Informacja

Co to jest ApoCas9 w systemie CRISPR-Cas9?

Co to jest ApoCas9 w systemie CRISPR-Cas9?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Obecnie czytam artykuł o konkretnym teście nukleaz Cas9. W jednym z eksperymentów użyli ApoCas9 (warianty Apo innych nukleaz CRISPR) jako pewnego rodzaju kontroli.

Ale w całym artykule nie zdefiniowali ApoCas9? Sprawdziłem online definicję i aktywność ApoCas9, ale natknąłem się na bez żadnych owocnych rezultatów.

Uniwersalna metoda czułego i bezkomórkowego wykrywania nukleaz związanych z CRISPR


Ogólnie "apo" jest używane do wskazania apoenzymu - to jest białkowej części enzymu bez istotnego kofaktora (kofaktorów).

W rzeczywistości jest to zdefiniowane w Eksperymentalny część artykułu:

Cas9/Cpf1 bez gRNA (ApoCas9/Cpf1)

Tak więc w tym przypadku ApoCas9 jest endonukleazą Cas9, która nie jest związana z kierującym RNA.


CRISPR-Cas9


Wprowadzenie do systemu CRISPR/Cas9

Chociaż niedawno opracowane programowalne narzędzia edycyjne, takie jak nukleazy palca cynkowego i nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji, znacznie poprawiły zdolność precyzyjnej modyfikacji genomu, techniki te mają swoje ograniczenia. Technologia CRISPR (zgrupowane regularnie przerywane krótkie powtórzenia palindromiczne)/Cas9 stanowi znaczną poprawę w stosunku do innych narzędzi do edycji genomu nowej generacji, osiągając nowy poziom celowania, wydajności i łatwości użytkowania. System CRISPR/Cas9 pozwala na celowanie genomowe specyficzne dla miejsca w praktycznie każdym organizmie.

System CRISPR/Cas typu II jest prokariotycznym układem adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, który wykorzystuje niekodujące RNA do kierowania nukleazą Cas9 w celu indukcji cięcia DNA specyficznego dla miejsca. To uszkodzenie DNA jest naprawiane przez komórkowe mechanizmy naprawy DNA, za pośrednictwem szlaku naprawy DNA łączącego niehomologiczne końce (NHEJ) lub szlaku naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR).

System CRISPR/Cas9 został wykorzystany do stworzenia prostej, programowalnej przez RNA metody pośredniczącej w edycji genomu w komórkach ssaków i może być stosowany do generowania nokautów genów (poprzez insercję/delecję) lub nokautów (poprzez HDR). Aby wywołać zakłócenia genów (Rysunek 1), generowany jest pojedynczy kierujący RNA (sgRNA), który kieruje nukleazę Cas9 do określonej lokalizacji w genomie. Indukowane Cas9 pęknięcia podwójnej nici są naprawiane przez szlak naprawy DNA NHEJ. Naprawa jest podatna na błędy, a zatem można wprowadzić insercje i delecje (INDEL), które mogą zakłócić funkcję genu.

Zasada rozbijania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Pojedynczy kierujący RNA (sgRNA), składający się z sekwencji crRNA, która jest specyficzna dla docelowego DNA i sekwencji tracrRNA, która oddziałuje z białkiem Cas9 (1), wiąże się z rekombinowaną formą białka Cas9, która ma aktywność endonukleazy DNA (2 ). Powstały kompleks spowoduje specyficzne dla celu rozszczepienie dwuniciowego DNA (3). Miejsce cięcia zostanie naprawione przez szlak naprawy DNA z niehomologicznym łączeniem końców (NHEJ), proces podatny na błędy, który może skutkować insercjami/delecjami (INDEL), które mogą zakłócić funkcję genu (4).

Technologia CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała edycję genomu, umożliwiając wcześniej nieosiągalny poziom celowania, wydajności i prostoty genomu. Produkty Guide-it dodatkowo poprawiają użyteczność systemu CRISPR/Cas9, zapewniając uproszczoną metodę:


Kto jest właścicielem CRISPR w 2021 roku? To jeszcze bardziej skomplikowane niż myślisz

Pytanie, kto jest właścicielem CRISPR, narzędzia do edycji genetycznej, które ma zmienić współczesną medycynę, jest mylącym bałaganem prawnych bitew, niejasnymi konwencjami nazewnictwa i subtelnymi zmianami w formie i funkcji molekularnej. Podmioty, które ostatecznie posiadają prawa patentowe do tych narzędzi, prawie na pewno będą kontrolować, kto może z nich korzystać, w jaki sposób jest używany i ile to kosztuje.

Oryginalna bitwa patentowa CRISPR między UC Berkeley a MIT-Harvard Broad Institute nie była ładna. Walki o patenty rzadko się zdarzają, ale debata o tym, kto jest właścicielem CRISPR-Cas9, jest szczególnie gorąca. Nic dziwnego. Ponieważ CRISPR jest uważany za przyszłość medycyny, możliwość posiadania i licencjonowania pewnej części narzędzia ma kluczowe znaczenie dla wielu firm opartych na oryginalnej technologii CRISPR-Cas9.

Ale kto jest właścicielem CRISPR w 2021 roku, jest znacznie bardziej skomplikowany niż jeszcze kilka lat temu. Ponieważ coraz więcej firm, badaczy i instytucji akademickich składa wnioski patentowe dotyczące subtelnie różnych cząsteczek CRISPR, nie jest już możliwe zawężenie praw własności intelektualnej do zaledwie dwóch lub trzech dużych graczy.

