Informacja

W jaki sposób wirusy DNA utrzymują się w jądrze bez wstawiania się do genomu?

W jaki sposób wirusy DNA utrzymują się w jądrze bez wstawiania się do genomu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jeśli się nie mylę tylko wirusy RNA wstawiają się do genomu gospodarza. Jako przykład wirusów DNA, wirusy opryszczki na przykład nie wstawiają się do genomu gospodarza.

Jak zatem wirusy DNA utrzymują się w jądrze? Czy po prostu unoszą się w powietrzu bez kapsydu? A jeśli komórka się powiela, czy DNA wirusa DNA również zostanie zduplikowane, nawet jeśli nie jest wstawione do genomu gospodarza?


Herpeswirusy utrzymują się w stanie utajonym jako „episomy”, okrągłe elementy DNA, bez kapsydu, które znajdują się w jądrze, ale nie są zintegrowane z genomem gospodarza. Enzymy gospodarza replikują te episomy, a różne wirusy wykształciły różne strategie, aby zapewnić przekazywanie episomów do nowo podzielonych komórek.

Po pierwszym zakażeniu komórek wiele herpeswirusów rozpoczyna utajony cykl życiowy, a genom wirusa istnieje jako koliste elementy genetyczne zwane episomami wewnątrz jądra komórki gospodarza, które są ściśle związane z DNA gospodarza, ale nie są z nim zintegrowane. Podczas infekcji latentnej episomy są replikowane w fazie S, ale nie powstają nowe cząsteczki wirusa, a zainfekowana komórka przeżywa. Utrzymanie genomów herpeswirusa jako episomów znacznie kontrastuje z retrowirusami, które wstawiają swój genom do genomu komórki gospodarza, aby zapewnić ich replikację i dziedziczenie przez komórki potomne oraz ustanowić długotrwałą infekcję… EBV wykorzystuje mechanizm do łączenia genomu EBV z DNA gospodarza, ułatwienie równej dystrybucji episomów w komórkach potomnych z większą liczbą komórek posiadających co najmniej jeden genom EBV. W przeciwieństwie do tego, KSHV wykorzystuje strategię grupowania, która promuje większą liczbę episomów na komórkę, ale kosztem nie przekazywania episomu do niektórych komórek potomnych

--Jak wirusy opryszczki przekazują swoje genomy

Innym mechanizmem, z którego korzysta wiele herpeswirusów, jest ustalenie ich utajonej infekcji w niedzielących się komórkach, zwłaszcza neuronach, dzięki czemu nie ma obaw o komórki potomne.


DNA większości bakterii jest zawarte w pojedynczej okrągłej cząsteczce zwanej chromosomem bakteryjnym. Chromosom wraz z kilkoma białkami i cząsteczkami RNA tworzy nieregularną strukturę zwaną nukleoidem. Znajduje się w cytoplazmie komórki bakteryjnej.

Oprócz chromosomu bakterie często zawierają plazmidy – małe okrągłe cząsteczki DNA. Bakterie mogą pobierać nowe plazmidy z innych komórek bakteryjnych (podczas koniugacji) lub ze środowiska. Mogą również łatwo je stracić – na przykład, gdy bakteria podzieli się na dwie, jedna z komórek potomnych może nie otrzymać plazmidu.

Każdy plazmid ma swój własny „początek replikacji” – odcinek DNA, który zapewnia jego replikację (kopiowanie) przez bakterię gospodarza. Z tego powodu plazmidy mogą się kopiować niezależnie od chromosomu bakteryjnego, więc w jednej komórce bakteryjnej może znajdować się wiele kopii plazmidu – nawet setki.


Wstęp

Genom ludzki składa się z 3 miliardów nukleotydów, sekwencji, która stanowi plan ludzkiego życia. Informacja genetyczna jest zorganizowana w sieci regulacyjne, składające się z trans-działające białka kodujące lub niekodujące geny oraz cis-działające elementy regulacyjne, które kontrolują wzorce ekspresji. Wzajemne oddziaływanie tych elementów ułatwia ustanowienie różnorodności komórkowej podczas embriogenezy, a następnie rozwój tkanek i narządów. Jednak tylko podzbiór ludzkiego genomu aktywnie uczestniczy w tych sieciach regulacyjnych. Wysokowydajna technologia genomiczna została wykorzystana do mapowania aktywnych elementów w sekwencji ludzkiego genomu dzięki inicjatywom takim jak ENCODE 1 i Roadmap Epigenomics Project 2 . Wysiłki te wykorzystały ChIP-Seq do wygenerowania profili miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie i krajobrazu modyfikacji histonów 1 2 DNase-Seq do identyfikacji regionów dostępnej chromatyny 3 i RNA-Seq do pomiaru transkrypcji 4 , dostarczając dogłębnych informacji na temat sieci zakodowane w przestrzeni sekwencji ludzkiego genomu.

Około 50% ludzkiego genomu składa się z powtarzających się elementów — sekwencji DNA, które występują wielokrotnie w niemal identycznych kopiach 5 . Największa część powtarzalnego DNA pochodzi z retrotranspozonów, rodziny elementów transpozycyjnych (TE), które są zdolne do „kopiowania i wklejania” własnego DNA w genomie gospodarza. Istnieją trzy główne klasy retrotranspozonów: długie rozproszone elementy jądrowe (LINE), krótkie rozproszone elementy jądrowe (SINE) i endogenne elementy retrowirusowe (ERV) 6 7 8 9 10 . Obecnie prawie wszystkie retrotranspozony utraciły zdolność transpozycji. Jednak pozostałe fragmenty zawierają główne składniki sieci regulacyjnych: cissekwencje regulatorowe, miejsca startu transkrypcji, a nawet geny, które mogą podlegać transkrypcji. Rzeczywiście, retrotranspozony są często wykrywane we wszystkich testach genomowych, co sugeruje, że mogą przyczyniać się zarówno do regulacji, jak i transkrypcji w ludzkim genomie.

W porównaniu z genami kodującymi białka, sekwencje retrotranspozonów są znacznie mniej konserwatywne i mogą się znacznie różnić między gatunkami 11 12 13 14 15 16 . Choć może to sugerować, że nie są one niezbędne do życia człowieka, wykazują jednak pewną aktywność biochemiczną 3 . Obecność aktywności biochemicznej w warunkach niskiej ochrony ewolucyjnej podkreśla jedno z kluczowych wyzwań w badaniach retrotranspozonów: jak zidentyfikować elementy, które są istotne biologicznie („funkcjonalne” dla uproszczenia) wśród wszystkich aktywnych retrotranspozonów (ramka 1).

W tym przeglądzie omawiamy najnowsze dowody pokazujące, że retrotranspozony wnoszą wkład na dużą skalę w elementy regulatorowe genów, geny niekodujące i geny kodujące białka. W szczególności zwracamy uwagę na badania, które demonstrują fenotyp przypisywany aktywacji retrotranspozonów lub opisują mechanizm, dzięki któremu to zachodzi, a także podsumowujemy ostatnie dowody wskazujące na aktywację retrotranspozonów w raku. Ten przegląd skupia się głównie na klasie retrotranspozonów ERV, jednak podkreśla również wspólne tematy wśród ERV, LINE i SINE, które wyłoniły się z badań całego genomu nad ich regulacją i wkładem w transkryptom.


Wstęp

Medicago, gatunek pochodzenia śródziemnomorskiego, jest intensywnie wykorzystywany jako roślina strączkowa na pastwiskach na całym świecie. Obecnie lucerna (Medicago sativa) jest najczęściej uprawianą rośliną pastewną w USA i stanowi najbardziej wartościową ekonomicznie paszę na paszę dla zwierząt. W ciągu ostatnich 20 lat rosnąca liczba projektów badawczych dotyczących roślin strączkowych pozwoliła na pojawienie się roślin modelowych dla gatunków roślin strączkowych. Rośliny strączkowe i pastwiskowe są generalnie słabymi systemami modelowymi do badań genetycznych i genomicznych. Niektóre uprawiane rośliny strączkowe są tetraploidalne (np. orzeszki ziemne), wiele z nich ma duże genomy (np. groch i bobik), a wiele jest opornych na transformację lub trudnych do regeneracji (np. fasola zwyczajna, groch i soja). Większość roślin strączkowych zbożowych ma duże, ale stosunkowo mało nasion na roślinę, oraz duże sadzonki, co zapobiega uprawie o wysokiej gęstości (np. ciecierzyca, groszek czarnooki, fasola mung, groch, fasola i soja). Niektóre rośliny strączkowe, takie jak soja, mają duplikacje genomu, a niektóre są samoniekompatybilne lub mają długi czas generacji. W rezultacie dwa gatunki, Medicago truncatula oraz Lotos japonicus zostały zaproponowane jako modele do badań roślin strączkowych (Barker i in., 1990 Handberg i Stougaard, 1992). M. truncatula został po raz pierwszy zaproponowany jako model przez Barkera i in. (1990) w celu zbadania symbiozy rhizobia-rośliny strączkowe. Obecnie jest uznawany na całym świecie jako modelowa roślina strączkowa dla wszystkich badań nad roślinami strączkowymi. M. truncatula ma kilka zalet w badaniach nad genomami roślin: genom diploidalny (2n = 16), autogamiczny, stosunkowo mały genom (񾍵 Mbp), który został zsekwencjonowany i opatrzony adnotacjami (Young et al., 2011) oraz stosunkowo krótki czas generacji (około 4 miesiące od nasion do nasion).

Dedykowane spotkania i warsztaty na temat Medicago umożliwiły szybki i skoordynowany rozwój narzędzi genetycznych i genomicznych. Na przykład, badania transkryptomiczne zostały ułatwione dzięki opracowaniu mikromacierzy mikromacierzy, takich jak mikromacierz 16k 70-merowych oligonukleotydów stosowanych w badaniach takich jak Hohnjec et al. (2005) lub Gallardo i in. (2007) i Affymetrix GeneChip stosowane w badaniach takich jak Benedito et al. (2008), Verdier i in. (2013b) oraz Zhang i in. (2014). Większość danych uzyskanych z eksperymentów Affymetrix GeneChip była przechowywana i publicznie udostępniana na dedykowanym serwerze internetowym, aby zapewnić M. truncatula Atlas ekspresji genów (MtGEA, www.mtgea.noble.org He i wsp., 2009). Narzędzia transkryptomiczne obejmują również wysokowydajną platformę ilościowego PCR do profilowania wszystkich znanych czynników transkrypcyjnych stosowanych w badaniach, takich jak Verdier et al. (2008). W ostatnim czasie rozwój technologii RNA-seq umożliwił kompleksową identyfikację i kwantyfikację transkryptów w M. truncatula takie osoby reagujące na różne stresy (np. Gruber i in., 2009 Li i in., 2009 Zhang i in., 2014). Równolegle do narzędzi transkryptomicznych, M. truncatula posiada również biblioteki do badań metabolomicznych (Broeckling et al., 2004) oraz mapy referencyjne do badań proteomicznych (Mathesius et al., 2001 Gallardo et al., 2003 Watson et al., 2003). Ostatnio 330 M. truncatula akcesje z kolekcji plazmy zarodkowej zsekwencjonowano i zastosowano w badaniach asocjacyjnych całego genomu, takich jak Stanton-Geddes i in. (2013) oraz Kang i in. (2015).

Liczne zasoby bioinformatyczne są również dostępne dla Medicago, niektóre zostały opracowane specjalnie dla Medicago (i roślin strączkowych), takie jak Medicago Gbrowser (http://gb.sc.noble.org/cgi-bin/gb2/gbrowse), LegumeGRN (Wang M. et al., 2013), legumeIP (Li et al., 2012) i Legoo (http://www.legoo.org) i inne zostały zaadaptowane z Arabidopsis do Medicago, takie jak PathExpress (Goffard i Weiller, 2007). ) i AgriGO (Du i in., 2010). Kolejny kluczowy krok w przyjęciu M. truncatula jako roślinę modelową do badań roślin strączkowych była możliwość Agrobacterium-transformacja za pośrednictwem całej rośliny poprzez somatyczną embriogenezę przy użyciu Agrobacterium tumefaciens (Thomas et al., 1992), transformacja siewek za pomocą Agrobacterium tumefaciens (Trieu et al., 2000) lub bardziej konkretnie transformacja korzeni w celu wygenerowania przejściowych transformantów włochatych korzeni przy użyciu Agrobacterium rhizogenes (Boisson-Dernier i wsp., 2001). Pojawienie się genetyki funkcjonalnej w M. truncatula było możliwe ze względu na jego zdolność do transformacji, a ostatnio ze względu na generowanie różnych populacji mutantów.


2 Molekularne składniki chromatyny w roślinach

Zidentyfikowano ponad 130 genów kodujących białka zaangażowane w regulację epigenetyczną w roślinach (Tabela 1). Znane do tej pory modyfikatory epigenetyczne można z grubsza podzielić na pięć grup zgodnie z ich udowodnionymi lub domniemanymi funkcjami, jak omówiono w sekcjach 2.1–2.4 i 3. Lista ta jest wyraźnie niekompletna, ponieważ nowe działania są nadal identyfikowane w trwających badaniach, ale zapewnia ramy dla zrozumienia epigenetyki roślin.

2.1 Regulatory modyfikacji DNA

5-Metylocytozyna (5mC) jest cechą charakterystyczną epigenetycznego wyciszania genów i heterochromatyny zarówno u roślin, jak i ssaków (ta ostatnia jest omówiona w Li i Zhang 2014, patrz także Zhao i Garcia 2014 zrecenzowani w Furner i Matzke 2011 Meyer 2011). Podczas gdy w jądrach zróżnicowanych komórek ssaków 5mC znajduje się prawie wyłącznie w miejscach CG (często określanych jako miejsca CpG), rośliny metylują cytozyny w motywach CG, CHG lub CHH (w których H oznacza A, T lub C). Promotory ssaków są często obecne w wolnych od metylacji regionach bogatych w CG, znanych jako wyspy CpG, ale wyspy CpG nie są łatwo rozróżnialne u roślin. Niemniej jednak, metylacja cytozyny jest nielosowo rozmieszczona w roślinach, występując głównie w powtarzalnych regionach genomu, które są wzbogacone w elementy transpozycyjne, powtórzenia centromerowe lub macierze cichych powtórzeń genu 5S lub 45S rRNA. Metylacja cytozyny zachodzi również w niektórych różnie regulowanych promotorach oraz w regionach kodujących białka genów o wysokiej ekspresji (Zilberman et al. 2007). Ta ostatnia metylacja ciała genu jest zachowana ewolucyjnie i występuje u gatunków zwierząt tak różnych, jak ludzie i pszczoły miodne (Feng et al. 2010). Znaczenie metylacji CG ciała genu nie jest jeszcze jasne, ale jej wzbogacenie w eksonach sugeruje potencjalną rolę w splicingu pre-mRNA.

