Informacja

22.4: Płytki z agarem z krwią (BAP) — biologia

22.4: Płytki z agarem z krwią (BAP) — biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wstęp

Agar z krwią jest ważnym podłożem klinicznym. (1)

Istnieją dwa rodzaje hemolizy. Hemoliza alfa (α) jest spowodowana uszkodzeniem (ale nie lizą) krwinek czerwonych we krwi; podłoże jest przezroczyste z zielonkawym odcieniem wokół kolonii (1). Hemoliza beta (β) to liza krwinek czerwonych, a podłoże wokół kolonii jest całkowicie przezroczyste.

Bakterie niehemolityczne (często nazywane hemolizą gamma, γ) nie wykazują żadnej lizy ani klarowania.

(Niedostępne podczas nieznanych)

Materiały

  • Rękawiczki
  • 1 płytka agarowa z krwią (BAP)/grupa
  • Lactococcus lactis
  • Staphylococcus aureus (Jeden skos na stół znajduje się na przednim stole)
  • Staphylococcus epidermidis

Procedury

  1. Oznacz płytki i „podziel” na 3 ćwiartki, oznaczając każdy kwadrant nazwą jednego z 3 organizmów.
  2. Zaszczepić 3 drobnoustroje na BAP i nakłuć inokulację ezą wzdłuż linii smug.

Hemoliza alfa (α) (Lactococcus lactis)

Hemoliza beta (β) (Staphylococcus aureus)

Gamma (γ) Hemoliza (Staphylococcus epidermidis)

Bezpieczeństwo

Staphylococcus aureus jest organizmem BSL2. Nosić rękawice podczas obsługi.

Wyniki

Zapisz swoje obserwacje.

Bakteria

Wzór hemolizy

Opis

Wniosek

  • Własnymi słowami wyjaśnij mechanizm działania podłoża Blood Agar (jak to działa) i dlaczego uważasz, że jest to dobre podłoże wzrostowe dla wybrednych bakterii.

Płytki z agarem z krwią

Agary z krwią poprawiają wzrost wybrednych (wybrednych) drobnoustrojów i determinują reakcje hemolityczne. Te agary powinny być używane tylko na poziomie uczelni i uniwersytetu.

Jeśli twój eksperyment wymaga agaru z krwią, zastąp ten sam rodzaj agaru bez krwi. Ta substytucja pomaga zapewnić bezpieczeństwo w laboratorium i zmniejsza ryzyko wybrednego wzrostu patogenów.


Co może rosnąć na płytce z agarem odżywczym?

Bakteria

Każda wyraźna kolista kolonia powinna reprezentować pojedynczą komórkę lub grupę bakterii, która wielokrotnie się dzieliła. Utrzymywane w jednym miejscu, powstałe komórki nagromadziły się, tworząc widoczną plamę. Większość kolonii bakteryjnych ma kolor biały, kremowy lub żółty i ma dość okrągły kształt.

Bacillus subtilis(3)
Proteus vulgaris(4)
Staphylococcus aures(5)
Streptococcus pyogenes(6)

Drożdże

Drożdże, rodzaj grzybów (liczba mnoga od grzybów), można znaleźć w wielu miejscach, od natury po laboratoria badawcze, a nawet codzienne kuchnie do pieczenia. Kolonie drożdży na ogół wyglądają podobnie do kolonii bakterii. Niektóre gatunki, takie jak Kandyda, może rosnąć jako białe plamy o błyszczącej powierzchni.

Candida albicans) to rodzaj drożdży, które mogą rosnąć na powierzchni skóry(7)
Okrągłe kolonie drożdżowe(8)
Różowe kolonie drożdży(9)

Formy

Pleśnie są w rzeczywistości grzybami i często wydają się białawo szare, z rozmytymi krawędziami. Zwykle przybierają inny kolor, od środka na zewnątrz. Poniżej przedstawiono dwa przykłady form:

Zielona pleśń (Trichoderma harzianum)(10)
Czarna pleśń (Aspergillus nidulaus)(11)

Inne grzyby

Zielone kolonie mchu, biała chmura lub pierścień zarodników można przypisać wzrostowi Aspergillus, co jest powszechne w takich infekcjach grzybiczych, jak grzybica stóp. Oto przykład tego, co Aspergillus wygląda jak:


Mikrobiologia - 010 - Hemoliza

Niektóre bakterie są w stanie rozkładać komórki krwi w procesie zwanym hemolizą. Aby przetestować aktywność hemolityczną w szczepie bakterii, wystarczy zaszczepić płytkę agarową z krwią czystą kulturą interesującego szczepu. Płytki z agarem z krwią zawierają krew ssaków jako źródło składników odżywczych, ale pozwala to również obserwować interakcje bakterii z krwią. Zwróć uwagę, że niezaszczepiona płytka agarowa z krwią jest czerwona i nieprzezroczysta. Po inkubacji zaszczepionej płytki agarowej z krwią, obserwować pożywkę wokół rosnących na niej bakterii. Poszukaj zmian w nieprzezroczystym, czerwonym kolorze. Jeśli obszar wokół bakterii stanie się przezroczysty, szczep ten wykazuje całkowitą hemolizę, znaną również jako hemoliza beta. Taki szczep nazwano by beta-hemolitycznym. Zwróć uwagę, że agar jest całkowicie przezroczysty, pokazując obiekty za płytką. Jeśli środowisko wokół bakterii zmieni kolor na ciemnozielony, ale nie stanie się przezroczysty, bakterie wykazują niepełną hemolizę lub hemolizę alfa. Te bakterie są alfa-hemolityczne. Zauważ, że podłoże jest odbarwione, ale nie widać obiektów za płytką z agarem z krwią. Uważa się, że bakterie, które rosną na agarze z krwią, ale w ogóle nie zmieniają wyglądu podłoża, wykazują hemolizę gamma i są nazywane bakteriami hemolitycznymi gamma. Wiedza o tym, do jakiego rodzaju hemolizy jest zdolny szczep bakteryjny, może być pomocna w identyfikacji kilku rodzajów bakterii, zwłaszcza organizmów izolowanych z tkanki ludzkiej, takich jak gatunki Streptococcus i Staphylococcus.

Niektóre bakterie są w stanie rozkładać komórki krwi w procesie zwanym hemolizą. Wiedza o tym, do jakiego rodzaju hemolizy jest zdolny szczep bakteryjny, może być pomocna w identyfikacji kilku rodzajów bakterii, zwłaszcza organizmów izolowanych z tkanki ludzkiej, takich jak Paciorkowiec oraz Staphylococcus gatunek.


8 wskazówek, jak wylewać idealne płytki agarowe za każdym razem

1. Użyj przepisu

Przygotować podłoże zgodnie z przepisem, następnie dodać żądaną ilość agaru (zwykle około 1% w/v) i wymieszać. Jeśli autoklawujesz bez mieszania, z agarozą nadal unoszącą się na wierzchu płynu, otrzymasz ciasto agarozowe w podłożu. Interesujące, ale bezużyteczne.

Przygotowując agar, użyj tylko 3/4 objętości butelki. Zapewnia to miejsce na unoszenie się bąbelków, gdy agar topi się w kuchence mikrofalowej (i oszczędza ci sprzątania przepełnionego agaru z kuchenki mikrofalowej!).

2. Autoklaw

Autoklawuj swoje podłoże przez 25 minut. Po autoklawowaniu możesz oczywiście przechowywać mieszankę średniej agaru w butelce ze szkła hartowanego, a następnie w razie potrzeby stopić ją w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej. Upewnij się, że używasz butelek ze szkła hartowanego, w przeciwnym razie może dojść do katastrofy (patrz #2).

3. Fajnie!

Schłodzić mieszankę średniej agaru do 55°C. Aby uzyskać rutynowo spójne wyniki, schładzaj przez kilka godzin w łaźni wodnej o temperaturze 55°C. Agar zaczyna krzepnąć w około 50°C. Korzystanie z kąpieli wodnej oznacza, że ​​można stale schładzać mieszaninę do temperatury nieco powyżej temperatury krzepnięcia.

Zanim skorzystałem z kąpieli wodnej, po prostu chłodziłem ją na powietrzu, ale nieuchronnie o tym zapominałem i wracałem, by stwierdzić, że krzepnięcie już się rozpoczęło – grudkowate płytki nie nadają się do rozsmarowywania!