Dlaczego CRISPR ma znaczenie

CRISPR to zasadniczo bakteryjny mechanizm obronny. Kiedy wirus infekuje bakterię (znaną jako bakteriofag), bakteria może wykorzystać cząsteczkę powiązaną z CRISPR (Cas) do przecięcia DNA bakteriofaga. Następnie bakterie wstawiają fragmenty fagowego DNA do własnego genomu, umożliwiając mu w przyszłości rozpoznanie i zniszczenie fagów.

Bakteriofagi wprowadzają swoje DNA (na czerwono, na środku) do bakterii. CRISPR jest zasadniczo bakteryjnym układem odpornościowym, który wycina i przechowuje fagowy DNA, aby bakterie mogły rozpoznać faga i zwalczyć go w przyszłości. Źródło: Victor Padilla-Sanchez, The Catholic University of America, źródło: National Institutes of Health on Flickr

Piękno białek Cas polega na tym, że można je zaprogramować do rozpoznawania i cięcia określonych sekwencji DNA. Dlatego CRISPR jest często określany jako „genetyczne nożyczki”. Dając cząsteczce Cas instrukcje dotyczące tego, gdzie przeciąć DNA za pomocą przewodniej cząsteczki RNA (gRNA), CRISPR może wyłączyć każdy gen, który jest zaprogramowany do znalezienia.

Konsekwencje cięcia DNA są ogromne. Terapeutyki oparte na CRISPR już okazały się obiecujące kliniczne w przypadku schorzeń takich jak dziedziczna ślepota dziecięca i anemia sierpowata. Technologia może wyleczyć wiele chorób genetycznych, wyłączając gen, który nie powinien być włączony. CRISPR może również ciąć DNA, zastępować pęknięcie nowym segmentem i korygować nieprawidłowo działającą mutację genetyczną.

Każdy ma ochotę na kawałek ciasta CRISPR

Najbardziej znaną cząsteczką CRISPR-Cas jest Cas9. Tu zaczyna się pierwotna bitwa patentowa CRISPR, a spór wciąż trwa. Zarówno UC Berkeley, jak i MIT-Harvard Broad Institute zgłosiły prawa własności intelektualnej do CRISPR-Cas9 w 2012 roku. Ponieważ Broad Institute zapłacił za przyspieszenie jego wniosku, jego patenty zostały przyznane jako pierwsze, mimo że UC Berkeley złożył pierwsze. Jednak Urząd Patentów i Znaków Towarowych Stanów Zjednoczonych (USPTO) przestawił się na system „pierwszy w zgłoszeniu”, który wszedł w życie w 2013 r. i przygotował grunt pod bitwę patentową.

Wiele firm założonych na początkowych prawach własności intelektualnej CRISPR-Cas9 również pokrywa się w swoich patentach. Niektóre patenty obejmują jedynie prawo do używania CRISPR-Cas9 w przypadku niektórych chorób lub zastosowań.

Źródła, z którymi skontaktowano się w sprawie tego artykułu, zgodziły się wypowiadać jedynie pod warunkiem zachowania anonimowości i nie cytowania ich bezpośrednio. Tak więc, podczas gdy spory patentowe CRISPR-Cas9 nie są obecnie nagłówkami wiadomości, osoby bezpośrednio zaangażowane w technologię podejmują wszelkie środki ostrożności, aby ich słowa nie zostały błędnie zinterpretowane w bieżącym lub przyszłym postępowaniu sądowym.

Do tej pory firmy założone przez każdego z graczy w głównym sporze patentowym Cas9 to:

Poza sporem patentowym Doudna i Charpentier zostali uznani za współodkrywców „nożyczek” CRISPR. Ich oryginalna współpraca w 2011 roku ostatecznie przyniosła im Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 2020 roku. Było to historyczne zwycięstwo – Doudna i Charpentier stały się pierwszymi kobietami, które podzieliły tę Nagrodę i przyniosła biologii syntetycznej nowy poziom świadomości społecznej.

Cała ta uwaga została skupiona na CRISPR-Cas9. Ale Ca9 to nie tylko jedna cząsteczka. To cały szereg dzikich (naturalnie występujących) i zmodyfikowanych enzymów do wiązania i cięcia DNA. Cząsteczki Cas9 również nie są jedynymi enzymami CRISPR. Całe rodziny kompleksów CRISPR, takie jak Cas12, Cas14, CasX i CasY, zostały odkryte i opatentowane przez różne organizacje, firmy, badaczy i instytucje akademickie.

Nawet konwencje nazewnictwa Cas są mylące. Różne jednostki stosują nieco inne wytyczne nazewnictwa — CasX w jednym systemie nazewnictwa to Cas12e w innym. Niektóre enzymy CRISPR Cas są również blisko spokrewnione z innymi, prawie jak kuzyni molekularni z niewielkim rozróżnieniem między nimi.

Istnieją setki, jeśli nie tysiące odmian Cas, z których wszystkie mogłyby potencjalnie zostać opatentowane. W tym miejscu prawa własności intelektualnej CRISPR stają się jeszcze bardziej rozdrobnione.

Inni gracze w grze patentowej

Pierwsze instytucje, które odkryły CRISPR, nie są jedynymi posiadającymi patenty. Oczywiście, kto początkowo odkrył CRISPR, jest produktem wielu dyskusji. Poza UC Berkeley i Emmanuelle Charpentier, Uniwersytet Wileński również odkrył, jak korzystać z Cas9 w tym samym czasie. Jednak Uniwersytet Wileński został pominięty na oryginalnej liście odkryć, ponieważ nie zademonstrował wszystkich elementów niezbędnych do czynności edycji genetycznej.

CRISPR Cas9 (biały) wykorzystuje Guide RNA do lokalizacji i cięcia docelowej sekwencji DNA. Źródło: WikiMedia

Obecnie firmy takie jak DowDuPont, MilliporeSigma i Cellectis są właścicielami patentów CRISPR-Cas9.