2.1.1 Metylotransferazy DNA

Metylotransferazy DNA katalizują metylację cytozyny de novo we wcześniej niemetylowanych cytozynach lub utrzymują istniejące wcześniej wzorce metylacji cytozyny (zilustrowane na ryc. 2 w Li i Zhang 2014). W roślinach metylacja de novo jest kierowana przez małe interferujące RNA (siRNA) i zachodzi na cytozynach obecnych w motywach CG, CHG lub CHH (patrz rozdz. 3.5). Metylacja podtrzymująca utrwala istniejące wcześniej wzorce metylacji, szczególnie w motywach CG lub CHG, które są znane jako miejsca symetryczne, ponieważ każda nić DNA odczytuje CG lub CHG w kierunku 5' do 3'. Ta symetria stanowi podstawę dla wzorców metylacji cytozyny na niciach macierzystych, które mają być nadawane niciom potomnym po każdej rundzie replikacji DNA. Metylacja podtrzymująca występuje również po naprawie DNA, umożliwiając metylację nowo zsyntetyzowanego DNA w oparciu o wzorzec metylacji nienaprawionej nici.

Trzy rodziny metylotransferazy DNA są zachowane wśród eukariontów i występują w roślinach: homologi ssaków Dnmt1, Dnmt2, oraz Dmnt3 (Rys. 4 w Li i Zhang 2014). METYLOTRANSFERAZA DNA 1 (SPOTKAŁ1), roślinny homolog ssaczego Dnmt1, jest główną metylotransferazą podtrzymującą CG i może również przyczyniać się do metylacji CG de novo. Homologi DNMT2 są również obecne w roślinach i posiadają aktywność metylazy transferowego RNA (tRNA), podobnie jak DNMT2 u ssaków (Goll et al. 2006), jednak dla tych enzymów nie zaobserwowano aktywności katalitycznej wobec DNA. Zakład METYLOTRANSFERAZÓW ZMIENIONYCH DOMEN (DRM) i ich ssacze homologi, grupa Dnmt3, są głównie metylotransferazami de novo. Białka DRM mają domeny połówek końca aminowego i karboksylowego ułożone w odwrotnej kolejności w porównaniu z Dnmt3 (po domenach VI–X następuje I–V). DRM2 katalizuje metylację cytozyn we wszystkich kontekstach sekwencji i jest dominującą metylotransferazą cytozyny w szlaku metylacji DNA kierowanego przez RNA (patrz rozdz. 3.5.2).

W przeciwieństwie do ssaków, rośliny mają unikalną rodzinę metylotransferaz cytozyny, w której cechą definiującą jest obecność chromodomeny, która wiąże się z metylowanymi histonami. CHROMOMETYLAZA 3 (CMT3) jest enzymem odpowiedzialnym przede wszystkim za metylację podtrzymującą CHG. Chromodomena CMT3 wiąże histon H3, który jest dimetylowany na lizynie 9 (H3K9me2). Z kolei metylacja CHG zapewnia miejsce wiązania dla domeny SET- AND RING-ASSOCIATED (SRA) metylotransferazy H3K9 SUVH4, prowadząc do dimetylacji H3K9. Tak więc CMT3 i SUVH4 tworzą samowzmacniającą się pętlę, w której represyjne znaczniki metylacji DNA i modyfikacji histonów określają się nawzajem, aby utrzymać stan epigenetyczny (przegląd w Law i Jacobsen 2010). CHROMOMETYLAZA 2 (CMT2) odgrywa rolę w utrzymywaniu metylacji CHH w określonych kontekstach genomowych, takich jak centralne regiony dużych elementów transpozycyjnych, prawdopodobnie poprzez krzyżową rozmowę z modyfikacjami histonów, takimi jak jego paralog, CMT3 (Zemach i wsp. 2013).

W przeciwieństwie do ssaków, u których dnmt1 i dnmt3 mutanty giną podczas rozwoju embrionalnego lub krótko po urodzeniu, spotkał1, cmt2, cmt3 i drm mutanty są żywotne, nawet w połączeniu ze sobą. Dzięki temu można badać rolę metylacji DNA w różnych procesach u roślin, m.in. w rozwoju wegetatywnym i reprodukcyjnym, gametogenezie, zapłodnieniu, a także w zależności od metylacji DNA i modyfikacji histonów (jak w przypadku CMT3 opisanego w poprzedni akapit recenzowany w Furner i Matzke 2011 Meyer 2011).

2.1.2 Demetylacja cytozyny i glikozylazy DNA

Pomimo mechanizmów pozwalających na utrzymanie metylacji DNA, metylacja cytozyny może zostać utracona. Utrata pasywna występuje, gdy metylacja nie jest podtrzymywana podczas replikacji lub po naprawie DNA. Aktywna demetylacja może również zachodzić poprzez aktywność enzymatyczną. Aktywna demetylacja u zwierząt została wykazana kilkadziesiąt lat temu, ale dokładni gracze i mechanizmy są nadal przedmiotem dyskusji (przegląd w Gehring i wsp. 2009 Niehrs 2009). w Arabidopsis, aktywna demetylacja jest katalizowana przez białka REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1), DEMETER (DME) lub DEMETER-LIKE (DML2,-3). Są to duże białka zawierające domeny glikozylazy DNA. ROS1 wykazuje aktywność nacinania na zmetylowanym DNA, co skutkuje usunięciem i zastąpieniem zmetylowanych cytozyn poprzez szlak związany z naprawą przez wycinanie zasad (Agius et al. 2006). Proces demetylacji wymaga 3'PHOSPHOESTERASE DNA ZINC FINGER (ZDP), która, jak się uważa, usuwa 3' fosforan w miejscu nacięcia, tworząc w ten sposób 3' hydroksyl, który umożliwia ligazie DNA uszczelnienie luki (Martínez-Macías i in. 2012). ROS1 ulega konstytutywnej ekspresji, potencjalnie przyczyniając się do utraty metylacji DNA w niedzielących się komórkach na wszystkich etapach rozwoju. Uważa się, że ROS1 jest kierowany do swoich miejsc działania przez powiązanie z ROS3, białkiem wiążącym RNA, co sugeruje, że RNA może odgrywać rolę w kierowaniu demetylacją, a także w kierowaniu metylacją de novo w szlaku metylacji DNA kierowanego przez RNA ( Zheng i wsp. 2008). Glikozylaza DNA DME jest szczególnie ważna w gametofitach, gdzie pomaga wymazać wzory 5mC, które w przeciwnym razie wyciszają określony podzbiór genów (Choi i wsp. 2002 Schoft i wsp. 2011). Mutacje eliminujące supresję MET1 metylotransferazy CG dme mutanty, co sugeruje, że DME jest wymagane przede wszystkim do demetylacji dinukleotydów CG (Xiao i wsp. 2003). Paralogi DME, DML2 i -3, wpływają na metylację cytozyny w kontekstach CG, CHG i CHH w określonych miejscach genomowych (Ortega-Galisteo i wsp. 2008).

Łącznie funkcje wielu enzymów demetylujących w Arabidopsis wskazują, że odwracalność metylacji DNA ma kluczowe znaczenie dla regulacji określonych genów podczas rozwoju. Istnieje również coraz więcej dowodów na to, że metylacja cytozyny może zostać szybko utracona innymi sposobami (przegląd w Reinders i Paszkowski 2009). Spontaniczne zmiany w metylacji cytozyny mogą występować sporadycznie w populacjach izogenicznych (Becker et al. 2011 Schmitz et al. 2011), tym samym tworząc lub derepresjonując epiallele, które mogą wpływać na dopasowanie i dobór naturalny (Roux et al. 2011).

2.1.3 Białka wiążące metylocytozynę

Białka DOMENY WIĄŻĄCEJ METYLO-C (MBD), które mają podobieństwo sekwencji z białkami ssaków, takimi jak MeCP2, są epigenetycznymi modułami „czytnikowymi”, które mają pomóc w transdukcji wzorców metylacji DNA w zmienioną aktywność transkrypcyjną (patrz Ryc. 8 i 9 w Li i Zhang 2014). Rośliny mają więcej genów zawierających MBD (13 cali Arabidopsis) niż ssaki. Jednak poza konserwatywną domeną MBD istnieje niewielka homologia z MBD ssaków (Springer i Kaeppler 2005). Tylko trzech członków Arabidopsis Wiadomo, że rodzina ta wiąże się specyficznie z metylowanym DNA, a brakuje ich w roślinach jednoliściennych, takich jak kukurydza, pszenica i ryż (przegląd w Grafi i wsp. 2007). Inne domeny białkowe również nadają wiązanie 5mC. Na przykład domena SRA SUVH4 (metylotransferaza H3K9) wiąże się z metylowanymi miejscami CHG, zapewniając mechanistyczne połączenie między represywnym histonem a modyfikacjami DNA, jak wspomniano w Rozdziale 2.1.1. Podobnie domeny SRA białek VIM (ortologi UHRF1 u ssaków) wiążą się z hemimetylowanym DNA i rekrutują MET1/DNMT1, aby zmodyfikować nową nić potomną po replikacji (Woo i wsp. 2007, 2008).

2.1.4 Białka wymagane do syntezy dawców grup metylowych

Większość enzymów metylujących wymaga kofaktora S-adenozylo-metionina (SAM lub AdoMet) jako donor grupy metylowej. Kluczowy enzym w biosyntezie SAM, S-ADENOSYL-L-HOMOCYSTEINE HYDROLASE, reguluje poziom SAM poprzez usuwanie inhibicji substratu. Mutacje w Arabidopsis gen kodujący ten enzym powoduje zmniejszoną metylację DNA i uwalnianie wyciszania transkrypcji, zwłaszcza z genów w pericentromerowej heterochromatynie (Rocha i wsp. 2005 Jordan i wsp. 2007). Mutacje wpływają również na metylację histonów, dodatkowo wpływając na regulację epigenetyczną (Baubec i wsp. 2010).

2.2 Enzymy modyfikujące histony i warianty histonów

Podobnie jak inne organizmy, rośliny zawierają kilka wariantów histonów i enzymów, które potranslacyjnie modyfikują histony i wpływają na regulację genów. Zastosowanie immunoprecypitacji chromatyny, a następnie głębokiego sekwencjonowania dało wgląd w rozkład wariantów histonów w całym genomie i histonów noszących różne modyfikacje potranslacyjne (przegląd w Roudier i wsp. 2009), w tym koincydencję lub wzajemne wykluczanie określonych znaczników chromatyny (Roudier i wsp. 2011). Enzymy modyfikujące histony są często kodowane przez duże rodziny genów w roślinach (przegląd w Berr i wsp. 2011 Deal i Henikoff 2011 Lauria i Rossi 2011).

2.2.1 Deacetylazy histonowe i acetylotransferazy histonowe

Acetylacja histonów jest markerem epigenetycznym, ogólnie związanym z aktywną chromatyną i transkrypcją, podczas gdy sekwencje nieaktywne w transkrypcji zwykle nie mają acetylacji. Funkcje „zapisu” acetylotransferazy histonowej (w skrócie HAT) mogą być odwrócone przez enzymy „wymazujące” deacetylazy histonowej (HDAC), które pozwalają na odwracalność acetylacji jako markera epigenetycznego. Strukturę i funkcję tych genów szeroko omawiają Marmorstein i Zhou (2014) oraz Seto i Yoshida (2014). Rośliny mają wiele członków rodziny genów zarówno dla HAT, jak i HDAC (Pandey i wsp. 2002 Chen i Tian 2007). Członkowie rodziny HAT mogą być zaklasyfikowani do pięciu różnych podrodzin w oparciu o ich strukturę i różne specyfiki substratowe (Earley i wsp. 2007). Homolog GCN5, HAG1, na przykład specyficznie metyluje H3K14, tak jak u drożdży i ssaków, i reguluje kilka procesów rozwojowych w Arabidopsis (przegląd w Servet et al. 2010). Obecnie znamy homologi roślin do trzech z pięciu podrodzin HAT (patrz Tabela 1). Rośliny mają również homologi deacetylaz histonowych, które są wysoce konserwatywne we wszystkich eukariontach, katalizując usuwanie acetylacji histonów w celu wytworzenia bardziej represyjnej chromatyny. Istnieje specyficzna dla roślin rodzina domniemanych deacetylaz histonowych, zwana rodziną HD2 lub HDT, która jest zaangażowana w wyciszanie genów, ale ostateczna aktywność HDAC nie została jeszcze wykazana dla rekombinowanych białek HDT. Badania genetyczne do tej pory zidentyfikowały tylko dwa HDAC, które działają jako regulatory epigenetyczne: HDA1 i HDA6 (tabela 1). HDA6 odgrywa rolę w utrzymywaniu metylacji CG i CHG, oddziałując z metylotransferazą DNA MET1 i bierze udział w wyciszaniu transgenów i transpozonów, represji genu rRNA i dominacji jąder. Chociaż mutanty niedoboru mają jedynie subtelne defekty morfologiczne, HDA6 bierze udział w dojrzewaniu nasion, kontroli czasu kwitnienia i odpowiedziach na stres (przegląd w Aufsatz i wsp. 2007 Kim i wsp. 2012). Plejotropowe zmiany morfologiczne są widoczne przy zmniejszonej ekspresji i/lub nadekspresji HDA1 i HD2A/HDT1, ale ich funkcje nie są jasne. Analiza funkcji HAT i HDAC jest nieco skomplikowana ze względu na ich nadmiarowość i potencjalne działanie w kontekście dużych kompleksów wielobiałkowych.

