n = 4). (C) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05. Data are presented as means (±SEM).

Eosinophils were cultured with or without IFNγ overnight. IFNγ increased eosinophil TLR7 expression relative to unstimulated eosinophils, both quantitatively by real-time RT-PCR ( Figure 7A ) and qualitatively by immunostaining ( Figure 7B ). Eosinophils’ response to TLR7 agonist was also evaluated with a nitric oxide–detecting fluorescent probe. Eosinophils treated for 1 hour with the synthetic TLR7 agonist, R837, had significantly increased fluorescence compared with vehicle-treated controls, indicating that TLR7 agonist induces nitric oxide production ( Figures 7C and 7D ). R837-mediated nitric oxide production was potentiated in eosinophils exposed to IFNγ. ja -NAME and the oligonucleotide TLR7 antagonist, IRS661, but not a control oligonucleotide, blocked R837-induced nitric oxide production.

Rysunek 7. IFNγ up-regulates Toll-like receptor 7 (TLR7) expression and potentiates TLR7-induced nitric oxide production in eosinophils. Human eosinophils were isolated from peripheral blood and grown in culture. (A) TLR7 expression was quantified by real-time RT-PCR from eosinophils treated with or without IFNγ. TLR7 RNA was significantly increased in eosinophils treated with IFNγ compared with untreated eosinophils (n = 5). (b) Eosinophils were immunostained with antibodies against TLR7 (green), and nuclei were labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (blue). TLR7 was expressed in unstimulated (−IFNγ) and IFNγ stimulated (+IFNγ) eosinophils. Images obtained with an LSM780 confocal microscope (numerical aperture 1.4 Zeiss, Thornwood, NY). (C) Eosinophils were loaded with an intracellular nitric oxide–detecting fluorescent probe and stimulated with synthetic TLR7 agonist R837. Eosinophil fluorescence increased in response to R837. IFNγ pretreatment potentiated the R837-induced increase in fluorescence. R837-induced fluorescence was blocked by l -NAME and by the oligonucleotide TLR7 antagonist IRS661, but not by a control oligonucleotide (IRS control) (n = 6). (D) Representative images of eosinophils loaded with nitric oxide–detecting fluorophore. Magnification, ×100. *P < 0.05 compared with no IFNγ control. # P < 0.05 compared with all other groups, except between IFNγ-treated R837 and R837 + IRS control. Data are presented as means (±SEM).

Our results demonstrate a significant antiviral effect of eosinophils on parainfluenza virus infection in mouse airways in vivo and in isolated human eosinophils in vitro. Eosinophils appear to mediate their antiviral effects via both passive and proactive mechanisms. Specifically, our data show that eosinophils are a “dead-end” cellular host for parainfluenza, failing to propagate infectious viral progeny after infection. Thus, elevated eosinophil numbers in the lung may passively disrupt airway infection by acting as a cellular decoy and/or “sink,” interfering with the progressive expansion of viral numbers during infection. Our data also show that eosinophils proactively mediated antiviral activities through the production of nitric oxide and up-regulation of TLR7. In contrast, we did not find evidence that eosinophils directly attenuate parainfluenza through the release of eosinophil peroxidase or by degrading the viral RNA genome through the release of granule RNases.

These findings expand on prior eosinophil studies (12–14, 17, 18, 27) by establishing an antiviral role for eosinophils against parainfluenza virus, while suggesting that key differences exist in the eosinophils’ antiviral mechanisms against different viruses. Previous studies proposed that eosinophils inhibit RSV and pneumonia virus in mice, in part via the degradation of viral RNA genomes by eosinophils’ granule RNases, eosinophil cationic protein, and eosinophil-derived neurotoxin (13, 17, 18). However, we found that eosinophils did not alter the quantity of viral RNA transcripts for three key parainfluenza virus structural proteins (i.e., matrix, fusion, and nucleoprotein), despite causing a substantial reduction in parainfluenza infectivity, titered in RMK cells by hemadsorption assay. This suggests that eosinophils do not inhibit parainfluenza through RNase activity on the viral genome. Importantly, our methods differed from prior studies by quantifying both viral RNA and infectivity compared with only assessing viral infectivity after treating infected eosinophils with RNase inhibitors. Concurrent measurement of viral RNA levels and infectivity led to the additional finding that, although human eosinophils infected with parainfluenza produce viral RNA, these viral progeny are not infectious. This phenomenon, termed an “abortive” infection, has been described for many viruses, including RSV (28) and coronavirus (29) in macrophages, and influenza A in neutrophils (30), as well as for parainfluenza virus in Madin-Darby bovine kidney cells (31) and chick embryo fibroblasts (32). Evidence suggests that specific virus and host cell characteristics impact productive versus abortive outcomes during virus infections (33), but those characteristics require further investigation.