Niektórzy, jak DowDuPoint, kupili swoje umowy patentowe od wielu podmiotów CRISPR, takich jak Caribou Biosciences i Emmanuelle Charpentier. Firma licencjonująca łączenie patentów, MPEG LA, poszła inną drogą. Firma jest w trakcie gromadzenia kilku patentów od różnych firm, co daje jej potencjalny dostęp do szerokiego zakresu własności intelektualnej CRISPR.

Problem polega jednak na tym, że każdy z tych patentów reprezentuje małe segmenty znacznie większego tortu. Nie jest jeszcze jasne, które enzymy Cas lub które odmiany tych enzymów będą ostatecznie przydatne. Tylko dlatego, że badacz lub firma posiada patenty CRISPR-Cas, niekoniecznie oznacza, że ​​kompleksy Cas będą skuteczne w edycji genetycznej. Odkrycie cząsteczek CRISPR Cas jest stosunkowo łatwe. Znalezienie tych, które działają, jest znacznie trudniejsze.

Co jeśli wszyscy są właścicielami CRISPR?

Istnieją cztery możliwe scenariusze przyszłości praw patentowych CRISPR. Jednym z nich jest to, że większość osób ubiegających się o patenty CRISPR odnosi sukcesy. W tym przypadku naukowcom i przedsiębiorcom może być bardzo trudno ustalić, czy cząsteczka Cas jest już opatentowana i kto jest właścicielem tego adresu IP. Może to stworzyć wąskie gardło w badaniach i odkryciach, jeśli naukowcy będą zmuszeni przedzierać się przez wszystkie odmiany CRISPR, aby znaleźć te, których potrzebują.

CRISPR-Cas9 może skorygować mutację genetyczną, która wpływa na produkcję dystrofiny białkowej, będącej podstawową przyczyną dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD). Przywrócenie dystrofiny (zabarwienie na zielono), wyleczenie co najmniej 60% pacjentów z DMD. Źródło: Courtney Young, MS, laboratorium Melissy Spencer, Uniwersytet Kalifornijski, Los Angeles. Źródło: PZH

Drugi scenariusz tworzy świat, w którym wiele instytucji i firm posiada prawa CRISPR, ale jest on stosunkowo zorganizowany (kiedy początkowy kurz w końcu opadnie). Istniałyby zasady regulujące sposób udostępniania i wykorzystywania CRISPR w badaniach, aby uczynić go bardziej dostępnym.

Trzecim scenariuszem byłby monopol na patenty CRISPR-Cas9 przez jednego lub dwóch głównych graczy. Kontrolowaliby krajobraz badań i produkcji, łącząc się z innymi graczami lub wykupując ich. Jest to jednak mało prawdopodobne. Firmy i badacze już opracowali jaśniejsze prawa własności intelektualnej z własnymi iteracjami molekuł, takich jak CasX. Inne firmy opracowały autorskie kompleksy CRISPR. Nawet gdyby wszystkie patenty Cas9 zostały przejęte przez jeden podmiot, na rynku CRISPR-Cas nadal istniałyby inne opcje.

Istnieje również czwarty scenariusz, w którym Cas9 nie stanie się cząsteczką przyszłości. Chociaż Ca9 był pierwszym odkrytym enzymem CRISPR, niekoniecznie jest najłatwiejszy w obsłudze. Kompleksy molekularne, takie jak CasX, są mniejsze, łatwiejsze do dostarczenia pacjentom i powodują mniej cięć genetycznych, które nie są docelowe. Mimo że Cas9 wciąż jest popularny w sporach prawnych, może nie być cząsteczką z wyboru dla wielu zastosowań.

Należy powiedzieć, że instytucje akademickie prawdopodobnie będą miały dostęp do cząsteczek Cas po niewielkich kosztach. Tradycyjnie badacze akademiccy korzystają z opatentowanych narzędzi nauk przyrodniczych, jeśli sami nie planują osiągania zysków.

CRISPR ma i nie ma

Zastosowania CRISPR nie ograniczają się do biofarmaceutyki i terapii. Platformy technologii rolnictwa lub mięsa z kultur komórkowych już wykorzystują technologię CRISPR . Jak dotąd ten system działa wystarczająco dobrze: kilkanaście firm posiada początkowe IP Cas9, udziela na nie licencji i zarabia, jednocześnie opracowując własne produkty i terapie. Tak ma działać system patentowy. Ale w monopolu jednego lub dwóch dużych graczy opłaty licencyjne, które właściciele IP mogliby pobierać, mogą być praktycznie nieograniczone.

Oczekuje się, że inżynieria podstawowych upraw za pomocą CRISPR będzie kluczowym narzędziem w modyfikowaniu upraw w celu uzyskania wyższych plonów i większej odporności na skutki zmiany klimatu. Źródło: DOI: 10.1126/science.aar7191

Druga kwestia pojawia się, gdy firma musi korzystać z CRISPR do wielu zastosowań, ale więcej niż jedna firma posiada segmenty praw CRISPR do określonych zastosowań. Nowsze firmy mogą być zmuszone do płacenia wielu opłat licencyjnych, aby uzyskać dostęp do technologii. Ponieważ opłaty te są zazwyczaj wysokie, zwłaszcza w przypadku tak potężnego narzędzia, jak CRISPR, wiele obiecujących firm może zostać wyeliminowanych z gry przez same opłaty. Taki scenariusz może stłumić innowacyjność i kreatywność naukową.

Nadal chcesz opatentować CRISPR? Oto, co musisz wiedzieć

Największym wyzwaniem dla każdego, kto próbuje uporządkować prawa patentowe CRISPR, jest pełne zrozumienie, ile jest patentów.