2.2.2 Metylotransferazy histonowe i demetylazy histonowe

Podobnie jak acetylacja, metylacja histonów jest potencjalnie odwracalnym oznaką. Histonowe metylotransferazy lizynowe (HKMTs) instalujące tę modyfikację zazwyczaj charakteryzują się obecnością domeny SET (SU(VAR)/E(Z)/TRX szeroko omówione w Cheng 2014). W zależności od konkretnej lizyny histonowej, która jest metylowana, HKMT mogą promować lub hamować transkrypcję. Niektóre białka domeny SET są członkami grupy Polycomb (PcG) lub grupy trithorax (TrxG), które utrzymują odpowiednio stłumione transkrypcję lub stany aktywne określonych genów podczas rozwoju roślin i zwierząt (patrz rozdz. 2.3 i Grossniklaus i Paro 2014). Inne białka domeny SET z rodziny Su(var)3-9 uczestniczą w utrzymywaniu skondensowanej heterochromatyny, wyciszaniu transpozonów lub kontrolowaniu replikacji DNA.

ten Arabidopsis genom koduje 49 białek domeny SET, pogrupowanych w cztery konserwatywne rodziny: białka związane z E(Z), ASH1, TRX i SU(VAR)3-9 (Pontvianne et al. 2010). Ta ostatnia i największa grupa jest głównie, ale nie wyłącznie, odpowiedzialna za metylację H3K9. KRYPTONIT/TŁUMIK ODMIANY 3-9 homolog 4 (KYP/SUVH4) oraz SUVH2, -5 i -6 katalizują instalację H3K9me1 i -me2. Jak opisano dla SUVH4, ich domena SRA, która wiąże 5mC, przyczynia się do ich współpracy z CMT3 w utrzymaniu metylacji CHG i H3K9me2 w wyciszonych loci. H3K9me3 jest prawdopodobnie tworzony przez bardziej odległe spokrewnione białka SUVR, iw przeciwieństwie do zwierząt, u których jest on widocznym heterochromatycznym znacznikiem, w roślinach znajduje się w eksprymowanych genach euchromatycznych. Członek rodziny TRX, ARABIDOPSIS TRITHORAX 1 (ATX1), aktywuje geny homeotyczne kwiatów, prawdopodobnie poprzez jego zdolność do katalizowania metylacji histonu H3 lizyny 4 (H3K4). Monometylan ATXR5 i ATXR6 H3K27, znak stłumionej heterochromatyny. Nadreplikacja heterochromatyny występuje w atxr5 atxr6 podwójne mutanty, wskazując na rolę w kontroli replikacji (Jacob et al. 2010). Mutanty pozbawione ATXR3 zmniejszyły H3K4me2/3 i poważne wady rozwojowe, częściowo z powodu zmniejszonej wielkości komórek. ASH 1 HOMOLOG 2 (ASHH2), członek grupy ASH1, katalizuje H3K36me2/3, wzmacniając w ten sposób aktywne znaczniki chromatyny w docelowych loci, w tym kilku genach odporności na patogeny. Geny z grupy E(z) są istotne dla regulacji Polycomb (jak omówiono w rozdziale 2.3).

Istnieją dwie klasy białek, które mogą demetylować ogony histonów w różnych pozycjach. Specyficzne dla lizyny białka histonowej demetylazy-PODOBNEJ (LDL) działają poprzez utlenianie amin, a białka JUMONJI-C-DOMAIN (JmjC) działają poprzez hydroksylację (obszernie omówione w Cheng 2014, patrz także Shi i Tsukada 2013). Arabidopsis ma cztery geny LDL i 21 JmjC w kilku podgrupach (przegląd w Chen i Tian 2007 Liu i wsp. 2010). Białka LDL i niektóre białka JmjC są zaangażowane w kontrolę czasu kwitnienia, mają specyficzne geny docelowe i mogą działać we współpracy z czynnikami transkrypcyjnymi. Białko JmjC, ZWIĘKSZENIE METYLACJI BONSAI (IBM1), przeciwdziała metylacji H3K9 i metylacji DNA CHG. Wady rozwojowe spowodowane utratą IBM1 są w konsekwencji tłumione w podwójnych mutacjach z suvh4 oraz cmt3. Kilka enzymów potencjalnie zmieniających znaczniki metylacji histonów jest wciąż nieopisanych, a antagonizm lub kooperatywność, jak również specyficzność docelowa, mogą skutkować złożonym wzorcem pisania i odczytywania tych znaczników.

2.2.3 Enzymy dla innych modyfikacji histonów

Jednym z innych ważnych PTM histonów, oprócz acetylacji i metylacji, jest fosforylacja (przegląd w Houben i wsp. 2007). Fosforylacja histonów bierze udział w naprawie DNA (γH2AX) oraz regulacji segregacji chromosomów i podziału komórek (kinazy Aurora). Na fosforylację histonów mogą wpływać inne epigenetyczne znaczniki histonowe, tak jak w przypadku fosforylacji H3S10, na którą wpływa stan modyfikacji sąsiedniej lizyny, H3K9. ADP-rybozylacja histonów występuje w roślinach, ale nie była szeroko badana. Ubikwitynacja histonów H2A i/lub H2B pełni również ważne funkcje regulacyjne u zwierząt i roślin (przegląd w Berr i wsp. 2011 Bycroft 2011) i może rekrutować lub wykluczać inne enzymy modyfikujące. Białka, które instalują lub usuwają ubikwitynację, zostały scharakteryzowane i wpływają na cykl komórkowy, rozwój i odporność na patogeny.

2.2.4 Warianty histonów, histony łącznikowe i białka niehistonowe

Histony należą do najbardziej konserwatywnych białek wśród taksonów eukariotycznych i są kodowane przez wysoce redundantne rodziny genów. Podobnie jak zwierzęta, rośliny wykształciły strukturalnie i funkcjonalnie odrębne klasy wariantów histonów H2A i H3 (omówione w Henikoff i Smith 2014). Właściwości fizyczne wariantów odgrywają ważną rolę w ich dynamicznym związku z DNA (przegląd w Ingouff i Berger 2010 Deal i Henikoff 2011).

Fosforylacja wariantu H2AX oznacza miejsca uszkodzenia DNA i uważa się, że rekrutuje białka naprawcze DNA. H2A.Z to wariant znajdujący się głównie wokół miejsca startu transkrypcji genów, prawdopodobnie regulujący transkrypcję i wykluczający się wzajemnie z metylacją DNA (Zilberman i wsp. 2008). Jego włączenie wymaga aktywności kompleksu remodelującego chromatynę SWR1. Pod wpływem stresu cieplnego nukleosomy zawierające H2A.Z dysocjują od DNA, czemu towarzyszą zmiany w ekspresji genów (Kumar i Wigge 2010). Wariant CenH3 histonu H3 określa nukleosomy regionów centromerowych i jest wymagany do składania kinetochorów, przyłączania mikrotubul i segregacji chromosomów podczas podziału komórki. Wariant histonu H3.3, który różni się od kanonicznej podjednostki H3 tylko kilkoma aminokwasami, znajduje się głównie w regionach regulatorowych i genach ulegających ekspresji. Jest on włączany do chromatyny w sposób niezależny od replikacji, z udziałem specjalnych białek opiekuńczych i kompleksów remodelujących. Jednak mechanizmy odpowiedzialne za zastępowanie wariantów histonów poza replikacją nie są dobrze poznane u roślin.

Oprócz czterech histonów, które tworzą cząstki rdzenia nukleosomów, zagęszczenie DNA i jego dostępność do oddziałujących białek są również określane przez histony łącznikowe, w szczególności histon H1. Histony linkera wykazują znaczne zróżnicowanie, a ich funkcjonalną specjalizację sugeruje ekspresja wariantów indukowanych stresem. Regulacja w dół specyficznych histonów łącznikowych jest czasami kompensowana przez regulację w górę innych wariantów, ale może również skutkować hipometylacją DNA i plejotropowymi defektami fenotypowymi (przegląd w Jerzmanowski 2007).

Podobnie jak u innych eukariontów, rośliny mają niehistonowe białka chromosomowe, które mogą przyczyniać się do regulacji epigenetycznej, w tym białka HMG. Najlepiej scharakteryzowaną i najbardziej zróżnicowaną podgrupą tych białek w roślinach jest rodzina HMGB, której członkowie różnią się poziomem ekspresji, wzorcem, lokalizacją i interakcją z DNA i innymi białkami. Mutacja i ekspresja ektopowa poszczególnych członków rodziny wskazują na ich częściową subfunkcjonalizację oraz rolę w rozwoju i reakcji na stres (przegląd w: Pedersen i Grasser 2010). Jedno białko HMG, STRUCTURE-SPECIFIC RECOGNITION PROTEIN (SSRP1), jest pośrednio zaangażowane w demetylację DNA imprintowanych genów w centralnej komórce żeńskiego gametofitu (Ikeda i wsp. 2011).

Kompleksy kohezyny zapewniają wyrównanie chromatyd siostrzanych przed ich rozdziałem podczas anafazy mitotycznej i mejotycznej, a także biorą udział w naprawie DNA, przyłączaniu wrzeciona, kondensacji chromosomów i regulacji dostępności DNA. Struktura, montaż i usuwanie kohezyny wydają się być wysoce konserwatywne, ale niektórzy członkowie rodziny w roślinach mogą pełnić wyspecjalizowane funkcje (przegląd w Yuan et al. 2011). Na przykład, DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING3/INVOLVED IN DE NOVO (DMS3/IDN1) jest białkiem związanym z regionem domeny zawiasowej kohezyn i kondensyn i jest niezbędny do transkrypcji zależnej od DNA polimerazy RNA V (RNA Pol V) w ustaleniu RdDM (patrz rozdz. 3.5.2).

Białka takie jak REPLICATION PROTEIN A2 (RPA2) lub REPLICATION FACTOR C1 zostały zidentyfikowane w badaniach przesiewowych mutantów pod kątem regulatorów epigenetycznych (Elmayan i wsp. 2005 Kapoor i wsp. 2005). Wzmocnione fenotypy mutantów chromatyny w połączeniu z mutantami utraty funkcji homologu topoizomerazy MGOUN (MGO) również wskazują na rolę tego białka, szczególnie w połączeniu z utrzymaniem komórek macierzystych i merystemu (Graf et al. 2010). Można oczekiwać, że wiele innych białek niehistonowych oddziałujących z DNA również okaże się bezpośrednimi lub pośrednimi regulatorami epigenetycznymi.

2.3 Białka Polycomb i elementy oddziałujące

Białka z grupy PcG zostały początkowo zidentyfikowane jako główne regulatory i supresory genów homeotycznych w Drosophila. W równowadze z aktywującymi białkami TrxG, PcG określają proliferację i tożsamość komórki (patrz białka PcG w Grossniklaus i Paro 2014 oraz białka TrxG w Kingston i Tamkun 2014).

POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 2 (PRC2) w roślinach jest bardziej konserwatywny z dwóch różnych typów kompleksów PcG i jest odpowiedzialny za trimetylację histonu H3 w lizynie 27 (H3K27me3), podobnie jak u zwierząt. Każda podjednostka w Drosophila Kompleks PRC2 ma kilka paralogicznych odpowiedników w: Arabidopsis (patrz ryc. 3 w Grossniklaus i Paro 2014). MEDEA (MEA), KRĘCONE LIŚCIE (CLF) i SWINGER (SWN) odpowiadające Drosophila Białko E(Z) NASIONA NIEZALEŻNE OD ZAPŁONIENIA 2 (FIS2), WERNALIZACJA 2 (VRN2) i KWIAT ZARODKOWY 2 (EMF2) odpowiadające Su(z)12 ENDOSPERMA NIEZALEŻNA OD ZAPŁONIENIA (FIE) odpowiadająca Esc i SUSPRESOR WIELOKOPIJNY HOMOLOGU IRA 1–5 odpowiadające p55 (przegląd w Koehler i Hennig 2010). Uważa się, że ta dywersyfikacja białek składowych PRC2 jest związana z ewolucyjną ekspansją roślin lądowych (przegląd w Butenko i Ohad 2011). Roślinne składniki PRC2 są wymagane na różnych etapach rozwoju i funkcjonują w określonych, ale czasami nakładających się podzestawach genów. W przypadku wielu funkcji roślinna PRC2 oddziałuje z dodatkowymi białkami lub specyficznymi transkryptami RNA, jak w przypadku kontroli czasu kwitnienia (omówione w Baulcombe i Dean 2014). Same białka PcG podlegają ścisłej kontroli regulacyjnej, częściowo poprzez demetylację DNA. Co najmniej dwa geny PcG (MEA oraz FIS2) są genami imprintowanymi, co oznacza, że ​​ulegają zróżnicowanej ekspresji w zależności od rodzica, od którego zostały odziedziczone (przegląd w Raissig et al. 2011). Chociaż imprinting ewoluował niezależnie u roślin i ssaków (Tabela 1), metylacja DNA i białka PcG są kluczowymi składnikami w obu przypadkach.

PRC1, drugi kompleks białkowy PcG, jest bardziej odmienny w Arabidopsis w porównaniu ze zwierzętami, ale ma pokrewne funkcje. Podobnie jak Drosophila POLYCOMB białkowy, Arabidopsis- JAK HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) wiąże się z H3K27me3 i może „odczytać” i „przełożyć” tę modyfikację na dodatkowe i bardziej represyjne konfiguracje chromatyny, takie jak interakcja z enzymami ubikwitynującymi H2A, AtRING 1, -2 i AtBMI1, również homologi komponentów PRC1.

Podjednostki obu kompleksów rdzeniowych PRC oddziałują z innymi białkami, które mogą modulować specyficzność, ale sposób rekrutacji kompleksów PcG do określonych genów docelowych w roślinach wciąż nie jest jasny. Co ważne, sekwencje konsensusowe dla elementów reagujących na Polycomb lub Trithorax określone u zwierząt nie zostały zidentyfikowane w roślinach.

2.4 Białka organizujące nukleosomy

Replikacja, transkrypcja, rekombinacja i naprawa wymagają przejściowych lub trwałych zmian w pozycjonowaniu nukleosomów i ich asocjacji z DNA. Dlatego procesy dynamiczne na poziomie chromatyny nie ograniczają się do odwracalnych modyfikacji DNA lub białek, ale mogą obejmować zmiany w zajętości nukleosomów, składzie nukleosomów i dostępności DNA dla innych białek.

2.4.1 Kompleksy remodelujące chromatynę

Relokację lub dysocjację nukleosomów można osiągnąć przez ATPazy remodelujące chromatynę, takie jak kompleks SWI/SNF zidentyfikowany po raz pierwszy w drożdżach i nazwany zgodnie z procesami zachodzącymi w mutantach (patrz Becker i Workman 2013). Rośliny mają kilka takich kompleksów (recenzja w Jerzmanowski 2007). Przesiewy genetyczne dostarczyły informacji funkcjonalnych tylko dla garstki domniemanych remodelerów chromatyny, z których pierwszym zidentyfikowanym jest ZMNIEJSZENIE METYLACJI DNA 1 (DDM1).