Eosinophils also inhibit parainfluenza through the production of nitric oxide. Previously, systemic suppression of nitric oxide production using an inhibitor of nitric oxide synthase delayed clearance of RSV in wild-type mice and in IL-5 transgenic animals with systemic eosinophilia in vivo (12, 34). Given the widespread expression of nitric oxide synthases, however, these studies were unable to distinguish the specific role of eosinophil-derived nitric oxide, which our study has elucidated. The ability of eosinophils to produce nitric oxide has been suspected for some time, given the presence of both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms in eosinophils (35), but detecting nitric oxide has historically been challenging due to its short half-life and rapid diffusion across biologic membranes (36). These issues were overcome by using a copper-conjugated intracellularly retained fluorescent probe. We found that eosinophils generate nitric oxide in response to virus infection, and in response to stimulation with synthetic TLR7 agonist. IFNγ potentiated TLR7-mediated nitric oxide production in eosinophils, likely in part through the up-regulation of TLR7 expression. Thus, our results show that antiviral cytokine signaling augments eosinophils’ viral detection and their antiviral nitric oxide response.

Nitric oxide mediates antiviral effects via the production of a variety of reactive nitrogen products that inhibit viral proteases (37), and alter host cell function through nitrosylation of tyrosine and thiol groups (38). The consequences of these nitrogen species are diverse, ranging from inhibition of virus protein and RNA synthesis to potentiation of inflammation and injury to the respiratory tract (39). Nitric oxide also regulates many other physiologic processes, including eosinophil migration (40) and survival (41, 42), airway epithelial cell ciliary motility (43), and airway caliber through airway smooth muscle relaxation (44). Eosinophil-derived nitric oxide may affect multiple functions in the airway beyond what our experiments were designed to assess.

Eosinophils’ attenuation of parainfluenza virus infection was not dependent on the release of eosinophil peroxidase. Eosinophil peroxidase is a granule protein that, together with the respiratory burst from activated eosinophils, generates potent reactive oxygen species that have been suggested to contribute to host immune defense (45). For example, eosinophil peroxidase has been shown to have virucidal effects against human immunodeficiency virus in vitro (46). However, the role of eosinophil peroxidase in vivo as a host defense mechanism remains unclear. Eosinophil peroxidase deficiency had no effect in an experimental model of helminthic parasite infections in mice (47), and its deficiency has also been detected in humans without manifesting an apparent phenotype (48). Our data further suggest that eosinophil peroxidase has no role in eosinophils’ antiviral activity against parainfluenza.

Importantly, our experiments differentiate the effects of eosinophils’ versus IL-5. Although NJ.1726 IL-5 transgenic mice (↑Eos ↑IL-5) with an abundance of airway eosinophils had reduced parainfluenza virus in the lung, NJ.1726-PHIL mice (ØEos ↑IL-5) with elevated IL-5 in the absence of eosinophils did not. This is pertinent given the presence of IL-5 receptors on leukocytes other than eosinophils, including macrophages and neutrophils (49), which could have contributed to the antiviral effect in vivo. Furthermore, our data demonstrate that, although an induced airway eosinophilia promoted viral clearance, clearance of virus was similar for eosinophil-deficient mice relative to wild-type control animals. This suggests that the presence of a specific airway eosinophilia mediates one or more unique antiviral mechanisms not occurring at homeostatic baseline, and underlines the need for better characterization of asthma phenotypes when evaluating respiratory virus infections in humans.

Human studies have historically been confounded by the heterogeneity of asthma phenotypes (50), the need for invasive bronchoscopic testing, the immune effects of corticosteroid treatment, differences in virus detection methods (i.e., PCR, ELISA, culture) and the variety of respiratory viruses that cause asthma exacerbations (20). Recent trials that studied exacerbation rates in well characterized steroid-resistant eosinophilic subjects with asthma treated with mepolizumab, a monoclonal antibody against IL-5, found no difference in the incidence of respiratory tract infections (4, 5). However, airway infections were rare events, and were diagnosed clinically without objective evidence of the presence of an infecting virus. Furthermore, these trials did not quantify airway and lung parenchymal eosinophils, nor did they characterize the eosinophils’ activation state after treatment. Nonetheless, future studies that define the interaction between eosinophils and viruses may lead to novel treatment targets for eosinophilic asthma and for respiratory virus infections in humans.