Wyszukiwanie w USPTO ujawniło 262 patenty lub zgłoszenia patentowe wymieniające CRISPR-Cas9 i ponad 5000 ogólnych patentów CRISPR. A to tylko wnioski patentowe dla Cas9. Nie obejmuje to rosnącej liczby patentów na inne cząsteczki Cas lub cząsteczki Cas, które nie zostały jeszcze odkryte. Nie obejmuje to również wniosków patentowych w innych dużych regionach biologii syntetycznej, takich jak Chiny, Europa, Wielka Brytania i Izrael.

Konkurencja o patenty CRISPR raczej nie zmniejszy się w przyszłości, ponieważ coraz więcej firm i ośrodków akademickich dołącza do wyścigu. Wyścig staje się coraz bardziej globalny, ponieważ coraz więcej krajów zgłasza patenty CRISPR — nowe patenty są składane w tempie 200 miesięcznie .

Nie jest jasne, w jaki sposób ta ogromna liczba patentów CRISPR wpłynie na przyszłość nauki. Czy utrudnią postęp, ograniczając komercyjne wykorzystanie technologii, czy też naukowcy zwyciężą i udostępnią nowe terapie dla wszystkich? Kiedy opadnie kurz – jeśli w ogóle – istnieje nadzieja, że ​​technologia CRISPR będzie dostępna dla szerokiego zakresu zastosowań po konkurencyjnych kosztach. Możliwości inżynierii biologii nie powinny ograniczać się do nielicznych. Jesteśmy teraz w epoce biologii. Jeśli mamy budować lepszą przyszłość, nie możemy zostawić fundamentalnej obietnicy nauki w kurzu.

Specjalne podziękowania dla Marianny Limas za dodatkowe badania i Lany Bandoim za dodatkowe napisanie do tego utworu.

Chcesz dowiedzieć się więcej o tym, jak biologia syntetyczna zmienia przyszłość medycyny? Dołącz do specjalnego wydarzenia Biopharma SynBioBetaKup bilet już dziś!

Fiona Mischel

Fiona Mischel jest redaktorem naczelnym SynBioBeta. Często zajmuje się zrównoważonym rozwojem, badaniami CRISPR, technologią żywności i rolnictwa oraz biotechnologią w podróżach kosmicznych. Z pasją pokazuje, jak innowacje naukowe mogą zwalczyć nasz kryzys klimatyczny i pozytywnie wpłynąć na społeczności na całym świecie.


Zagadnienia

W kwietniu 2015 r. chińska grupa poinformowała o pierwszym zastosowaniu CRISPR/Cas9 do (nieżywotnych) ludzkich embrionów. Ten rozwój, wraz z malejącymi kosztami technologii, wywołał poważną debatę bioetyczną na temat tego, jak daleko należy stosować tę technologię. Technologia napotyka dwa główne problemy.

Pierwsza kwestia to dylemat filozoficzny. Koncentruje się na zakresie, w jakim CRISPR/Cas9 powinien być używany do zmiany komórek „linii zarodkowej” – komórek jajowych i plemników – które są odpowiedzialne za przekazywanie genów następnemu pokoleniu. Chociaż minie jeszcze wiele lat, zanim technologia będzie możliwa do wykorzystania do tworzenia designerskich dzieci, publiczna debata już się rozpoczęła na ten temat. Obawa jest tak wielka, że ​​niektórzy naukowcy, w tym ci, którzy pomogli pionierowi CRISPR/Cas9, wezwali do moratorium na jego stosowanie w komórkach linii zarodkowej.

Druga sprawa to bezpieczeństwo. Jednym z głównych problemów jest to, że technologia jest wciąż w powijakach, a wiedza na temat genomu pozostaje bardzo ograniczona. Wielu naukowców ostrzega, że ​​technologia nadal wymaga wiele pracy, aby zwiększyć jej dokładność i upewnić się, że zmiany dokonane w jednej części genomu nie wprowadzą zmian w innym miejscu, które mogłyby mieć nieprzewidziane konsekwencje. Jest to szczególnie ważna kwestia, jeśli chodzi o wykorzystanie technologii do zastosowań ukierunkowanych na zdrowie człowieka. Inną krytyczną kwestią jest to, że gdy organizm, taki jak roślina lub owad, zostanie zmodyfikowany, trudno je odróżnić od typu dzikiego, a po uwolnieniu do środowiska może zagrażać bioróżnorodności.

Decydenci wciąż dyskutują o tym, jakie ograniczenia nałożyć na tę technologię. W kwietniu 2015 r. amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia wydały oświadczenie wskazujące, że nie będą finansować żadnych badań wykorzystujących narzędzia do edycji genomu, takie jak CRISPR na ludzkich embrionach. Tymczasem brytyjski Urząd ds. Zapłodnienia i Embriologii Człowieka w Wielkiej Brytanii, do którego kompetencji należałoby takie badanie, wskazał, że technologię CRISPR/Cas9 można stosować na hybrydowych embrionach ludzko-zwierzęcych w wieku poniżej 14 dni. Każdy badacz pracujący w tej dziedzinie musiałby najpierw uzyskać licencję od Urzędu. Inne wiodące brytyjskie rady badawcze wskazały, że popierają dalsze stosowanie CRISPR/Cas9 i innych narzędzi do edycji genomu w badaniach przedklinicznych.