Utrata funkcji DDM1 powoduje redukcję metylacji DNA i H3K9me2 w całym genomie, aktywację transkrypcji elementów powtarzalnych oraz rozregulowanie wielu genów. W rezultacie, ddm1 mutanty wykazują poważne defekty rozwojowe i morfologiczne, które nasilają się z kolejnymi pokoleniami. Stopniowa obniżona sprawność ddm1 mutanty można przypisać akumulacji epimutacji i mutacji insercyjnych spowodowanych przez reaktywowane transpozony. Część informacji epigenetycznej, w postaci metylacji DNA, jest nieodwracalnie tracona w ddm1 mutanty, jednak krzyżówki wsteczne z roślinami typu dzikiego mogą przywrócić wzór modyfikacji w niektórych loci w wyniku metylacji de novo (Teixeira et al. 2009). Podobnie jak białko ATPazy SWI2/SNF2, DDM1 wykazuje aktywność repozycjonowania nukleosomów zależną od ATP in vitro (Brzeski i Jerzmanowski 2003). Utrata metylacji cytozyny, która występuje w ddm1 mutanty nie występują w mutantach pozbawionych zarówno DDM1, jak i łącznikowego histonu H1 (Zemach et al. 2013), co wskazuje, że DDM1 jest potrzebny do utrzymania maszynerii metylacji, aby móc uzyskać dostęp do nukleosomalnego DNA, które jest wysoce upakowane, obejmujące zarówno histony rdzeniowe, jak i łącznikowe. Ortolog DDM1 u ssaków, HELICASE SPECYFICZNA LYMFOIDALNA, jest podobnie ważny dla globalnej metylacji i rozwoju CpG.

Dwóch członków rodziny SWI2/SNF2 w Arabidopsis, WADLIWE W METYLACJI 1 DNA KIEROWANEJ RNA (DRD1) i CLASSY 1 (CLSY1) są unikalne dla królestwa roślin i odgrywają wyspecjalizowane role w metylacji DNA kierowanej przez RNA (patrz rozdz. 3.5.2).Cztery inne białka SWI2/SNF2, BRAHMA (BRM), SPLAYED (SPD) oraz MINUSCULE 1 i 2, są zaangażowane w kontrolę podobnych, ale nie identycznych podzbiorów genów zaangażowanych w odpowiedzi hormonalne i utrzymanie komórek macierzystych (Sang i wsp. 2012).

Oprócz ATPaz w roślinach reprezentowane są inne podstawowe podjednostki remodelerów SWI/SNF, w tym kilku członków rodziny SWI3 (AtSWI3 A-D), jeden homolog SNF5 (BSH) i dwa homologi SWP73 (przegląd w Jerzmanowski 2007). Ich rola w roślinach nie została dokładnie zbadana, ale wykazano, że SWI3 oddziałuje z białkami wiążącymi RNA zaangażowanymi w kierowaną przez RNA metylacją DNA i wpływa na rozmieszczenie nukleosomów w wyciszonych loci (Zhu i wsp. 2012).

Podjednostki innych kompleksów remodelujących obejmują CHROMATIN-REMODELING PROTEIN 11 (białko złożone CHR11 i ISWI), PICKLE (białko złożone PKL a CHD3) oraz białka złożone INOSITOL-REQUIRING 80 i ACTIN-RELATED PROTEINS 4 i 5 (INO80, ARP4, ARP5 INO80). ). Mutanty wadliwe pod względem tych czynności charakteryzują się nieprawidłowościami rozwojowymi i zaburzoną naprawą DNA.

MORPHEUS’ MOLECULE 1 (MOM1) ​​jest specyficznym dla roślin regulatorem epigenetycznym, który jest spokrewniony z SWI2/SNF2 poprzez homologiczną, ale niekompletną domenę ATPazy, a także jest spokrewniony z CHD3. Brak mama1, w odróżnieniu ddm1 lub pkl, nie powoduje wad morfologicznych. Jego dokładny sposób działania nie jest jeszcze znany mama1 mutanty charakteryzują się pośrednim stanem chromatyny w genach docelowych, które częściowo pokrywają się z tymi, do których skierowany jest szlak RdDM (przegląd w Habu 2010).

Kompleks C SWR1 odgrywa ważną rolę epigenetyczną w odkładaniu H2A.Z w miejscach startu transkrypcji (i antagonistycznym wykluczaniu metylacji DNA). Arabidopsis Kompleks SWR1 obejmuje podjednostkę ATPazy WCZESNEGO KWITNIENIA NIEZALEŻNEGO OD ŚWIATŁA (PIE), KOMPLEKS SWR1 6 (SWC6) i BIAŁKO ZWIĄZANE Z AKTYNĄ 6 (ARP6). Nie jest jasne, w jaki sposób ten kompleks jest kierowany na określone geny docelowe, ale jego funkcja jest niezbędna do podejmowania decyzji rozwojowych i reagowania na stres.

2.4.2 Czynniki składania chromatyny

Podczas gdy SWI/SNF i inne kompleksy remodelujące działają na nukleosomy, które są już związane z DNA, do złożenia histonów rdzeniowych w nowe nukleosomy po replikacji, przywrócenia chromatyny po naprawie lub syntezie DNA związanej z rekombinacją, lub do wymiany histonów w związek z procesami transkrypcyjnymi. Funkcje te pełnią chaperony histonowe, które są głównie białkami kwaśnymi, które oddziałują ze sobą i specyficznymi histonami kanonicznymi lub wariantami (więcej szczegółów w Almouzni i Cedar 2014).

Rośliny mają trzy chaperony do ładowania tetramerów H3/H4 i trzy do dodawania dimerów H2A/H2B (przegląd w Zhu et al. 2011b). Kompleks CHROMATIN ASSEMBLY FACTOR 1 (CAF-1) pomaga wprowadzić tetramery H3/H4 do widełek replikacyjnych. Mutacje w genach kodujących dwie większe podjednostki CAF-1 w Arabidopsis (fas1, fas2) powodują charakterystyczne anomalie morfologiczne (fasjacja, ryc. 2F), braki w naprawie DNA, zmniejszenie liczby kopii genu rRNA i derepresję elementów powtarzalnych. Wskazuje to, że prawidłowe odkładanie się nukleosomów jest niezbędne dla rozwoju, stabilności genomu i kontroli epigenetycznej. Jak można było oczekiwać, brak podjednostek CAF-1 nie zakłóca utrzymania metylacji DNA, ale może prowadzić do wymazania innych znaczników epigenetycznych opartych na histonach. Obniżone poziomy trzeciego składnika CAF-1, MSI1, nie powodują fascynacji, ale prowadzą do zniekształconego rozwoju nasion i kilku zmian morfologicznych, prawdopodobnie spowodowanych jego wieloma rolami, w tym rolą w kompleksie PRC2. Istnieją dwa inne chaperony H3/H4, które działają niezależnie od replikacji, ale także we współpracy z CAF-1: HISTONE REGULATOR A (HIRA), dla którego jest jeden Arabidopsis homolog i ANTISILENCING FUNCTION 1 (ASF1), który ma dwa Arabidopsis homologi.

Zakłada się, że histony H2A i H2B są instalowane przez białka NUCLEOSOME ASSEMBLY PROTEIN 1 (NAP1), NAP1-RELATED PROTEIN (NRP) oraz FACILITATES CHROMATIN TRANSCRIPTION (FACT). w Arabidopsis, istnieje szereg homologów tych białek: cztery NAP1, dwa NRP i dwa homologi FACT, z których każdy wykazuje podobieństwo do odpowiedników drożdżowych lub zwierzęcych (przegląd w Zhu i wsp. 2011b).

Niektóre podjednostki opiekuńcze mogą być regulowane przez modyfikację potranslacyjną, na co wskazuje fenotyp mutantów TOUSLED (TSL), które nie mają kinazy ASF1. Mutant Arabidopsis białko o nazwie BRUSHY (BRU) ma podobny fenotyp do roślinnego CAF-1 szybko mutanty – czyli wrażliwość na uszkodzenia DNA, interferencję z TGS i wady rozwojowe. Chociaż BRU nie ma homologii z żadnymi znanymi białkami opiekuńczymi histonów, dodatkowa dysregulacja genów kontrolowanych przez PcG w określonych klastrach genomowych prawdopodobnie wskazuje na znaczenie BRU dla utrzymywania różnych stanów epigenetycznych (Ohno i wsp. 2011).

Uderzające jest to, że większość mutacji w genach opiekuńczych histonów wpływa na organizację merystemów, utrzymanie komórek macierzystych lub procesy w strefie różnicowania przylegającej do niszy komórek macierzystych w merystemie. Może to odzwierciedlać wymóg prawidłowego odkładania histonów i nukleosomów w celu utrwalenia tożsamości komórek macierzystych w roślinach.


W jaki sposób wirusy DNA utrzymują się w jądrze bez wstawiania się do genomu? - Biologia

Zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)-za pośrednictwem CRISPR-skojarzonego białka 9 (Cas9), edycja genomu oferuje potężne podejście jako potencjalna terapia monogenowych ludzkich chorób genetycznych.

Dokładne delecje zasad bez matrycy można osiągnąć poprzez naprawę za pośrednictwem mikrohomologii łączenia końców (MMEJ) i zależą one od sekwencji lokalnego miejsca docelowego.

Wybór szlaku naprawy DNA w pęknięciach dwuniciowych (DSB) wywołanych przez CRISPR-Cas9 jest regulowany przez kilka kluczowych czynników, w tym cykl komórkowy, sekwencję miejsca docelowego i strukturę chromatyny oraz tożsamość matrycy DNA dawcy.

Szlaki naprawy DNA związane z naprawą ukierunkowaną na homologię (HDR) w odpowiedzi na DSB indukowane CRISPR-Cas9 w komórkach ssaków są skomplikowane i stosunkowo niewydajne. Różne ścieżki naprawy DNA mogą być używane do naprawy każdego końca w DSB, co daje możliwość naprawy asymetrycznej.

Wiele zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)-związanych z białkiem 9 (Cas9), opartych na CRISPR, wykorzystuje nukleazy Cas do indukowania pęknięć dwuniciowych DNA (DSB) w pożądanych miejscach w genomie. Dalsze przetwarzanie DSB przez maszynerię naprawy komórkowej DSB jest następnie konieczne do wprowadzenia pożądanych mutacji, insercji sekwencji lub delecji genów. Tak więc na dokładność i wydajność edycji genomu wpływają komórkowe szlaki naprawy DSB. DSB same w sobie są wysoce genotoksycznymi uszkodzeniami i jako takie komórki wyewoluowały wiele mechanizmów ich naprawy. Te szlaki naprawy obejmują rekombinację homologiczną (HR), klasyczne łączenie niehomologicznych końców (cNHEJ), łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i przyłączanie pojedynczych nici (SSA). W tym przeglądzie krótko podkreślamy CRISPR-Cas9, a następnie opisujemy mechanizmy naprawy DSB. Na koniec podsumowujemy ostatnie odkrycia czynników, które mogą wpływać na wybór ścieżki naprawy DNA w odpowiedzi na DSB indukowane Cas9.

Obecny adres: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin, China


Zaburzenia neurologiczne – zaburzenia mózgu, kręgosłupa i powiązanych nerwów – są głównym czynnikiem przyczyniającym się do globalnego obciążenia chorobami, co wiąże się z szokująco dużymi kosztami ekonomicznymi. Różne podejścia terapeutyczne – między innymi leki farmaceutyczne, terapia oparta na urządzeniach, fizjoterapia, interwencja chirurgiczna – zostały zbadane w celu złagodzenia wynikającego z tego zakresu ludzkiego cierpienia. W ostatnich latach terapia genowa przy użyciu wektorów wirusowych – kodujących gen terapeutyczny lub hamujący RNA do „wypatroszonego” kapsydu wirusa i dostarczającego go do układu nerwowego – okazała się klinicznie realną opcją terapii zaburzeń mózgu. W tym przeglądzie przedstawiamy przegląd obecnego stanu i postępów w dziedzinie terapii genowej za pośrednictwem wektorów wirusowych w zaburzeniach neurologicznych. Narzędzia wektorowe i metody dostarczania znacznie ewoluowały w ostatnich latach w celu zapewnienia lepszego i bezpieczniejszego dostępu genetycznego do ośrodkowego układu nerwowego. Lepsze zrozumienie etiologii zaburzeń mózgu doprowadziło jednocześnie do identyfikacji ulepszonych celów terapeutycznych. Skupiamy się na technologii wektorowej, a także na postępach przedklinicznych i klinicznych poczynionych do tej pory w przypadku raka mózgu i różnych zaburzeń neurodegeneracyjnych i neurometabolicznych oraz zwracamy uwagę na wyzwania i ograniczenia, które towarzyszą tej nowej metodzie medycznej. Na koniec badamy kierunki, w których neurologiczna terapia genowa prawdopodobnie będzie ewoluować w przyszłości.

Ten artykuł jest częścią wydania specjalnego zatytułowanego „Poza małymi cząsteczkami w zaburzeniach neurologicznych”.


Udział Wszystkie opcje udostępniania: Ci kandydaci na szczepionkę Covid-19 mogą zmienić sposób, w jaki produkujemy szczepionki — jeśli zadziałają

Naukowcy z Uniwersytetu Oksfordzkiego opracowują jednego z wiodących kandydatów na szczepionkę Covid-19 opartą na adenowirusie. Steve Parsons / Pool / AFP przez Getty Images

W miarę jak pilna potrzeba szczepionki na koronawirusa Covid-19, kluczowym pytaniem dla naukowców jest to, czy ta pandemia będzie przełomowym momentem dla dwóch nowych technologii, które nigdy wcześniej nie były szeroko stosowane u ludzi. Jeśli okażą się skuteczne, podejścia te mogą radykalnie przyspieszyć opracowywanie innych nowych szczepionek i drastycznie obniżyć koszty, zwiastując nową erę w walce z chorobami zakaźnymi.

Główne technologie zyskujące popularność to szczepionki wykorzystujące wektor adenowirusowy i mRNA. Zamiast konstruować nową szczepionkę od zera, ideą stojącą za tymi technologiami jest użycie standardowego zestawu części, takich jak zmodyfikowany wirus lub nanocząsteczka, do przeniesienia materiału genetycznego do komórki. Ten materiał — DNA lub RNA — może następnie kodować określone białka wirusa.

Gdy okaże się, że jedna z tych platform dostawczych jest bezpieczna, pozostaje tylko dostroić nici DNA i RNA. To znacznie szybciej niż w przypadku konwencjonalnych szczepionek, które polegają na hodowaniu dużych ilości wirusów, które są następnie osłabiane, inaktywowane lub rozdzielane na drobne fragmenty i oczyszczane – procesy wymagające lat uciążliwych prób i błędów oraz testów bezpieczeństwa.

„Jeśli nowe platformy będą działać w pewien sposób, może to faktycznie zmienić sposób produkcji innych szczepionek”, powiedział Rahul Gupta, starszy wiceprezes i dyrektor ds. Medycyny i zdrowia w March of Dimes podczas seminarium internetowego National Press Foundation 7 sierpnia. „Tak więc możemy być u szczytu bardzo nowej technologii, którą zobaczymy po raz pierwszy od ponad wieku”.