4. Uzupełnij to

Możesz teraz dodać dowolne antybiotyki lub suplementy i mieć pewność, że agar ma odpowiednią temperaturę, ponieważ ochłodziłeś go w łaźni wodnej.

5. Wlej talerze

Jeśli używasz płytki o średnicy 100 mm, użyj około 30 mL mieszanki agar-pożywka na każdą płytkę. Im mniej mieszanki agar-pożywka na każdej płytce, tym łatwiej wyschną. 30 ml to dobra ilość do długotrwałego przechowywania, 10–20 ml jest w porządku, jeśli zamierzasz użyć płytek stosunkowo szybko.

Aby uzyskać spójność, polecam używanie pipety serologicznej. Zassać o 2–3 ml więcej niż potrzebujesz, aby zminimalizować wdmuchiwanie bąbelków na płytkę.

6. Niech się ustawi

Jeśli na talerzach pojawią się bąbelki, na krótko przesuń płomień, aby je roztrzaskać. Klasyczny błąd: próba przesunięcia płyt przed ich ustawieniem to po prostu proszenie o kłopoty. Po prostu zostaw je w spokoju (i może podziwiaj swoje idealne płytki agarowe podczas oczekiwania)!

7. Wyschnij

Suszyć płytki w komorze z przepływem laminarnym przy lekko zdjętej pokrywce przez 30 minut (lub w inkubatorze w 37°C przez 2-3 godziny lub w temperaturze pokojowej przez 2-3 dni). Suszenie płytki jest bardzo ważne dla przechowywania płytek i wzrostu na nich kolonii.

Jeśli nie wysuszysz płytek, wilgoć wyparuje i skondensuje się na pokrywce podczas przechowywania lub inkubacji, dając okropnie mokre płytki. W najgorszym przypadku wilgoć może wpłynąć na poszycie komórek. Użyj minutnika, aby przypomnieć Ci, kiedy minie 30 minut, ponieważ – z mojego doświadczenia – bardzo łatwo jest zapomnieć o talerzach i wrócić, aby zobaczyć, że talerze zamieniły się w chipsy/chipsy z agaru. Smaczny.

8. Użyj lub przechowaj

Kiedy już wylejesz swoje idealne płytki agarowe, możesz ich użyć natychmiast lub zapieczętować do późniejszego użycia. Możesz użyć Parafilmu lub włożyć je do torby, w której zostały dostarczone talerze, aby ułatwić przechowywanie. Przechowuj płytki w 4°C. Wytyczne sugerują użycie płytek agarowych w ciągu około 2 do 4 tygodni.

W zależności od dołączonych dodatków, okres przechowywania przygotowanych talerzy może być krótszy – upewnij się, że sprawdziłeś to przed rozpoczęciem, aby nie tracić czasu (i zasobów) na robienie zbyt wielu talerzy.

Szybkim sposobem na oznaczenie płytek jest posiadanie kodu koloru dla każdego antybiotyku i rodzaju podłoża, którego zwykle używasz (np. czerwony dla ampicyliny, czarny dla kanamycyny, zielony dla LB, niebieski dla M9). Ułóż płytki i użyj odpowiednio kolorowego markera laboratoryjnego, aby narysować linię wzdłuż całego stosu. Upewnij się jednak, że masz pod ręką kod koloru.

Teraz za każdym razem powinieneś mieć idealne płytki agarowe. Jeśli masz dalsze pomysły lub dodatki do tego protokołu, zostaw komentarz.

Pierwotnie opublikowana 5 lipca 2011 r. Zaktualizowana i zaktualizowana w lutym 2021 r.