Ponieważ organy regulacyjne debatują, jakie ograniczenia należy wprowadzić w ramach CRISPR/Cas9, technologia stała się przedmiotem poważnego sporu patentowego. Pierwszy wniosek o opatentowanie technologii został złożony przez firmę DuPont w marcu 2007 r. (WO/2007/025097). Obejmuje to wykorzystanie technologii do opracowania szczepów bakterii odpornych na fagi do produkcji żywności, pasz, kosmetyków, produktów higieny osobistej i produktów weterynaryjnych. Od tego czasu trzy mocno finansowane start-upy firm biotechnologicznych i pół tuzina uniwersytetów złożyły wnioski patentowe. W Stanach Zjednoczonych zgłoszono dwa główne konkurencyjne roszczenia patentowe. Pierwsza, złożona 25 maja 2015 r., opiera się na pracy prowadzonej przez Jennifer Doudna z University of California w Berkeley i Emmanuelle Charpentier, pierwotnie na Uniwersytecie Wiedeńskim, a obecnie w Helmholz Center for Infectious Research w Niemczech. Zgłoszenie ma 155 zastrzeżeń i obejmuje liczne zgłoszenia dla różnych typów ogniw (zgłoszenie patentowe USA nr PCT/US2013/032589). Drugi został złożony przez MIT-Harvard Broad Institute w dniu 12 grudnia 2012 r. za pracę Feng Zhanga, która koncentrowała się na wykorzystaniu CRISPR/Cas9 do edycji genomu w komórkach eukariotycznych. Nadano mu status szybkiej ścieżki i został przyznany 15 kwietnia 2014 r. (patent USA nr 8 697 359). W kwietniu 2015 r. Charpentier i uniwersytety Kalifornii i Wiednia złożyli wniosek o patent do Urzędu Patentów i Znaków Towarowych USA. Rozstrzygnięcie sporu patentowego potrwa kilka lat. Prawne spory o patenty raczej nie wpłyną na wykorzystanie CRISPR do badań podstawowych, ponieważ technologia jest dostępna za pośrednictwem repozytorium o otwartym kodzie źródłowym. Może to jednak mieć wpływ na zastosowania kliniczne tej techniki.

Ten profil naukowy został napisany przez Larę Marks w czerwcu 2016 roku przy hojnym udziale Silvii Camporesi, Xiofan Zenga i Jonathana Linda. Utwór został zaktualizowany przez Larę Marks w październiku 2020 r.


Narzędzie „nożyczkowe” do edycji genów CRISPR-Cas9 może być również genetycznym „wyłącznikiem ściemniacza”

W serii eksperymentów z bakteriami hodowanymi w laboratorium naukowcy z Johns Hopkins odkryli dowody na to, że powszechnie stosowany system cięcia genów CRISPR-Cas9— odgrywa drugą rolę jako genetyczny przełącznik ściemniacza genów CRISPR-Cas9. Jego rola polegająca na zmniejszaniu lub zmniejszaniu aktywności CRISPR-Cas9 może pomóc naukowcom w opracowaniu nowych sposobów inżynierii genetycznej komórek do celów badawczych.

Po raz pierwszy zidentyfikowany w genomie bakterii jelitowych w 1987 roku, CRISPR-Cas9 jest naturalnie występującą, ale niezwykłą grupą genów z potencjałem do cięcia sekwencji DNA w innych typach komórek, co zostało zrealizowane 25 lat później. Jego wartość w inżynierii genetycznej – programowalna zmiana genów w żywych komórkach, w tym w komórkach ludzkich – została szybko doceniona, a jego szerokie zastosowanie jako „edytora” genomu w tysiącach laboratoriów na całym świecie zostało docenione w ubiegłorocznej Nagrodzie Nobla w dziedzinie chemii. jej współtwórcy amerykańscy i francuscy.

CRISPR oznacza zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne. Cas9, które odnosi się do białka 9 związanego z CRISPR, to nazwa enzymu, który tworzy wycinek DNA. Bakterie naturalnie wykorzystują CRISPR-Cas9 do cięcia wirusowego lub innego potencjalnie szkodliwego DNA i eliminowania zagrożenia, mówi Joshua Modell, adiunkt biologii molekularnej i genetyki w Johns Hopkins University School of Medicine. W tej roli, Modell, mówi: „CRISPR to nie tylko układ odpornościowy, to adaptacyjny układ odpornościowy, który potrafi zapamiętać zagrożenia, z którymi wcześniej się zetknął, trzymając krótki fragment swojego DNA, co przypomina strzał z kubka”. Te zdjęcia są następnie kopiowane do „kierujących RNA”, które mówią Cas9, co przeciąć.

Naukowcy od dawna pracowali nad odkryciem dokładnych etapów mechanizmu CRISPR-Cas9 oraz tego, jak zwiększa się lub zmniejsza jego aktywność w bakteriach. Poszukiwanie genów, które zapalają lub hamują system cięcia genów CRISPR-Cas9 dla pospolitej bakterii wywołującej paciorkowce Streptococcus pyogenes, naukowcy z Johns Hopkins znaleźli wskazówkę dotyczącą tego, jak działa ten aspekt systemu.

W szczególności naukowcy odkryli gen w systemie CRISPR-Cas9, który po dezaktywacji prowadził do dramatycznego wzrostu aktywności systemu u bakterii. Wydaje się, że produkt tego genu przeprogramowuje Cas9 tak, aby działał jako hamulec, a nie jako „nożyczka”, aby osłabić system CRISPR.

„Z punktu widzenia odporności bakterie muszą zwiększyć aktywność CRISPR-Cas9, aby zidentyfikować i uwolnić komórkę od zagrożeń, ale muszą również zmniejszyć ją, aby uniknąć autoimmunizacji i # 8212, gdy układ odpornościowy błędnie atakuje składniki samych bakterii” – mówi doktorantka Rachael Workman, bakteriolog pracująca w laboratorium Modella.