Naukowcy korzystający z tych nowych platform opublikowali ostatnio kilka zachęcających wyników. W czwartek gigant farmaceutyczny Pfizer opublikował w czasopiśmie wyniki swoich badań klinicznych fazy 1 i 2 dla swojej platformy szczepionek opartych na mRNA Natura. Moderna wchodzi obecnie w fazę 3 testów swojej platformy mRNA dla Covid-19.

Tymczasem Jenner Institute na Uniwersytecie Oksfordzkim współpracuje z firmą AstraZeneca w celu opracowania szczepionki wykorzystującej platformę wektorów adenowirusowych. Opublikował również kilka wczesnych obiecujących wyników.

Ale jest duża konkurencja, a ponad 200 kandydatów na szczepionki przeciwko koronawirusowi jest przedmiotem dochodzenia na całym świecie. Dwa tuziny są poddawane testom na ludziach, a sześć jest w badaniach klinicznych fazy 3 od 13 sierpnia.

Wysiłki w zakresie szczepień na taką skalę są zdumiewające w przypadku choroby, którą odkryto niecały rok temu. Jednak ogromne spustoszenie zdrowotne i gospodarcze pandemii Covid-19 spowodowało bezprecedensowy poziom współpracy między naukowcami, a także finansowanie od rządów, prywatnych firm i filantropów. Dlatego niektórzy naukowcy spodziewają się, że w rekordowym czasie będzie wystarczająco dużo danych potwierdzających bezpieczeństwo i skuteczność szczepionki przeciw Covid-19, prawdopodobnie do końca roku lub na początku 2021 roku. Skuteczna, powszechnie dostępna szczepionka byłaby ważnym krokiem w kierunku zakończenia pandemia.

Jednak nie ma gwarancji, że którykolwiek z tych kandydatów odniesie sukces, nie mówiąc już o tym, czy nowa technologia szczepionek zatriumfuje nad wypróbowanymi i prawdziwymi metodami. Chociaż firmy pracujące z nowymi platformami z łatwością przeszły wcześniejsze etapy badań klinicznych, są teraz na łasce większych, wolniejszych badań fazy 3, w których wiele może się wydarzyć, aby zahamować ich postępy.

Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, jak działają te nowatorskie strategie zapobiegania infekcjom, co wnoszą do dyskusji i jakie są krytyczne zastrzeżenia, które należy wziąć pod uwagę.

Jak działa większość starszych szczepionek

Szczepionki działają poprzez trenowanie układu odpornościowego do zwalczania określonego patogenu. Kiedy go otrzymasz, twoje białe krwinki zostaną wprowadzone do potencjalnego zagrożenia, takiego jak wirus lub bakteria. Daje to czas systemowi odpornościowemu na rozpoczęcie reakcji, tak że jeśli patogen pojawi się innym razem, organizm może go szybko zneutralizować.

Szczepionki występują w różnych formach od wieków, ale w XX wieku pojawił się boom na choroby takie jak polio, wąglik, zapalenie płuc, zapalenie opon mózgowych, wirusowe zapalenie wątroby typu A i grypa.

Konwencjonalne strategie konstruowania szczepionek, które oferują silną, długotrwałą odporność obejmują naśladowanie celu. Jednym z najskuteczniejszych sposobów, aby to zrobić, jest zastosowanie żywej szczepionki atenuowanej. Tutaj żywa forma wirusa lub bakterii jest hodowana w taki sposób, że po podaniu człowiekowi jest osłabiona. Patogen może się nieco rozmnażać, ale rzadko na tyle, by spowodować chorobę u biorcy. Najpopularniejsze szczepionki — przeciwko ospie, odrze, śwince i różyczce — wykorzystują żywe atenuowane wirusy.

Szczepionki mogą również atakować toksyczne produkty bakterii lub wirusów. Szczepionki toksoidowe, takie jak te na błonicę i tężec, są stabilne i bezpieczne, ale często wymagają wielu dawek.

Innym podejściem jest użycie inaktywowanej wersji patogenu, zwykle żywego patogenu, który został celowo zabity przez ciepło lub obróbkę chemiczną. Takie jest podejście do szczepionek na choroby takie jak wirusowe zapalenie wątroby typu A i wścieklizna. Szczepionki z inaktywowanymi patogenami również często wymagają więcej niż jednej dawki lub dawek przypominających, aby zachować odporność.

Wolontariusz z Brazylii otrzymuje szczepionkę przeciwko Covid-19 wyprodukowaną przez chińską firmę Sinovac Biotech, która wykorzystuje chemicznie inaktywowany cały wirus. Silvio Avila/AFP przez Getty Images

Ale zamiast używać całych cząsteczek wirusa lub bakterii, naukowcy mogą również użyć oczyszczonych fragmentów patogenu – znanych jako antygeny – do wywołania reakcji immunologicznej. Te szczepionki podjednostkowe wydają się być stabilne, ale są trudne do wykonania i często generują słabszą odpowiedź immunologiczną niż szczepionki zawierające cały patogen.

Opracowanie szczepionki przy użyciu którejkolwiek z tych metod jest jednak czasochłonne, a wykazanie, że są one bezpieczne i skuteczne, często zajmuje ponad dekadę. To o wiele za długo podczas pandemii, takiej jak ta, która teraz ogarnia świat.

Nowe platformy szczepionek Covid-19 wykorzystują ludzkie komórki do wytwarzania kluczowych komponentów

Zarówno szczepionki mRNA, jak i szczepionki z wektorami adenowirusowymi opierają się na idei szczepionki podjednostkowej. W przypadku SARS-CoV-2, wirusa wywołującego Covid-19, najczęstszą podjednostką będącą przedmiotem zainteresowania jest białko wypustek.

To białko jest biznesowym końcem wirusa. To właśnie koronawirus wykorzystuje do łączenia się z receptorem ACE2 w ludzkiej komórce, aby dostać się do komórki, wykonać swoje kopie, a następnie rozprzestrzenić się na inne komórki.

Naukowcy argumentują, że mogą nakłonić układ odpornościowy do wytworzenia przeciwciał przeciwko temu białku kolce. Przeciwciała to białka wytwarzane przez układ odpornościowy, które przyczepiają się do określonych części patogenu, unieruchamiając go w ten sposób lub oznaczając go do zniszczenia przez inne komórki odpornościowe. Jeśli przeciwciała zwiążą się z białkiem kolczastym żywego wirusa SARS-CoV-2, mogą zapobiec wywołaniu infekcji.

Ale dzięki tym nowym platformom to nie białko kolczaste wirusa jest wstrzykiwane, ale instrukcje genetyczne, które go wytwarzają. Główne różnice między szczepionkami zawierającymi mRNA a szczepionkami zawierającymi wektory adenowirusa to materiał genetyczny, którego używają i sposób, w jaki wprowadzają go do komórki. Szczepionki mRNA wykorzystują mRNA, podczas gdy szczepionki adenowirusowe wykorzystują DNA.

Gdy instrukcje znajdą się w komórce, maszyneria komórki odczytuje je, aby wyprodukować białko kolce wirusa. Nowo wybite białka kolców są albo wydzielane z komórki, albo przyczepiane do jej powierzchni, gdzie inne komórki układu odpornościowego mogą zidentyfikować białko kolce i zacząć wytwarzać przeciwko niemu przeciwciała.

Proces kończy się nie tylko naśladowaniem kluczowej struktury wirusa, ale także naśladowaniem działania wirusa podczas infekcji, co może potencjalnie generować silniejszą odpowiedź immunologiczną i zapewniać lepszą ochronę w porównaniu z innymi podejściami. A ponieważ białka te są wytwarzane z wnętrza komórek, a nie wstrzykiwane z zewnątrz, prawdopodobieństwo wywoływania niepożądanych reakcji u biorcy może być mniejsze.

Jak działają szczepionki mRNA

11 sierpnia prezydent Donald Trump ogłosił, że rząd USA kupi 100 milionów dawek szczepionki przeciwko koronawirusowi Moderna mRNA w ramach transakcji o wartości 1,53 miliarda dolarów, co daje łączną inwestycję kraju w firmę do 2,48 miliarda dolarów. (Departament Zdrowia i Opieki Społecznej wcześniej powiedział, że kupi 100 milionów dawek szczepionki mRNA firmy Pfizer.)

To tylko kilka dużych zakładów, jakie rząd federalny postawił na różnych producentów szczepionek, ale fakt, że inwestuje tak dużo w nowe podejście, takie jak mRNA, sygnalizuje, jak wiele obiecuje.

mRNA oznacza komunikatorowy kwas rybonukleinowy. Jest to cząsteczka, która jest kopiowana z DNA w jądrze komórkowym i wykorzystywana jako kod do produkcji określonego białka. Jeśli myślisz o DNA w jądrze jak o gigantycznej książce kucharskiej zawierającej wszystkie przepisy na wszystkie posiłki, które kiedykolwiek zjesz, mRNA jest kartą notatek, której używasz, aby zapisywać instrukcje dotyczące robienia ulubionego chleba bananowego.

W porównaniu z DNA, mRNA jest krótsze, mniej stabilne i zaprojektowane do jednorazowego użytku. Twoje komórki cały czas wytwarzają i rozkładają nici mRNA.

W przypadku szczepionki mRNA chodzi o wprowadzenie do komórki segmentu mRNA, który koduje określone białko wirusowe. Dla twórców szczepionek oznacza to, że zamiast przechodzić przez żmudny proces izolowania i oczyszczania podjednostek wirusa, mogą po prostu zmienić kod w nici mRNA. To sprawia, że ​​proces rozwoju jest znacznie szybszy niż konwencjonalne podejścia, które mogą trwać miesiące lub lata.

Szczepionki oparte na mRNA oferują obiecujące podejście do zapobiegania zakażeniu koronawirusem. Chaiwat Subprasom / SOPA Images / LightRocket przez Getty Images

„mRNA można dosłownie ukończyć w ciągu dni lub tygodni, aby stworzyć zupełnie nową szczepionkę” – powiedział Drew Weissman, profesor medycyny na University of Pennsylvania.Zauważył, że minęło zaledwie 66 dni od zsekwencjonowania genomu wirusa SARS-CoV-2 do wstrzyknięcia pierwszemu pacjentowi szczepionki Covid-19 opartej na mRNA.

Jednym z wyzwań związanych z używaniem mRNA jest to, że organizm może je postrzegać jako zagrożenie, ponieważ wiele wirusów używa RNA do kodowania swoich genomów. W organizmie jest wiele enzymów, które mogą łatwo trawić RNA, zanim dostanie się do komórki. (Na skórze znajdują się nawet enzymy trawiące RNA.) Swobodnie pływające nici mRNA w organizmie mogą wywołać stan zapalny, więc aby chronić mRNA, dopóki nie dostanie się do komórki, deweloperzy zamykają je w nanocząstce lipidowej — maleńkiej bańce oleju. Sama nić RNA jest również modyfikowana, aby była mniej zapalna.

Po zakodowaniu, zmodyfikowaniu i zakapsułkowaniu mRNA można je następnie wstrzyknąć. „Wszystkie zmodyfikowane szczepionki RNA dla Covida podaje się domięśniowo, podobnie jak staromodne szczepionki przeciw grypie” – powiedział Weissman.

Podczas gdy mRNA cieszy się dużym zainteresowaniem, podobne podejścia są również poddawane testom. Inovio opracowuje szczepionkę na koronawirusa, która wykorzystuje dwuniciowy pierścień DNA znany jako plazmid. Wymaga ręcznego urządzenia do indukowania prądu elektrycznego w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, powodując otwarcie porów w komórce, co umożliwia wejście plazmidu. Instrukcje zawarte w plazmidzie można następnie wykorzystać do wytworzenia białek wirusowych. Firma spodziewa się, że we wrześniu rozpocznie testy III fazy.

Jak działają szczepionki zawierające rekombinowane wektory adenowirusa

Inną nową technologią platformy szczepionkowej dla Covid-19 jest wektor adenowirusowy. Jest to podejście, które firmy takie jak CanSino Biologics i Johnson & Johnson stosują do swoich szczepionek. Jest to również podstawa dla słynnego kandydata na szczepionkę z Jenner Institute na Uniwersytecie Oksfordzkim, który jest opracowywany z AstraZeneca i jest obecnie w fazie 3 badań klinicznych.

Rosyjski rząd ogłosił w tym tygodniu, że ma również szczepionkę z wektorem adenowirusowym przeciwko Covid-19. Nazwana Sputnik V, szczepionka została zarejestrowana do użytku, chociaż wielu badaczy spoza Rosji obawia się, że szczepionka uzyskała aprobatę bez przechodzenia pełnego zestawu badań klinicznych.

Rosja ogłosiła zatwierdzenie szczepionki na koronawirusa we wtorek, 11 sierpnia. Michaił Japaridze/TASS za pośrednictwem Getty Images

Adenowirusy to rodzina wirusów, które zwykle powodują łagodne choroby z objawami podobnymi do przeziębienia lub grypy, chociaż infekcja może być niebezpieczna dla osób z osłabionym układem odpornościowym lub pewnymi wcześniejszymi schorzeniami.

„Sugeruje to, że są one mniej patogenne i mogą z natury wywoływać ochronną odporność poprzez drogi nosowe w przypadku infekcji dróg oddechowych” – powiedziała w e-mailu profesor Wydziału Medycyny i Stomatologii Uniwersytetu Alberty, Babita Agrawal, która bada układ odpornościowy. „Dlatego szczepionka oparta na [wektorze adenowirusowym] może być z pewnością dobrym kandydatem na szczepionkę przeciwko SARS-CoV-2”.

Sam wirus ma zwykle mniej niż 100 nanometrów średnicy i kształt dwudziestościanu — 20-boczny kształt z trójkątnymi ściankami, podobny do kości D20. W rogach ma wystające włókna.

Adenowirus bardzo skutecznie przenika do komórek. Naukowcy od lat eksperymentowali z adenowirusem jako narzędziem terapii genowej, ale teraz stosują go w szczepionkach.

Naukowcy odkryli, że mogą zmodyfikować wirusa, aby wykorzystać jego umiejętności włamywania się i wchodzenia bez powodowania infekcji. Zamiast tego wirus może dostarczyć fragment materiału genetycznego do komórki, służąc jako wektor.

W przypadku Covid-19 naukowcy ponownie szukają instrukcji, jak wprowadzić białko wypustek SARS-CoV-2 do komórki.

Działa to tak, że naukowcy pobierają genom adenowirusa i wycinają fragment, który pozwala mu się rozmnażać. Następnie łączą fragment DNA, który koduje białko wypustek, zamieniając adenowirusa w zrekombinowany wektor.