The results of our study paradoxically suggest that eosinophils have beneficial antiviral effects during respiratory virus infections despite considerable evidence linking viruses to asthma exacerbations (20, 21). However, we cannot conclude that eosinophils’ antiviral effects result in fewer exacerbations. On the contrary, it is possible, and perhaps likely, that eosinophils’ ability to detect and respond to viruses promotes an exuberant, and ultimately detrimental, airway inflammatory response in subjects with asthma. Although our study did not specifically address airway physiology, Adamko and colleagues (14) found that eosinophils mediate virus-induced airway hyperreactivity in sensitized guinea pigs, and were associated with lower viral titers, yet lower viral titers did not improve airway hyperreactivity. Thus, the negative effects of activated eosinophils’ in the airway may mask any positive impact from fewer viral transcripts. Consequently, as therapies become progressively more targeted against pulmonary eosinophils, there will be an even greater need for understanding the complexity of eosinophil biology in the lungs.


Advantages & Limitations of scRNA-Seq Assays

scRNA-Seq is a very powerful method that allows transcriptomic analysis of heterogeneous tissue, or dynamic processes in one single experiment. Without microdissection or FACS-sorting, samples can be directly prepared for the scRNA-Seq protocol. Depending on the number of cells and the sequencing depth, scRNA-Seq can be very sensitive and detect a population representing less than 1% of the total population.

Because of the quantity of information generated by scRNA-Seq, some of the protocol steps have to be handled with care. The preparation of the single-cell solution can be challenging especially for tissues or cells surrounded by an extracellular matrix. The protocols used to isolate these cells can by themselves modify the transcriptome and the sequencing data could be the result of these manipulations instead of an endogenous cellular process. In contrast, for bulk RNA-Seq, tissues can be directly lysed in trizol, freezing the transcriptome at the very first step of the extraction. scRNA-Seq identifies fewer transcripts than bulk RNA-Seq and this imperfect coverage can lead to a biased quantification. However, this flaw can be corrected by bioinformatic analysis. Finally, most scRNA-Seq protocols only focus on poly-A RNAs, which excludes all non-coding RNAs.

scRNA-Seq is more expensive and more time-consuming than bulk RNA-Seq but in one experiment, you obtain the transcriptome profile of several populations.


Pulmonary Adenocarcinoma—Pathology and Molecular Testing

Prodipto Pal MD, PhD , . Ming-Sound Tsao MD, FRCPC , in Pulmonary Adenocarcinoma: Approaches to Treatment , 2019

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) is feasible in clinical laboratories, however, with its own set of challenges. As noted earlier, ALK rearrangement has many different candidate fusion partners, even for the ALK-EML4, the most common fusion in NSCLC, there are many fusion variants, largely due to different breakpoint regions on EML4, thus would require a multiplexed approach. However, with RT-PCR-based methods, a priori knowledge of the candidate fusion genes is needed to identify fusion variants which can later be confirmed by subsequent sequencing 101 and has been used in studies with high level of sensitivity albeit with varying level of specificity (85%–100%) compared with FISH. 102,103 A negative result by RT-PCR requires appropriate caution due to the potential of false-negative results due to the missing unknown fusion variants. In addition, RT-PCR assays are dependent on procuring high-quality RNA from FFPE tissue. Newer RNA-based assays are under active development (assays such as NanoString system) that can simultaneously detect various fusion partners as well as offer the added advantage of detecting other driver fusion-type alterations in a multiplexed setup (such as ROS1, RET, etc.). 104–106


Wnioski

In summary, we described an alternative method using Real-Time RT-PCR to determine the rate of mRNA degradation by accurately measuring the number of mRNA molecules relative to total RNA. Using this approach, we obtained a values for the β-actin mRNA half-life in Nalm-6 cells that are comparable to those estimated from Northern blot studies using normal human leukocytes [13]. Therefore, Real-Time RT-PCR is a reliable method for measuring mRNA half-life. Because of its sensitivity, half-life of mRNAs expressed at very low level can be determined in cases in which Northern blots may not be sensitive enough. The length of the amplified fragment is important to determine the mRNA half-life because incomplete or degraded mRNA can interfere with the measurement of the actual mRNA half-life. Ideally, full-length cDNA molecules should be amplified to ensure integrity and identity of the mRNA species. The use of the fluorogenic SYBR Green I dye limits the length of the amplified product (cDNA recommended to be less than 200 bp). However, the use of TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), molecular beacons (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), or fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) could overcome this limitation and allow amplification of longer PCR products. In addition, since multiplex Real-Time RT-PCR can be achieved in the same reaction tube using different fluorogenic dyes, this method could be modified to simultaneously estimate mRNA half-life of several genes. Thus, our approach represents a rapid and sensitive assay to determine mRNA half-life.