Aby dokładniej określić szczegóły „hamulca”, kolejnym krokiem zespołu było lepsze zrozumienie produktu dezaktywowanego genu (tracrRNA). RNA jest genetycznym kuzynem DNA i jest niezbędny do wykonywania „instrukcji” DNA do tworzenia białek. TracrRNA należą do unikalnej rodziny RNA, które nie wytwarzają białek. Zamiast tego działają jako rodzaj rusztowania, które pozwala enzymowi Cas9 przenosić kierujące RNA zawierające strzał wirusa inwazyjnego i ciąć pasujące sekwencje DNA wirusa.

TracrRNA występuje w dwóch rozmiarach: długim i krótkim. Większość nowoczesnych narzędzi CRISPR-Cas9 do cięcia genów wykorzystuje formę skróconą. Zespół badawczy odkrył jednak, że dezaktywowany produkt genowy był długą formą tracrRNA, której funkcja jest całkowicie nieznana.

Długie i krótkie formy tracrRNA mają podobną budowę i mają wspólną zdolność wiązania się z Cas9. Krótka forma tracrRNA również wiąże się z kierującym RNA. Jednak długa forma tracrRNA nie musi wiązać się z kierującym RNA, ponieważ zawiera już segment, który naśladuje kierujący RNA. „Zasadniczo, długie formy tracrRNA łączą funkcję krótkiej formy tracrRNA i kierującego RNA” – mówi Modell.

Ponadto naukowcy odkryli, że podczas gdy kierujące RNA zwykle wyszukują wirusowe sekwencje DNA, długie formy tracrRNA celują w sam system CRISPR-Cas9. Długa forma tracrRNA ma tendencję do osiadania na DNA, zamiast go ciąć. Kiedy dzieje się to w określonym obszarze genu, uniemożliwia to ekspresję tego genu lub jego funkcjonowanie.

Aby to potwierdzić, naukowcy wykorzystali inżynierię genetyczną do zmiany długości pewnego regionu w długiej formie tracrRNA, aby tracrRNA wyglądał bardziej jak kierujący RNA. Odkryli, że ze zmienioną długą formą tracrRNA, Cas9 po raz kolejny zachowywał się bardziej jak nożyce.

Inne eksperymenty wykazały, że w bakteriach hodowanych w laboratorium z dużą ilością długiego tracrRNA poziomy wszystkich genów związanych z CRISPR były bardzo niskie. Jednak po usunięciu długiej formy tracrRNA z bakterii ekspresja genów CRISPR-Cas9 wzrosła stukrotnie.

Komórki bakteryjne pozbawione długiej postaci tracrRNA hodowano w laboratorium przez trzy dni i porównywano z podobnie hodowanymi komórkami zawierającymi długą postać tracrRNA. Pod koniec eksperymentu bakterie bez długiej postaci tracrRNA całkowicie wymarły, co sugeruje, że długa postać tracrRNA normalnie chroni komórki przed chorobami i śmiercią, które mają miejsce, gdy aktywność CRISPR-Cas9 jest bardzo wysoka.

„Zaczęliśmy zdawać sobie sprawę, że długa forma tłumi, ale nie eliminuje własnej działalności związanej z CRISPR”, mówi Workman.

Aby sprawdzić, czy długa forma tracrRNA może zostać przeprogramowana w celu tłumienia innych genów bakteryjnych, zespół badawczy zmienił region rozdzielający długiej formy tracrRNA, aby mógł osadzić się na genie wytwarzającym zieloną fluorescencję. Bakterie z tą zmutowaną wersją długiej postaci tracrRNA świeciły mniej zielonym światłem niż bakterie zawierające normalne długie tracrRNA, co sugeruje, że długie tracrRNA można genetycznie modyfikować w celu osłabienia innych genów bakteryjnych.

Naukowcy odkryli również składniki genetyczne długiego tracrRNA w około 40% bakterii z grupy Streptococcus. Dalsze badania szczepów bakteryjnych, które nie mają długiej postaci tracrRNA, mówi Workman, potencjalnie ujawnią, czy ich systemy CRISPR-Cas9 są nienaruszone, oraz inne sposoby, w jakie bakterie mogą wycofać system CRISPR-Cas9.

Jak mówi Modell, zdolność ściemniania, którą odkryły eksperymenty, daje możliwość zaprojektowania nowych lub lepszych narzędzi CRISPR-Cas9, których celem jest regulowanie aktywności genów do celów badawczych. „W scenariuszu edycji genów badacz może chcieć wyciąć konkretny gen, oprócz użycia długiej formy tracrRNA do zahamowania aktywności genów” – mówi.


Nowa, szybka metoda CRISPR/Cas9 identyfikuje kluczowe geny w regeneracji rdzenia kręgowego danio pręgowanego

Nowe, szybkie podejście do badań przesiewowych wykorzystuje technologię CRISPR/Cas9 do identyfikacji genów związanych z układem odpornościowym, które odgrywają kluczową rolę w leczeniu urazów rdzenia kręgowego danio pręgowanego. Marcus Keatinge i Themistoklis Tsarouchas z Uniwersytetu w Edynburgu w Wielkiej Brytanii wraz z kolegami prezentują te odkrycia w ogólnodostępnym czasopiśmie PLOS Genetyka.

U ludzi i innych ssaków zerwane połączenia nerwowe rdzenia kręgowego nie goją się, więc uraz rdzenia kręgowego może prowadzić do trwałego paraliżu. W przeciwieństwie do tego, danio pręgowany jest w stanie wyzdrowieć po uszkodzeniu rdzenia kręgowego w procesie, który obejmuje stan zapalny kontrolowany przez makrofagi – rodzaj komórki układu odpornościowego. Jednak dokładny proces, dzięki któremu makrofagi wspomagają regenerację rdzenia kręgowego u danio pręgowanego, pozostaje tajemnicą.