Liczba dostępnych pożywek do hodowli bakterii jest znaczna. Niektóre podłoża są uważane za uniwersalne, uniwersalne i wspomagają wzrost wielu różnych organizmów. Doskonałym przykładem uniwersalnego medium jest bulion tryptozowo-sojowy (TSB). Specjalistyczne pożywki są używane do identyfikacji bakterii i są uzupełniane barwnikami, wskaźnikami pH lub antybiotykami. Jeden typ, wzbogacone media, zawiera czynniki wzrostu, witaminy i inne niezbędne składniki odżywcze wspomagające wzrost wybredne organizmy, organizmy, które nie mogą wytwarzać niektórych składników odżywczych i wymagają ich dodania do pożywki. Gdy znany jest pełny skład chemiczny medium, nazywa się to a pożywka zdefiniowana chemicznie. Na przykład w Średnia EZ, wszystkie poszczególne składniki chemiczne są identyfikowane i znane są dokładne ilości każdego z nich. w złożone media, które zawierają ekstrakty i hydrolizaty drożdży, mięsa lub roślin, dokładny skład chemiczny podłoża nie jest znany. Ilości poszczególnych składników są nieokreślone i zmienne. Bulion odżywczy, bulion trypsynowo-sojowy i napar mózgowo-sercowy, są przykładami złożonych mediów.

Rycina 1. Na tej płytce z agarem MacConkeya kolonie bakterii E. coli fermentujących laktozę są jasnoróżowe. Serratia marcescens, która nie fermentuje laktozy, tworzy kremową smugę na jasnobrązowym podłożu. (kredyt: Amerykańskie Towarzystwo Mikrobiologii)

Pożywki, które hamują wzrost niepożądanych mikroorganizmów i wspierają wzrost interesującego organizmu poprzez dostarczanie składników odżywczych i ograniczanie konkurencji, to tzw. selektywne media. Przykładem selektywnej pożywki jest Agar MacConkeya. Zawiera sole żółciowe i fiolet krystaliczny, które hamują wzrost wielu bakterie gram-dodatnie i sprzyjają wzrostowi bakterie gram-ujemne, szczególnie Enterobacteriaceae. Gatunki te są powszechnie nazywane jelitowymi, bytują w jelicie i są przystosowane do obecności soli żółciowych. ten wzbogacanie kultur sprzyjają preferencyjnemu wzrostowi pożądanego mikroorganizmu, który reprezentuje frakcję organizmów obecnych w inokulum. Na przykład, jeśli chcemy wyizolować bakterie rozkładające ropę naftową, bakterie węglowodoroklastyczne, sekwencyjna subkultura w pożywce, która dostarcza węgla tylko w postaci ropy naftowej, wzbogaci kultury w bakterie żywiące się ropą. ten media różnicowe ułatwiają odróżnienie kolonii różnych bakterii poprzez zmianę koloru kolonii lub koloru podłoża. Zmiany koloru są wynikiem produktów końcowych powstałych w wyniku interakcji enzymów bakteryjnych z różnymi substratami w pożywce lub, w przypadku reakcji hemolitycznych, lizy czerwonych krwinek w pożywce. Na rycinie 1, zróżnicowaną fermentację laktozy można zaobserwować na agarze MacConkeya. Fermentory laktozy wytwarzają kwas, który zmienia pożywkę i kolonie silnych fermentorów na gorący róż. Pożywkę uzupełnia wskaźnik pH o neutralnej czerwieni, która przy niskim pH zmienia się w gorący róż. Pożywki selektywne i różnicujące można łączyć i odgrywać ważną rolę w identyfikacji bakterii metodami biochemicznymi.

Pomyśl o tym

  • Rozróżnij złożone i chemicznie zdefiniowane media.
  • Rozróżnij media selektywne i wzbogacające.

Piknik Końcowy

Wydział mikrobiologii świętuje zakończenie roku szkolnego w maju, organizując tradycyjny piknik na zieleni. Przemówienia ciągną się przez kilka godzin, ale w końcu wszyscy wykładowcy i studenci mogą zagłębić się w jedzenie: sałatkę z kurczakiem, pomidory, cebulę, sałatkę i ciasto z kremem. Do wieczora cały wydział, z wyjątkiem dwóch studentów wegetarian, którzy nie jedli sałatki z kurczaka, dostają mdłości, wymiotów, wymiotów i skurczów brzucha. Kilka osób skarży się na biegunkę. Jeden pacjent wykazuje oznaki wstrząsu (niskie ciśnienie krwi). Od pacjentów pobierane są próbki krwi i kału oraz przeprowadzana jest analiza wszystkich pokarmów podawanych do posiłku.