Ponieważ adenowirus jest wirusem DNA, musi wprowadzić swój materiał genetyczny nie tylko do komórki, ale do jądra komórkowego.

„Wchodzi do jądra, ale nie wstawia się do genomu” – powiedział Hildegund C.J. Ertl, profesor w Centrum Immunoterapii Szczepionek i Immunoterapii Instytutu Wistar. „To dość przejściowy efekt”.

W jądrze DNA kodujący białko wypustek jest transkrybowany do mRNA, a następnie transportowany z jądra do cytoplazmy komórki, gdzie jest tłumaczony na białko.

Skoro więc zmodyfikowany wirus nie może się rozmnażać, w jaki sposób naukowcy robią ich więcej? William Wold, przewodniczący wydziału mikrobiologii molekularnej i immunologii w Szkole Medycznej Uniwersytetu Saint Louis, wyjaśnił, że zrekombinowane wirusy hoduje się w liniach komórkowych, które zapewniają brakujący sprzęt umożliwiający im tworzenie kopii samych siebie. „Łatwo jest stworzyć duże partie wirusa” – powiedział Wold. Ale bez tych zmodyfikowanych komórek wirus nie może się rozprzestrzeniać.

Istnieją jednak pewne wady. Ponieważ wersje adenowirusa rozprzestrzeniają się u ludzi, wiele osób ma odporność. Aby obejść ten problem, grupy takie jak zespół z Oksfordu używają adenowirusa szympansa jako wektora, który jest na tyle inny od ludzkich adenowirusów, że układ odpornościowy większości ludzi nie zareaguje na niego od razu.

Ale kiedy szczepionka zostanie dostarczona przy użyciu adenowirusa szympansa, prawdopodobnie wiele osób wykształci odporność na nowy wektor. Utrudniłoby to ponowne użycie tej samej platformy do kolejnej szczepionki.

Nowe platformy szczepionek Covid-19 wciąż borykają się z tymi samymi przeszkodami, co konwencjonalne podejścia: badania kliniczne fazy III i produkcja

Chociaż nowe podejścia do szczepionek pomogły przyspieszyć wczesny rozwój, obecnie wchodzą one w fazę 3 badań, w których dziesiątki tysięcy osób jest losowo wybieranych do otrzymania szczepionki lub placebo. Po prostu zrekrutowanie wystarczającej liczby odpowiednich uczestników może zająć tygodnie. Wiele kandydatów na szczepionki, w tym osoby korzystające z nowych platform, wymaga dwóch dawek, często w odstępie kilku tygodni. Zakończenie prób zależy od czekania i zobaczenia, jak wirus rozprzestrzenia się wśród tych, którzy otrzymali szczepionkę i tych, którzy jej nie otrzymali. To może zająć miesiące.

„Jedyną rzeczą, której nie można skrócić, są badania fazy 3” – powiedział dziennikarzom podczas webinarium National Press Foundation Paul Offit, dyrektor Vaccine Education Center w Szpitalu Dziecięcym w Filadelfii. "Dowód jest w budyniu. Faza 3 to budyń.”

Głównym wyzwaniem będzie wykazanie, że szczepionki faktycznie zapewniają ochronę przed koronawirusem. W badaniach klinicznych naukowcy odkryli, że zarówno szczepionki zawierające mRNA, jak i adenowirusy mogą sprawić, że organizm wytworzy przeciwciała przeciwko wirusowi i wywoła odpowiedź komórek odpornościowych.

To dobre znaki, ale nie gwarantują, że biorca szczepionki jest chroniony przed infekcją. W przypadku Covid-19 specyficzna kombinacja odpowiedzi organizmu, która wskazuje, czy ktoś jest odporny na wirusa, pozostaje nieznana. Ta kombinacja nazywana jest korelatem ochrony lub korelatem odporności.

Nie znając korelatu ochrony przed Covid-19, naukowcy mogą dowiedzieć się, czy szczepionka jest skuteczna tylko wtedy, gdy jest testowana przeciwko rzeczywistemu wirusowi. Oznacza to czekanie, aby zobaczyć, jak zaszczepieni ludzie zareagują, gdy zostaną narażeni.

Signs in Mumbai w Indiach gratulują Uniwersytetowi Oksfordzkiemu sukcesu szczepionki na koronawirusa we wczesnych próbach. Satish Bate / Hindustan Times przez Getty Images

Próby fazy 3 zapewniają również ważną końcową kontrolę bezpieczeństwa. Większość skutków ubocznych związanych z tymi nowymi platformami szczepionek – gorączka, bóle mięśni, bolesność, dreszcze – była dość niewielka we wczesnych badaniach klinicznych. Jednak bardziej znaczące i rzadsze komplikacje mogą pojawić się podczas testów na dużą skalę, kiedy ludzie z niedoskonałym stanem zdrowia lub wcześniej istniejącymi schorzeniami zaczną otrzymywać szczepionki. Ważne jest, aby upewnić się, że takie problemy są rzadkie, ponieważ szczepionka Covid-19 potencjalnie musiałaby zostać podana miliardom ludzi.

Jeśli nowa platforma szczepionkowa zostanie zatwierdzona, kolejnym wyzwaniem będzie wyprodukowanie wystarczającej liczby szczepionek. Świat ma dziesięciolecia doświadczenia w produkcji konwencjonalnych szczepionek, ale firmy wciąż uczą się, jak produkować nowe platformy w dużych ilościach.

„Linia startu jest nieco dalej. Nie mamy pewności co do powszechnego stosowania tej samej technologii w innej szczepionce” – powiedział Jesse Goodman, profesor medycyny na Georgetown University i były główny naukowiec w Food and Drug Administration. „Na przykład, kiedy w 2009 r. mieliśmy pandemię grypy [H1N1], te szczepionki zostały wyprodukowane przy użyciu technologii, urządzeń i procesów produkcyjnych, których używaliśmy co roku w przypadku szczepionek przeciw grypie”.

Wyprodukowanie w laboratorium małych partii szczepionki mRNA lub adenowirusa to jedno. Zupełnie innym przedsięwzięciem jest wytwarzanie miliardów dawek na wielu liniach montażowych w różnych częściach świata. Taka produkcja na dużą skalę wymagałaby globalnego łańcucha dostaw i walidacji, aby zapewnić, że zakłady zapewniają spójny produkt. Ta infrastruktura nie została jeszcze zbudowana.

A ponieważ większość świata pozostaje podatna na tę chorobę, każda szczepionka na koronawirusa będzie musiała zostać zastosowana na znacznie większą skalę niż istniejące szczepionki, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się wirusa.

To zmusza rządy i instytucje do podjęcia bezprecedensowych kroków w celu przygotowania. „Jedyną rzeczą, która wydarzyła się z tą szczepionką, której nigdy wcześniej nie widziałem, jest to, że firmy farmaceutyczne już zaczęły wytwarzać szczepionki dla ludzi, nawet jeśli nie zostały jeszcze zatwierdzone” – powiedział Weissman.

Ale nadal nie ma gwarancji, że jakakolwiek szczepionka na koronawirusa przyniesie efekty. Pierwsza szczepionka z całej linii może nie być najlepsza, ponieważ prawdopodobnie będzie potrzebna wielokrotna szczepionka dla różnych podgrup populacji, takich jak osoby starsze. Więc nawet jeśli szczepionka mRNA lub szczepionka adenowirusowa przeciwko Covid-19 zyska aprobatę, rozważne może być kontynuowanie również stosowania konwencjonalnej szczepionki.

A same szczepionki nie wystarczą. Zakończenie pandemii Covid-19 nadal będzie wymagało środków, takich jak dystans społeczny, dopóki nie zostanie zaszczepiona wystarczająca liczba osób, aby stworzyć odporność stada. Chociaż czas, w którym może zakończyć się faza 3 próby szczepionki przeciwko Covid-19, w dużej mierze nie leży w naszych rękach, możemy teraz przygotować grunt pod koniec pandemii, ograniczając rozprzestrzenianie się tej śmiertelnej choroby.

Czy zostaniesz naszym 20-tysięcznym kibicem? Kiedy wiosną gospodarka pogorszyła się i zaczęliśmy prosić czytelników o dotacje finansowe, nie byliśmy pewni, jak się potoczy. Dzisiaj z pokorą możemy powiedzieć, że prawie 20 000 osób się włączyło. Powód jest zarówno piękny, jak i zaskakujący: czytelnicy powiedzieli nam, że wnoszą wkład zarówno dlatego, że cenią wyjaśnienia, jak i dlatego, że cenią to inne osoby też mają do niego dostęp. Zawsze wierzyliśmy, że dziennikarstwo wyjaśniające jest niezbędne do funkcjonowania demokracji. To nigdy nie było ważniejsze niż dzisiaj, podczas kryzysu zdrowia publicznego, protestów dotyczących sprawiedliwości rasowej, recesji i wyborów prezydenckich. Ale nasze charakterystyczne dziennikarstwo wyjaśniające jest drogie, a sama reklama nie pozwoli nam dalej tworzyć go z jakością i objętością, jakiej wymaga ten moment. Twój wkład finansowy nie będzie stanowić darowizny, ale pomoże zachować Vox wolny dla wszystkich. Wpłać już dziś już od 3 USD.

Miliony zwracają się do Vox, aby zrozumieć, co się dzieje w wiadomościach. Nasza misja nigdy nie była tak ważna jak w tej chwili: wzmacniać poprzez zrozumienie. Wkłady finansowe naszych czytelników są kluczową częścią wspierania naszej pracochłonnej pracy i pomagają nam zapewnić bezpłatne dziennikarstwo dla wszystkich. Rozważ wniesienie wkładu na rzecz Vox już dziś już od 3 USD.


Biologia komórek, wykład 16 i następne

Struktura - wymaga komórki gospodarza do replikacji - rozmnaża się przez składanie części, a nie przez dzielenie wcześniej istniejących wirusów - mniejszy niż rybosom &lt20nM - kwas nukleinowy jest zwykle pojedynczą cząsteczką zwaną chromosomem, który może być liniowy lub kołowy - zawiera dsDNA , dsRNA ssDNA, ssRNA - małe genomy - kapsyd - ochronny płaszcz białkowy materiału genetycznego - kapsomer - powtarzające się podjednostki białkowe kapsydu - zmienna wielkość i kształt. Generalnie jeden lub dwa rodzaje białek tworzących kapsyd - wirusy z otoczką lub bez otoczki uciekają z gospodarza przez pączkowanie. Wirusy bezotoczkowe na ogół pękają z błony plazmatycznej

Klasyfikacja na podstawie celu (żywiciela) Wirus bakterii – bakteriofag lub fag Wirus eukariontów – wirusy (zwierzęta), wiroidy (rośliny)

Typowe struktury wirusów

Głowa kapsydu – ogon białkowy (przyczepia się do prokariota)

Rozmnażanie wirusa Wirusy są obowiązkowymi pasożytami – muszą mieć żywiciela – same nie mogą nic zrobić – brak enzymów metabolicznych – brak siły napędowej protonów – zdolność żywych komórek do utrzymywania granicy między sobą a światem zewnętrznym. Np. białka na zewnątrz, które mogą wnikać i wytwarzać ATP – zakres gospodarzy jest zwykle wąski – specyficzny dla gospodarza – przyłączanie gospodarza jest specyficzne dla receptora – cykl życiowy zaczyna się od wstrzyknięcia kwasu nukleinowego, endocytozy (pochłonięcie przez komórkę) lub fuzji błon

Cykle bakteryjne Wybór pomiędzy cyklami zwykle zależy od stanu metabolicznego żywiciela

komórka. Cykl lityczny - wstrzykuje DNA do komórki gospodarza - DNA degraduje komórki gospodarza DNA - synteza genu wirusa i białka - składanie i uwalnianie faga - zwykle zabija komórkę gospodarza Wszystkie części białek znajdują się nawzajem, a bakteriofag tworzy wiele kopii samego siebie. DNA będzie produkować białka, które wykorzystują komórkę od wewnątrz do ucieczki.

Lizogeniczny - zamiast przechodzić przez cykl lityczny, DNA wbudowuje się w genom komórki gospodarza i przechodzi w stan uśpienia. Za każdym razem, gdy komórka gospodarza replikuje fagowy DNA jest również replikowany.

Stan uśpienia występuje, ponieważ pewne białka wirusowe działają jako represory genetyczne, blokując ekspresję genów wirusowych zaangażowanych w szlak lityczny. Uśpiony wirusowy kwas nukleinowy jest określany jako profag. Uśpione profagi mogą stać się aktywne i podjąć rozwój lityczny. Represja zostaje zniesiona i rozpoczyna się ekspresja genów litycznych.

Retrowirus (HIV) Retrowirusy to wirusy otoczkowe RNA zawierające enzym, odwrotną transkryptazę, który tworzy kopię DNA ich RNA.

Kopia DNA retrowirusa wchodzi do jądra gospodarza i jest wstawiana do chromosomu komórki gospodarza, aby stać się prowirusem. Prowirusowy DNA jest transkrybowany przez komórkę gospodarza, aby wytworzyć mRNA dla białek wirusowych, a także dla nowych genomów wirusowego RNA, tak aby nowe retrowirusy mogły zostać złożone w komórce. Większość retrowirusów, jak również wiele innych wirusów eukariotycznych, wytwarza wirusy potomne, które pączkują z zainfekowanych komórek, nie zabijając ich.