Aby pomóc wyjaśnić ten proces, Keatinge, Tsarouchas i współpracownicy opracowali nową metodę szybkiej identyfikacji genów powiązanych z makrofagami, które są zaangażowane w regenerację rdzenia kręgowego danio pręgowanego. Strategia wykorzystuje technologię CRISPR/Cas9, która umożliwia naukowcom namierzanie i zakłócanie określonych genów, ujawniając w ten sposób ich funkcję. Cząsteczki znane jako syntetyczne RNA Oligo CRISPR kierujące RNA (sCrRNA) umożliwiają to ukierunkowanie specyficzne dla genu.

Naukowcy zastosowali nową metodę do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego. Kluczem do metody był etap wstępnego badania przesiewowego, w którym przetestowano ponad 350 sCrRNA, których celem są geny, o których już wiadomo, że potencjalnie odgrywają ważną rolę w regeneracji rdzenia kręgowego związanej z zapaleniem. Wprowadzenie tych sCrRNA do danio pręgowanego umożliwiło zidentyfikowanie 10 genów, które po przerwaniu utrudniały powrót do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego.

Dalsza analiza zawęziła listę do czterech genów, które wydają się mieć kluczowe znaczenie dla naprawy uszkodzonych połączeń nerwów rdzeniowych, co potwierdziło nową metodę. W szczególności jeden gen, tgfb1, wydaje się odgrywać istotną rolę sygnalizacyjną w kontrolowaniu stanu zapalnego podczas procesu zdrowienia.

Nowa metoda i odkrycia mogą pomóc pogłębić wiedzę na temat regeneracji rdzenia kręgowego u danio pręgowanego. Naukowcy twierdzą również, że metodę można by dostosować do badań przesiewowych pod kątem genów, które odgrywają również ważną rolę w innych procesach biologicznych.

Autorzy dodają: „Danio pręgowany może w pełni zregenerować swój rdzeń kręgowy po urazie. Korzystając z nowej i bardzo szybkiej platformy badań przesiewowych, odkrywamy geny układu odpornościowego, które są niezbędne do regeneracji. Przewidujemy, że nasze odkrycia doprowadzą do nowego wglądu w niezdolność ssaki do regeneracji, a nasza wszechstronna platforma badań przesiewowych może być dostosowana do innych modeli chorób lub urazów u danio pręgowanego”.


CRISPR-Cas9 do terapii: wyzwania i sposoby ich przezwyciężenia

Sundaram Aczarja , . Debojyoti Chakraborty, w inżynierii genomu za pośrednictwem systemu CRISPR-Cas9, 2020

Abstrakcyjny

Zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne/związane z CRISPR (CRISPR Cas) są składnikiem prokariotycznego adaptacyjnego układu odpornościowego, który w ostatnich latach został ponownie wykorzystany do edycji genomu. Precyzja, prostota i elastyczność tego systemu otworzyły szeroki zakres zastosowań biologicznych, obejmujących badania podstawowe, biotechnologię i medycynę. Ponadto możliwości multipleksowania CRISPR oferują obiecujące podejście do modelowania lub korygowania powszechnych zaburzeń poligenicznych wraz z ich jednogenowymi i zakaźnymi odpowiednikami. Chociaż CRISPR nie jest całkowicie precyzyjny i pozostają pytania dotyczące jego specyficzności i sposobów dostarczania, solidność i szerokie zastosowanie tego narzędzia do edycji genomu otworzyły wiele sposobów rozwiązania tych problemów. W tym rozdziale omówimy wstępne postępy w kierunku terapii CRISPR, istniejące sposoby dostarczania, wyzwania przed redakcją CRISPR, zanim stanie się to możliwością terapeutyczną, oraz bieżące wysiłki w kierunku opracowania doskonałego systemu CRISPR do zastosowania od ławki do łóżka.


Czym jest ApoCas9 w systemie CRISPR-Cas9? - Biologia

CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, Mathura Road, New Delhi 110025, Indie
E-mail: [email protected], [email protected]

Abstrakcyjny

System CRISPR–Cas9 zrewolucjonizował proces wprowadzania zmian w sekwencji DNA organizmów. Opierając się na uproszczonym modelu wiązania i rozszczepiania DNA kierowanego przez RNA, ten zestaw narzędzi molekularnych znalazł zastosowanie w prawie każdej gałęzi nauk biologicznych. Historia CRISPR-Cas9 to historia odkrycia i rozwoju, w której składnik bakteryjnej odporności adaptacyjnej został wykorzystany do rozwiązania ważnych problemów biologicznych przy użyciu istotnych danych z fizykochemicznych badań struktury i funkcji. In this review, we trace the evolution of CRISPR–Cas9 from its predecessor genome editing tools and document its current status with an emphasis on chemical biology aspects of modulating its activity to generate a potent tool for gene therapy applications.


We would like to thank the Sharp lab members for discussion and critical reading of the manuscript, and M. Lindstrom for assistance on constructing figures. This work was supported by United States Public Health Service grants RO1-GM34277 and R01-CA133404 from the National Institutes of Health (P.A.S.), PO1-CA42063 from the National Cancer Institute (P.A.S.), and partially by Cancer Center Support (core) grant P30-CA14051 from the National Cancer Institute. X.W. is a Howard Hughes Medical Institute International Student Research fellow.

Conflict of Interests: The authors Xuebing Wu, Andrea J. Kriz and Phillip A. Sharp declare that they have no conflict of interests.

Supplementary Materials: The supplementary materials can be found online with this article at DOI 10.1007/s40484-014-0030-x.


New understanding of CRISPR-Cas9 tool could improve gene editing

The 3D structure of a base editor, comprised of the Cas9 protein (white and gray), which binds to a DNA target (teal and blue helix) complementary to the RNA guide (purple), and the deaminase proteins (red and pink), which switch out one nucleotide for another. (UC Berkeley graphic by Gavin Knott and Audrone Lapinaite)

Within a mere eight years, CRISPR-Cas9 has become the go-to genome editor for both basic research and gene therapy. But CRISPR-Cas9 also has spawned other potentially powerful DNA manipulation tools that could help fix genetic mutations responsible for hereditary diseases.