Sars-CoV-2 RNA on surfaces poor indicator of quantity, timing of previous contamination

Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Transmission electron micrograph of SARS-CoV-2 virus particles, isolated from a patient. Image captured and color-enhanced at the NIAID Integrated Research Facility (IRF) in Fort Detrick, Maryland. Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

A team of UK investigators has shown that RNA copies recovered from surfaces are a poor indicator for determining the numbers of viable SARS-CoV-2 virus particles.

The research, published in Applied and Environmental Microbiology, a publication of the American Society for Microbiology, found that a common UK isolate of SARS-CoV-2 that may have initially contaminated surfaces in the general environment became undetectable within 48 hours. The isolate of SARS-CoV-2 remained viable for more than twice as long on hydrophobic surfaces as on hydrophilic surfaces.

The materials tested in the study were representative of those in personal protective equipment, as well as high hand-touch sites such as stainless steel.

An impediment to determining how long SARS-CoV-2 remains viable on different surfaces has been that in most cases, viable virus that has landed on surfaces is rarely detected, according to corresponding author Thomas Pottage, BSc, Senior Project Leader—Biosafety and Bioresponse, Public Health England, Porton Down, UK. However, many studies have used reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) successfully to detect viral RNA and use this as an indicator of how much of the virus was previously found on the surface.

Therefore, the investigators first sought to determine the relationship between initial quantities of viable virus, and subsequent RNA copy number on a contaminated surface, hoping that the latter could serve as a surrogate for the former. To test this, they contaminated surfaces of interest with artificially high concentrations of the virus in the laboratory. But there was no clear relationship between the numbers of RNA copies recovered over time to the number of viable virus particles in the initial inoculum. The investigators did observe that the numbers of virus particles decreased quite rapidly.

The relationship in levels of RNA and viable SARS-CoV-2 shows that in previous surface sampling studies where SARS-CoV-2 RNA was recovered, there were likely low concentrations of viable virus on those surfaces at the time of contamination, according to Pottage.

"This study estimates that the SARS-CoV-2 would survive less than two days on surfaces under normal environmental concentrations," said Pottage.

Conversely, artificially high concentrations of SARS-CoV-2 that were deliberately deposited on surgical mask material and stainless steel in a laboratory setting resulted in relatively lengthy persistence, with 99.9% reductions in viable virus taking place over 122 and 114 hours, respectively. Viability dropped the fastest on a polyester shirt, with a 99.9% reduction occurring over 2.5 hours.

"Our results show that the porous but hydrophobic surfaces of the surgical mask and Tyvek coverall produce similar decay rates when compared to the non-porous hydrophobic surfaces of stainless steel," with a reduction in numbers of virus particles of 99.999% over seven days, said the authors. Viable SARS-CoV-2 was recovered from these surface materials over longer periods of time compared to the porous, hydrophilic surfaces tested, cotton and woven polyester.


Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods

Small noncoding RNAs perform multiple regulatory functions in cells, and their exogenous mimics are widely used in research and experimental therapies to interfere with target gene expression. MicroRNAs (miRNAs) are the most thoroughly investigated representatives of the small RNA family, which includes short interfering RNAs (siRNAs), PIWI-associated RNA (piRNAs), and others. Numerous methods have been adopted for the detection and characterization of small RNAs, which is challenging due to their short length and low level of expression. These include molecular biology methods such as real-time RT-PCR, northern blotting, hybridization to microarrays, cloning and sequencing, as well as single cell miRNA detection by microscopy with in situ hybridization (ISH). In this review, we focus on the ISH method, including its fluorescent version (FISH), and we present recent methodological advances that facilitated its successful adaptation for small RNA detection. We discuss relevant technical aspects as well as the advantages and limitations of ISH. We also refer to numerous applications of small RNA ISH in basic research and molecular diagnostics.

Słowa kluczowe: LNA probe PLA Piwi-interacting RNA TIRCA enzyme-labeled fluorescence signal amplification padlock probes rolling circle amplification short interfering RNA tyramide signal amplification.

Figury

Types of nucleotide modifications used…

Types of nucleotide modifications used in small RNA ISH probes. ( A )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( A )…

Sequence amplification and detection methods…

Sequence amplification and detection methods for small RNA ISH include ( A )…


Obejrzyj wideo: Reverse Transcription PCR (Czerwiec 2022).


Uwagi:

  1. Edmund

    Przepraszam za wtrącanie się... Zdaję sobie sprawę z tej sytuacji. Wejdź, omówimy.

  2. Larson

    Zgadza się, raczej użyteczny kawałek

  3. Jomei

    Co za miła myśl

  4. Kazuo

    Całkiem dobrze! Pomysł doskonały, popieram.

  5. Daik

    dobra historia, wszystko jest ułożone na półkach



Napisać wiadomość