Kwas nukleinowy – cDNA jest syntetyzowany z RNA przez odwrotną transkryptazę, a następnie replikuje DNA komórki gospodarza Powłoka białkowa – transkrybowana przez DNA – gen Otoczka – pączkująca z błony komórkowej zwierzęcia

Wirusy i zmiany genetyczne Mechanizmy obronne, takie jak komórkowy układ odpornościowy ssaków, mogą rozpoznawać i niszczyć komórki zakażone wirusami. Jednak ich praca nie jest łatwa, ponieważ każda zainfekowana komórka może wytworzyć setki lub tysiące nowych wirusów. - Wirusy RNA mają wyższy wskaźnik mutacji niż DNA, ponieważ polimeraza RNA

Jak bakterie ewoluują 1. namnażanie 2. dziedziczność 3. zmienność 4. poziomy transfer genów

Horyzontalny transfer genów: rozmnażanie bezpłciowe Proces, w którym organizm włącza materiał genetyczny innego organizmu, nie będąc jego potomstwem

→ Transformacja – zmiana genotypu komórki (biorcy) poprzez wychwyt nagiego DNA. Niektóre pozyskują DNA w sposób naturalny (np. martwa komórka). - Mają białka powierzchniowe, które rozpoznają i importują fragmenty DNA blisko spokrewnionych bakterii. DNA można zintegrować z chromosomem bakteryjnym przez rekombinację. Jeśli nowy DNA zawiera geny, geny te mogą ulegać ekspresji w transformowanej komórce

→ Koniugacja - niektóre plazmidy mogą być przenoszone z komórki do komórki poprzez koniugację, która jest bakteryjnym odpowiednikiem płci - DNA jest przenoszone od dawcy do komórki biorcy przez pilus płciowy lub przez cytoplazmatyczny mostek kojarzący (tunel koniugacji) - komplementarny Nici DNA są tworzone przez replikację, dzięki czemu zarówno komórki dawcy, jak i biorcy mają następnie dwuniciową kopię plazmidu

→ Transdukcja - bakteriofag robi złą robotę i pakuje DNA gospodarza w cyklu replikacji zamiast własnego DNA. - Oznacza to, że nowe fagi nie mogą powstać w zakażonych komórkach (ponieważ brakuje ważnych genów), ale zamiast tego fragmenty bakteryjnego DNA mogą być przenoszone z jednej komórki do drugiej

Konsekwencje selekcji HGT dla HGT - nowe geny - nowe kombinacje - szybka ewolucja

Innym rodzajem elementu genetycznego, który może być przenoszony między bakteriami, są plazmidy R (odporności), które niosą do dziesięciu genów oporności na antybiotyki. Przenoszenie oporności na antybiotyki przez koniugację stanowi poważny problem w leczeniu chorób, zwłaszcza w szpitalach. Przykładem tego jest gen beta laktamazy (bla), który jest produktem białkowym tego

gen jest enzymem niszczącym penicylinę i pokrewne antybiotyki.

Patogen – organizm lub wirus wywołujący chorobę

Charakter – cecha dziedziczna np. kolor kwiatu Cecha – każdy wariant charakteru np. fioletowe i białe kwiaty

Gen – dyskretna jednostka informacji dziedzicznej np. gen „P” Allel – alternatywna wersja genu np. allel „P” i „p”

Genotyp – budowa genetyczna organizmu Fenotyp – obserwowalne cechy fizyczne/fizjologiczne organizmu

Krzyżówka monohybrydowa to eksperyment hodowlany pomiędzy dwoma osobnikami, które są heterozygotyczne pod względem jednego genu (np. Pp dla koloru kwiatu)

Hipoteza Mendla 1. istnieją odrębne czynniki dziedziczne (allele) 2. każdy osobnik ma 2 kopie każdego czynnika (diploid) 3. jeden z czynników (allele) dominuje nad drugim 4. allele segregują się podczas tworzenia gamet (anafaza 1) – prawo segregacji

Mendel sprawdził swoją hipotezę Czy to wyjaśnia obserwowane wyniki? Mendel postulował, że każdy z jego dwóch prawdziwych rodziców hodowlanych miał tylko jeden typ allelu, który mogliby wnieść do F1. Na przykład rodzice PP dali tylko allele P, a rodzice pp tylko allele p. Kiedy zostały skrzyżowane, całe potomstwo F1 miałoby genotyp Pp. Kontynuując na rodzicach z pokolenia F1 każdy powinien dać jeden allel P i jeden allel p. Doprowadziłoby to do przydziału 3 fioletowych : 1 białych kwiatów w F2. PP, Pp, s. To potwierdziło hipotezę Mendla

Kwadraty Punneta pokazują możliwe kombinacje gamet i przewidywane proporcje genotypu i fenotypu.

Teoria prawdopodobieństwa Prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzenia = liczba jego wystąpień/liczba możliwości

1:1:1:1 Dihybryd Y AaBb x aabb

Testcross – homozygotyczny recesywny x heterozygotyczny

Przykład AaBbCcDDEeFf x AaBbCCddeeFf Jaka część potomstwa będzie aabbCcDdeeFf? - znajdź wszystkie indywidualne prawdopodobieństwa, a następnie użyj reguły iloczynu aa ¼ bb ¼ Cc ½ Dd 1 ee ½ Ff ½

Rozszerzenie genetyki Mendla

Proste geny – Relacje dominacji Całkowita dominacja – obecność jednego allelu całkowicie maskuje drugi – kolor kwiatu (groszek)

Niepełna dominacja – żaden z alleli nie maskuje drugiego i wyrażany jest fenotyp pośredni, który częściowo wyraża oba allele – hipercholesterolimia, kolor kwiatów – różowy

Kodominacja – oba allele są wyrażane jednakowo – grupy krwi ABO

Allele wielokrotne – więcej niż dwa allele na poziomie populacji – grupy krwi ABO

Epistaza wielu genów – jeden gen wpływa na ekspresję fenotypową innego genu Np. psy labrador (kolor sierści)

Umaszczenie czarnego koloru B dominuje w brązowym b. Aby laboratorium miało brązowe futro, musi to być bb. Drugi gen określa, czy pigment zostanie osadzony we włosach. Dominujący allel E powoduje odkładanie czarnego B lub brązowego pigmentu b. Ale jeśli laboratorium jest homozygotyczne recesywne ee, wtedy sierść jest żółta, niezależnie od genotypu w czarnym/brązowym locus. (wszystkie zmiany 9:3:3:1)

Znaki Mendlowskie – fenotypy dyskretne (albo-albo) Znaki ilościowe – ciągła zmienność między ekstremami

Dziedziczenie poligeniczne – wpływ dwóch lub więcej genów na pojedynczy fenotyp. Znaki ilościowe Np. wzrost, kolor skóry (ludzie), daltonizm (ludzie)

Geny sprzężone z płcią – zlokalizowane na jednym z chromosomów płci (zwykle X). Chromosomy X są duże, niosą wiele genów, których nie ma na chromosomie Y. Recesywne geny sprzężone z płcią na chromosomie X są widoczne z większego odsetka mężczyzn niż kobiet, którzy wykazują tę cechę (mają tylko jeden chromosom X)

Hemizygotyczny – opis genotypu dla mężczyzn sprzężonych z chromosomem X, którzy mają tylko jeden allel (Xw i Y). Samce muszą odziedziczyć tylko jedną kopię zmutowanego allelu i dlatego częściej wyrażają tę cechę niż dziewczynki, które potrzebują dwóch kopii.

Analiza rodowodowa, PCR i profilowanie genetyczne

Analiza rodowodowa Wzorce dziedziczenia wyprowadzane są z badań nad rodzinnym dziedziczeniem postaci na przestrzeni wielu pokoleń. Ważnym zastosowaniem rodowodu jest pomoc w obliczeniu prawdopodobieństwa, że ​​przyszłe dziecko będzie miało określony genotyp i fenotyp. Np. dołączone płatki uszu

Zaburzenia dziedziczone recesywnie Wiadomo, że tysiące zaburzeń genetycznych jest dziedziczonych jako proste cechy recesywne. Wiele osób z zaburzeniami recesywnymi rodzi się z rodziców, którzy są nosicielami zaburzenia, ale mają normalny fenotyp. Zaburzenia te wahają się od stosunkowo łagodnych (takich jak bielactwo) do zagrażających życiu (takich jak mukowiscydoza).

Zaburzenia dziedziczone dominująco Chociaż większość szkodliwych alleli jest recesywnych, wiele ludzkich zaburzeń jest spowodowanych przez allele dominujące. Jednym z przykładów jest forma karłowatości, która występuje u jednej na 25 osób. Osoby heterozygotyczne mają fenotyp karłowaty. Dominujące allele powodujące śmiertelną chorobę są znacznie rzadsze niż allele recesywne, które powodują śmiertelne skutki.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Fenotyp postaci najczęściej obserwowanej w naturalnych populacjach, takiej jak czerwone oczy, nazywany jest typem dzikim. Cechy, które są alternatywą dla typu dzikiego, takie jak białe oczy, nazywane są zmutowanymi fenotypami. Zmutowane allele są recesywne w stosunku do typu dzikiego i żaden gen nie znajduje się na chromosomie płci.

Pierwsza była krzyżówką pokolenia P do generowania much dihybrydowych F1, a druga była krzyżówką testową. Powstałe muchy miały znacznie wyższy odsetek kombinacji cech obserwowanych u much pokolenia P, niż można by się spodziewać, gdyby oba geny dobierały się niezależnie. Morgan doszedł więc do wniosku, że kolor ciała i rozmiar skrzydeł są zwykle dziedziczone razem w określonych (rodzicielskich) kombinacjach, ponieważ geny tych cech są blisko siebie na tym samym chromosomie.

Niepołączone geny: Niezależny zestaw chromosomów, których Mendel nauczył się z krzyżówek, w których podążał za dwoma postaciami, że niektóre potomstwo mają kombinacje cech, które nie pasują do tych u żadnego z rodziców. Pokolenie F1 pasujące do fenotypów rodzicielskich jest nazywane typami rodzicielskimi, a nowe fenotypy nazywane są typami rekombinowanymi. 50% częstość rekombinacji w takich krzyżówkach testowych jest obserwowana dla dowolnych dwóch genów, które znajdują się na różnych chromosomach i dlatego nie mogą być połączone.

Połączone geny: Crossing over Always &lt50% Większość potomstwa z eksperymentu Drosophilia miała fenotypy rodzicielskie (ponad 50%), co sugeruje, że te dwa geny znajdowały się na tym samym chromosomie (tylko 17% rekombinantów). Morgan zaproponował, że musi nastąpić jakieś przejście. Przejście, które występuje, gdy replikowane chromosomy homologiczne są sparowane podczas profazy mejozy 1, zestaw białek organizuje wymianę odpowiednich segmentów jednego

matczyna i jedna ojcowska chromatyda.

Częstotliwość rekombinacji Zależy od odległości między genami na chromosomie.

Im bardziej oddalone są dwa geny, tym większe prawdopodobieństwo, że nastąpi między nimi skrzyżowanie, a zatem wyższa częstotliwość rekombinacji.

Mapa genetyczna oparta na częstotliwościach rekombinacji nazywana jest mapą sprzężeń. Odległość między genami jest wyrażona w jednostkach mapy, definiując jedną jednostkę mapy jako równoważną 1% częstości rekombinacji.

Częstotliwość rekombinacji nigdy nie przekracza 50% dla połączonych genów

Mapowanie genetyczne Wiele ludzkich genów chorobowych, na przykład mukowiscydozy, zidentyfikowano na podstawie ich wzorców dziedziczenia (analiza rodowodowa). Pozycje tych genów w genomie określono poprzez analizę powiązania genetycznego między genem choroby a znanymi markerami genetycznymi. Markery genetyczne to wykrywalne sekwencje w DNA, które są dziedziczone wraz z genem choroby.

SNP jako markery w mapowaniu genetycznym SNP – polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (podstawienia jednozasadowe). Te i inne markery polimorficzne można wykorzystać do zlokalizowania genów w badaniach rodzinnych LUB w populacjach (badania asocjacyjne). Większość SNP znajduje się w regionach niekodujących. Marker i gen są prawie zawsze dziedziczone razem, nawet jeśli marker nie jest częścią genu. Na przykład w określonym miejscu jedna osoba może mieć G, podczas gdy inna osoba może mieć A.

Badanie asocjacyjne - przeprowadzone na dużych populacjach - podejście ilościowe w celu sprawdzenia prawdopodobieństwa przenoszenia określonego genu - np. przy użyciu SNP więcej osób z chorobą ma A zamiast C w określonej lokalizacji

Regulacja genów bakterii

Ekspresja genów Konstytutywna – gen ulega ciągłej ekspresji (transkrypcji i translacji) Regulowany – gen ulega ekspresji tylko wtedy, gdy jest to wymagane (zwykle ze względu na regulację transkrypcji)

Centralny dogmat DNA ----&gt mRNA -----&gt białko

Indukowalny operon lac Stan domyślny to OFF Transkrypcja indukowalnego operonu jest stymulowana, gdy określona mała cząsteczka wchodzi w interakcję z genem regulatorowym

E.coli posiada 3 geny biorące udział w metabolizmie disacharydowego cukru laktozy. lacZ – rozkłada disacharydy na monosacharydy lacY – transportuje laktozę do wnętrza komórki lacA – detoksykacja analogów laktozy

→ Bez laktozy – nie powstają enzymy. Represor wiąże się z witryną operatora. → Obecność laktozy (i brak glukozy) – powstają enzymy. Izomer laktozy (allolaktoza) wiąże się z białkiem represora, dzięki czemu może dłużej wiązać się z miejscem operatora

Gen regulatorowy to lacl, który koduje allosteryczne białko zwane represorem lac. Wyraża się to konstytutywnie na niskim poziomie. lacl zapobiega transkrypcji genów lac przy braku laktozy. Wiąże się z operatorem i zapobiega wiązaniu polimerazy RNA z jego miejscem promotorowym. Gdy laktoza jest obecna, represor wiąże się z izomerem laktozy (allolaktozą), który jest wytwarzany, gdy laktoza wnika do komórek. Zmienia to konformację białka represora tak, że nie może już wiązać się z miejscem operatora lac.

Kontrola negatywna – białko regulatorowe wiąże się z DNA i system zostaje WYŁĄCZONY

Kontrola pozytywna – gen regulatorowy wiąże się z DNA i układ jest włączony – białko regulatorowe jest aktywatorem – np. operon lac

operon lac Metabolizm laktozy polegał na rozbiciu disacharydu na składniki monosacharydowe – glukozę i galaktozę. Galaktoza jest następnie metabolizowana do glukozy.

Stężenie glukozy sygnalizowane jest poziomem nukleotydu zwanego cyklicznym AMP (cAMP). Obecność glukozy powoduje spadek poziomu cAMP. Gdy obecny jest cAMP (niski poziom glukozy), wiąże się z białkiem zwanym CAP. Kompleks ten może następnie wiązać się z regionem promotorowym operonu lac i ułatwia wiązanie polimerazy RNA. To z kolei rozpoczyna transkrypcję.

Obecna glukoza – niski kompleks cAMP-CAP – nieaktywowana transkrypcja Brak glukozy – wysoki poziom cAMP-CAP – wiąże się z promotorem i rozpoczyna transkrypcję (włącza system) Zatem kompleks cAMP-CAP jest aktywatorem transkrypcji operonów.

Klasyfikacja metod kontrolnych: Indukowalna: domyślnie = WYŁ Represyjna: domyślnie = WŁ.