Researchers at the University of California, Berkeley, have now obtained the first 3D structure of one of the most promising of these tools: base editors, which bind to DNA and, instead of cutting, precisely replace one nucleotide with another.

First created four years ago, base editors are already being used in attempts to correct single-nucleotide mutations in the human genome. Base editors now available could address about 60% of all known genetic diseases – potentially more than 15,000 inherited disorders — caused by a mutation in only one nucleotide.

The detailed 3D structure, reported in the July 31 issue of the journal Nauki ścisłe, provides a roadmap for tweaking base editors to make them more versatile and controllable for use in patients.

“We were able to observe for the first time a base editor in action,” said UC Berkeley postdoctoral fellow Gavin Knott. “Now we can understand not only when it works and when it doesn’t, but also design the next generation of base editors to make them even better and more clinically appropriate.”

A base editor is a type of Cas9 fusion protein that employs a partially deactivated Cas9 — its snipping shears are disabled so that it cuts only one strand of DNA — and an enzyme that, for example, activates or silences a gene, or modifies adjacent areas of DNA. Because the new study reports the first structure of a Cas9 fusion protein, it could help guide the invention of myriad other Cas9-based gene-editing tools.

“We actually see for the first time that base editors behave as two independent modules: You have the Cas9 module that gives you specificity, and then you have a catalytic module that provides you with the activity,” said Audrone Lapinaite, a former UC Berkeley postdoctoral fellow who is now an assistant professor at Arizona State University in Tempe. “The structures we got of this base editor bound to its target really give us a way to think about Cas9 fusion proteins, in general, giving us ideas which region of Cas9 is more beneficial for fusing other proteins.“

Lapinaite and Knott, who recently accepted a position as a research fellow at Monash University in Australia, are co-first authors of the paper.

“This structure helps us understand base editors at a much deeper level,” said senior author Jennifer Doudna, UC Berkeley professor of molecular and cell biology and of chemistry and Howard Hughes Medical Institute investigator. “Now that we can see what we’re working with, we can develop informed strategies to improve the system.”

Editing one base at a time

In 2012, researchers first showed how to reengineer a bacterial enzyme, Cas9, and turn it into a gene-editing tool in all types of cells, from bacterial to human. The brainchild of Doudna and her French colleague, Emmanuelle Charpentier, CRISPR-Cas9 has transformed biological research and brought gene therapy into the clinic for the first time in decades.

The 3D structure of a base editor as it edits a stretch of DNA. (UC Berkeley graphic by Gavin Knott)

Scientists quickly co-opted Cas9 to produce a slew of other tools. Basically a mash-up of protein and RNA, Cas9 precisely targets a specific stretch of DNA and then precisely snips it, like a pair of scissors. The scissors function can be broken, however, allowing Cas9 to target and bind DNA without cutting. In this way, Cas9 can ferry different enzymes to targeted regions of DNA, allowing the enzymes to manipulate genes.

In 2016, David Liu of Harvard University and the Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology and Harvard combined a Cas9 with another bacterial protein to allow the surgically precise replacement of one nucleotide with another: the first base editor.

While the early adenine base editor was slow, the newest version, called ABE8e, is blindingly fast: It completes nearly 100% of intended base edits in 15 minutes. Yet, ABE8e may be more prone to edit unintended pieces of DNA in a test tube, potentially creating what are known as off-target effects.

The newly revealed structure was obtained with a high-powered imaging technique called cryo-electron microscopy (cryoEM). Activity assays showed why ABE8e is prone to create more off-target edits: The deaminase protein fused to Cas9 is always active. As Cas9 hops around the nucleus, it binds and releases hundreds or thousands of DNA segments before it finds its intended target. The attached deaminase, like a loose cannon, doesn’t wait for a perfect match and often edits a base before Cas9 comes to rest on its final target.

Knowing how the effector domain and Cas9 are linked can lead to a redesign that makes the enzyme active only when Cas9 has found its target.

“If you really want to design truly specific fusion protein, you have to find a way to make the catalytic domain more a part of Cas9, so that it would sense when Cas9 is on the correct target and only then get activated, instead of being active all the time,” Lapinaite said.

The structure of ABE8e also pinpoints two specific changes in the deaminase protein that make it work faster than the early version of the base editor, ABE7.10. Those two point mutations allow the protein to grip the DNA tighter and more efficiently replace A with G.

“As a structural biologist, I really want to look at a molecule and think about ways to rationally improve it. This structure and accompanying biochemistry really give us that power,” Knott added. “We can now make rational predications for how this system will behave in a cell, because we can see it and predict how it’s going to break or predict ways to make it better.”

“While base editors are now widely used to introduce precise changes in organisms ranging from bacteria to plants to primates, no one has previously observed the three-dimensional molecular structure of a base editor,” said Liu, who obtained his Ph.D. in 1999 from UC Berkeley and is a Howard Hughes Medical Institute investigator. “This collaborative project reveals the beautiful molecular structure of a state-of-the-art, highly active base editor — ABE8e — caught in the act of engaging a target DNA site.”

In addition to Lapinaite, Knott, Doudna and Liu, other paper co-authors are Cody Palumbo and Peter Beal of UC Davis, Enrique Lin-Shiao of UC Berkeley and Michelle Richter and Kevin Zhao of the Broad Institute, a collaboration between Harvard and the Massachusetts Institute of Technology.


Obejrzyj wideo: CRISPR-Cas 9 The powerful tool for editing genomes Part-I. (Sierpień 2022).