Kontrola pozytywna: białko regulatorowe jest aktywatorem – wzmacnia transkrypcję Kontrola negatywna: białko regulatorowe jest represorem – zatrzymuje transkrypcję

Obecna laktoza Obecna glukoza Ekspresja genów lac Nie Tak Nie Nie Nie Nie Tak Tak Tak (niska) Tak Nie Tak (wysoka)

  • kondensuje chromatynę i spowalnia lub dezaktywuje transkrypcję genów
  • związane z długotrwałą aktywnością genów

Regulacja inicjacji transkrypcji przed mRNA ----&gt RNA ----&gt mRNA

Inicjacja transkrypcji większości genów eukariotycznych jest regulowana przez pozytywny mechanizm, w którym do wiązania polimerazy RNA wymagane są białka regulatorowe zwane ogólnymi czynnikami transkrypcyjnymi. Czynniki transkrypcyjne wiążą się bezpośrednio z promotorowym DNA, jak również ze sobą i/lub z polimerazą RNA. Bez pomocy czynników transkrypcyjnych eukariotyczna polimeraza RNA nie może rozpoznać promotora i wiązać się z nim.

Dodatkowe białka regulatorowe wiążą się z określonymi sekwencjami DNA zwanymi elementami kontrolnymi. Albo:

  • proksymalny – blisko promotora
  • wzmacniacze – odległe – mogą być oddalone o tysiące par zasad od promotora Dany gen może mieć wiele wzmacniaczy, z których każdy jest aktywny w innym czasie lub w innym typie komórki lub lokalizacji w organizmie.

Białka regulatorowe, które wiążą się z tymi elementami kontrolnymi, wpływają na wiązanie ogólnych czynników transkrypcyjnych lub aktywność polimerazy RNA, a tym samym zmieniają wydajność inicjacji transkrypcji. Te białka regulatorowe nazywane są specyficznymi czynnikami transkrypcyjnymi. 1. aktywatory 2. mediator (koaktywator)

Białka aktywatorowe wiążą się z dalszymi elementami kontrolnymi zgrupowanymi jako wzmacniacze w DNA. Ten wzmacniacz ma trzy miejsca wiążące, każde zwane dystalnym elementem kontrolnym

Białko zginające DNA przybliża związane aktywatory do promotora. W pobliżu znajdują się ogólne czynniki transkrypcyjne, białka mediatorowe i polimeraza 2 RNA

Aktywatory wiążą się z pewnymi białkami mediatorowymi i ogólnymi czynnikami transkrypcyjnymi, pomagając im w tworzeniu aktywnego kompleksu inicjacji transkrypcji na promotorze

Specyficzne czynniki transkrypcyjne, które działają jako represory, mogą hamować ekspresję genów na kilka sposobów. Niektóre wiążą się bezpośrednio z DNA elementu kontrolnego, blokując wiązanie aktywatora. Inne represory ingerują w sam aktywator, więc nie może wiązać się z DNA. Niektóre represory rekrutują białka, które usuwają grupy acetylowe z histonów, co prowadzi do zmniejszonej transkrypcji. Niektóre aktywatory i represory działają pośrednio, wpływając na strukturę chromatyny.

Kombinatoryczna kontrola aktywacji genów – precyzyjna kontrola transkrypcji zależy w dużej mierze od wiązania aktywatorów z elementami kontrolnymi DNA. - każdy wzmacniacz składa się z około 10 elementów kontrolnych, z których każdy może wiązać tylko jeden lub dwa specyficzne czynniki transkrypcyjne. - Jest to szczególna kombinacja elementów kontrolnych w wzmacniaczu skojarzona z genem, a nie obecność pojedynczego unikalnego elementu kontrolnego.

Koordynowane geny u eukariontów W jaki sposób geny o powiązanych funkcjach są skoordynowane w każdej komórce? Skoordynowaną ekspresję genów osiąga się również za pomocą elementów kontrolnych. Geny eukariotyczne o pokrewnej funkcji zwykle nie są zgrupowane, a każdy gen ma swój własny promotor. Koordynację osiąga się dzięki temu, że każdy gen ma wspólne (pasujące) elementy kontrolne rozpoznające specyficzny aktywator (białko regulatorowe).

Alternatywny splicing RNA Różne cząsteczki mRNA są wytwarzane z tego samego pierwotnego transkryptu, w zależności od tego, które segmenty RNA są traktowane jako eksony, a które jako introny. Stąd różne wzorce splicingu intronów prowadzą do różnych form białka wytwarzanego z jednego genu. Białka regulatorowe specyficzne dla typu komórki kontrolują wybory intron-egzon poprzez wiązanie się z sekwencjami regulatorowymi w transkrypcie pierwotnym. Na przykład, z jednego genu jeden typ polipeptydu może być wytwarzany w jednym typie komórki, a inny inny typ polipeptydu wytwarzany w innej komórce. Spliceosom – złożony z snRNA (małe jądrowe RNA)

Klonowanie genów Klonowanie genów to proces, w którym interesujący gen jest pobierany z jednego organizmu i umieszczany w innym organizmie

Klonowanie genów jest przydatne do dwóch podstawowych celów - do tworzenia wielu kopii (wzmacniania) określonego genu - do wytworzenia produktu białkowego

Plazmidy bakteryjne - małe okrągłe dsDNA z zaledwie kilkoma genami - replikują się niezależnie od chromosomu gospodarza (obie komórki potomne otrzymują kopię plazmidu)

Bakterie mają plazmidy. Używany do klonowania jako wektory ---&gt przenosi DNA

Problemy: 1. obcy gen musi zostać zreplikowany – zreplikowany w tym samym czasie co plazmid i wstawiony w tło plazmidu 2. transformacja jest rzadka – trzeba wyselekcjonować transformanty – chce wyselekcjonować plazmid poprzez zachowanie genu odporności

Jak wyciąć interesujący gen i odciąć plazmid? 1. Enzym restrykcyjny

  • bardzo specyficzne, rozpoznające konkretną krótką sekwencję DNA lub miejsce restrykcyjne i przecinające obie nici DNA (wiązania kowalencyjne) w precyzyjnych punktach tego miejsca restrykcyjnego
  • najbardziej użyteczny enzym restrykcyjny rozszczepia szkielety cukrowo-fosforanowe w dwóch niciach DNA w sposób naprzemienny. Powstałe dwuniciowe fragmenty restrykcyjne mają co najmniej jeden jednoniciowy koniec, zwany lepkim końcem.
  • są częścią bakteryjnego systemu obronnego
  • degraduje inwazyjne DNA (np. z fagów), ale nie własny chromosom gospodarza
    1. Ligaza DNA
  • łączy ze sobą fragmenty DNA
  • jest naturalną częścią replikacji i naprawy DNA
  • łączy małe fragmenty replikacji na odwrotnej nici podczas replikacji DNA

Transformacja → Proces wprowadzania zrekombinowanego DNA z powrotem do bakterii. Aby przezwyciężyć różnice w promotorach i innych sekwencjach kontrolnych DNA, naukowcy zwykle stosują wektor ekspresyjny – wektor do klonowania i miejsce wiązania rybosomów, które zawiera wysoce aktywny promotor bakteryjny tuż przed miejscem restrykcyjnym, w którym można wstawić gen eukariotyczny. Bakteryjna komórka gospodarza rozpozna promotor i przystąpi do transkrypcji obcego genu połączonego z tym promotorem. Takie wektory ekspresyjne umożliwiają syntezę wielu białek eukariotycznych w komórkach bakterii.

Przykład: Odporność na ampicylinę – selekcja komórek z plazmidem Ampicylina hamuje syntezę ściany komórkowej bakterii - Potraktuj komórki ampicyliną, a jeśli nie mają genu odporności (wstawionego), umrą.

Sprawdzenie kolonii – fragmenty DNA na żelu powinny być równe segmentom w każdym plazmidzie


Czy szczepionki mRNA zepsują moje DNA? — Dr Musa Mohd Nordin & Dr Husna Musa

Jeśli już, zastosowanie mRNA jest bezpieczniejsze niż dostarczanie całego wirusa lub DNA, ponieważ mRNA nie jest zakaźne i nie może zostać włączone do genomu gospodarza.

Szczepionki Pfizer-BioNTech i Moderna COVID-19 to szczepionki mRNA (messenger RNA), które polegają na mRNA w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej i wytworzenia ochronnych przeciwciał.

Podczas procesu transkrypcji polimeraza RNA tworzy kopię genu z jego DNA na mRNA, zgodnie z sygnałem komórki. Sekwencje mRNA w komórce są bezpośrednią kopią sekwencji DNA w naszych genach.

Nić mRNA wychodzi z jądra i wchodzi do cytoplazmy (z nanocząsteczką lipidową nośnika). mRNA, które niesie wiadomość genetyczną, przyłącza się następnie do rybosomów, gdzie zachodzi translacja, która koduje aminokwasy tworzące białka.

mRNA szczepionki instruuje rybosomy, aby wytworzyły białka S. Są to kolce na koronawirusa, który działa jak antygen. Antygeny te opuszczają komórkę i pobudzają układ odpornościowy organizmu do wytwarzania przeciwciał neutralizujących.

Antygeny (białko S) wytwarzane przez mRNA są biologicznie obojętne. Wywołują odpowiedź immunologiczną, ale nie wywołują żadnego innego efektu biologicznego, są nieszkodliwe.

Tak więc DNA sprawia, że ​​RNA tworzy białko.

Gdy mRNA utworzy białko, jest ono następnie rozkładane na poszczególne nukleotydy, które mają być ponownie wykorzystane przez komórkę.

mRNA tylko odczytuje informacje DNA i przenosi je do rybosomów, które wytwarzają antygen białka S. Jako mRNA nie musi już dłużej utrzymywać się po wytworzeniu białka. RNA jest z natury niestabilną cząsteczką i szybko ulega degradacji.

Niestabilność RNA jest powodem, dla którego eksperci ds. zdrowia publicznego są zaniepokojeni logistyką dystrybucji szczepionek RNA.

Szczepionki Pfizer-BioNTech muszą być przechowywane w arktycznej temperaturze –70°C. Szczepionka Moderna pozostaje stabilna w standardowej zamrażarce w temperaturze –20°C przez okres do sześciu miesięcy, w lodówce (2–8°C) do 30 dni oraz w temperaturze pokojowej do 12 godzin.

Nasze DNA znajduje się w jądrze komórki otoczonym podwójną błoną. Pozwala mRNA opuścić jądro, ale blokuje im wejście do niego. Tak więc mRNA szczepionki nie może wejść do jądra, dopóki nie zostanie rozbite na mniejsze pojedyncze nukleotydy, które są nieszkodliwe. Nawet jeśli mógłby dostać się do jądra, DNA ma mechanizmy ochronne, które mogą sobie z tym poradzić. Tak więc mRNA szczepionki nie może zepsuć naszego DNA.

Jeśli już, zastosowanie mRNA jest bezpieczniejsze niż dostarczanie całego wirusa lub DNA, ponieważ mRNA nie jest zakaźne i nie może zostać zintegrowane z genomem gospodarza.

Szczepionki DNA muszą dotrzeć do jądra w celu odszyfrowania, podczas gdy mRNA jest przetwarzane bezpośrednio w cytoplazmie.

Testy szczepionek trwają dopiero dziewięć miesięcy i dlatego nie mamy długoterminowych danych dotyczących bezpieczeństwa szczepionek. Szczepionki mRNA mogą powodować krótkotrwałe skutki uboczne, w tym ból w miejscu wstrzyknięcia, gorączkę, bóle mięśni, bóle głowy i zmęczenie. Na krótką metę nie ma sygnałów bezpieczeństwa.

Po dopuszczeniu do stosowania szczepionki Pfizer-BioNTech w Wielkiej Brytanii i oczekującej autoryzacji do stosowania w sytuacjach awaryjnych (EUA) w USA, umożliwi to nadzór po wprowadzeniu do obrotu i nadzór nad bezpieczeństwem farmakoterapii w celu oceny skuteczności szczepionki w rzeczywistych doświadczeniach i wyglądzie. na rzadkie i poważne działania niepożądane po szczepieniach (AEFI).

Istnieje niewielkie prawdopodobieństwo, że białko S może wywołać pewną krzyżową reaktywność immunologiczną, która prowadzi do zaburzenia autoimmunologicznego, ale jak dotąd nie ma czerwonych flag.

Podobnie nie mamy również żadnych długoterminowych danych dotyczących skuteczności szczepionki.Czy odpowiedź immunologiczna słabnie z czasem? Jaki jest czas ochrony, kilka miesięcy czy kilka lat?

W badania Pfizer-BioNTech lub dwa tygodnie po dwukrotnym, 28-dniowym schemacie ze szczepionką Moderna.

Badanie Pfizer-BioNTech z udziałem ponad 43 000 ochotników potwierdziło 170 przypadków Covid-19, z których 162 wystąpiło wśród osób, którym podano placebo i skuteczność szczepionki na poziomie 95%.

W badaniu Moderna-NIH zarejestrowano 196 przypadków Covid-19, z których 185 pojawiło się w grupie placebo, co daje punktową ocenę skuteczności szczepionki na poziomie 94%.

Badania fazy 3 zostały zaprojektowane przede wszystkim w celu rozważenia choroby objawowej. Nadal nie wiemy, czy szczepionki zapobiegną przenoszeniu wirusa, czy też po prostu zapobiegną zachorowaniu ludzi po zakażeniu.

Mam nadzieję, że szczepionki będą miały jakiś wpływ na przenoszenie. Jeśli cząsteczki wydychane przez bezobjawowe lub przedobjawowe przypadki podczas mówienia i oddychania przenoszą koronawirusa, to szczepionka, która łagodzi objawy, również by to zredukowała.

Lub szczepionka, zmniejszając miano wirusa w górnych drogach oddechowych, zmniejsza również ilość, jaką mogą przenosić. Jeszcze lepiej jak szczepionki skoniugowane (pneumokokowe i meningokokowe), nadając błonie śluzowej odporność, sterylizuje górne drogi oddechowe i zapobiega ich emisji do przestrzeni powietrznej i ogranicza rozprzestrzenianie się koronawirusa.

Jak dotąd tylko naukowcy z Oksfordu, używający wektora wirusowego szczepionek AstraZeneca, sugerowali, że testy wykazały, że zaszczepiona grupa w Wielkiej Brytanii miała mniej bezobjawowych infekcji, co oznacza, że ​​będą mniej skłonni do nieświadomego rozprzestrzeniania choroby.


Obejrzyj wideo: Вирусы: виды, устройство и способы заражения клетки (Może 2022).


Uwagi:

  1. Thornton

    Nawet jeśli

  2. Teshicage

    To nie do zniesienia.

  3. Alston

    This phrase is simply incomparable;)

  4. Drummond

    You did not try to look in google.com?

  5. Fraynee

    Dołączam się. Wszystko powyżej powiedziało prawdę. Na ten temat możemy się porozumieć.

  6. Glynn

    To prawda, dobry pomysł



Napisać wiadomość