Bakterie mogą powodować nieżyt żołądka i jelit (zapalenie żołądka i przewodu pokarmowego) albo przez kolonizację i replikację w gospodarzu, co jest uważane za infekcję, albo przez wydzielanie toksyn, co jest uważane za zatrucie. Oznaki i objawy infekcji są zwykle opóźnione, podczas gdy zatrucie pojawia się w ciągu kilku godzin, jak to miało miejsce po pikniku.

Próbki krwi od pacjentów nie wykazywały oznak infekcji bakteryjnej, co dodatkowo sugeruje, że był to przypadek zatrucia. Ponieważ zatrucie jest spowodowane wydzielanymi toksynami, bakterie zwykle nie są wykrywane w próbkach krwi lub kału. Agar MacConkeya i agar sorbitolowo-MacConkey talerze i deoksycholan ksylozy-lizyny (XLD) płytki zaszczepiono próbkami kału i nie ujawniły one żadnych kolonii o nietypowym zabarwieniu, a na XLD nie zaobserwowano czarnych ani białych kolonii. Wszystkie fermentory laktozy na agarze MacConkeya również fermentują sorbitol. Wyniki te wykluczyły powszechne czynniki chorób przenoszonych przez żywność: E coli, Salmonella spp. i Shigella spp.

Rysunek 2. Gram-dodatnie ziarniaki w skupiskach. (kredyt: Centra Kontroli i Zapobiegania Chorobom)

Analiza sałatki z kurczaka wykazała nieprawidłową liczbę gram-dodatnich ziarenkowców ułożonych w grona (ryc. 2). Kultura Gram-dodatnich ziarenkowców uwalnia bąbelki po zmieszaniu z nadtlenkiem wodoru. Kultura się zmieniła agar z solą mannitolu żółty po 24-godzinnej inkubacji.

Wszystkie testy wskazują na Staphylococcus aureus jako organizm wydzielający toksynę. Próbki z sałatki wykazały obecność Gram-dodatnich bakterii Cocci w gronach. Kolonie były pozytywne pod względem katalazy. Bakterie rosły na agarze z solą mannitolu, fermentując mannitol, na co wskazuje zmiana podłoża na żółtą. Wskaźnikiem pH w agarze z solą mannitolu jest czerwień fenolowa, która zmienia kolor na żółty po zakwaszeniu podłoża produktami fermentacji.

Toksyna wydzielana przez S. aureus wiadomo, że powoduje ciężkie zapalenie żołądka i jelit. Organizm został prawdopodobnie wprowadzony do sałatki podczas przygotowywania przez osobę zajmującą się jedzeniem i namnożony, podczas gdy sałatka była przechowywana w ciepłej temperaturze otoczenia podczas przemówień.

  • Jakie inne czynniki mogły przyczynić się do szybkiego wzrostu S. aureus w sałatce z kurczaka?
  • Dlaczego miałby S. aureus nie hamuje obecność soli w sałatce z kurczaka?

Kluczowe pojęcia i podsumowanie

  • Media zdefiniowane chemicznie zawierają tylko chemicznie znane składniki.
  • Selektywne media sprzyjać rozwojowi niektórych mikroorganizmów, jednocześnie hamując inne.
  • Wzbogacone media zawierają dodane niezbędne składniki odżywcze, których dany organizm potrzebuje do rozwoju
  • Media różnicowe pomagają odróżnić bakterie na podstawie koloru kolonii lub zmiany podłoża.

Wielokrotny wybór

Agar EMB to podłoże używane do identyfikacji i izolacji bakterii chorobotwórczych. Zawiera trawione białka mięsa jako źródło organicznych składników odżywczych. Dwa barwniki wskaźnikowe, eozyna i błękit metylenowy, hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich i umożliwiają rozróżnienie organizmów fermentujących laktozę i niefermentujących laktozę. Fermentatory laktozy tworzą kolonie metalicznie zielone lub ciemnofioletowe, podczas gdy fermentory nielaktozowe tworzą kolonie całkowicie bezbarwne. Agar EMB jest przykładem którego z poniższych?

  1. tylko selektywne podłoże
  2. tylko medium różnicowe
  3. pożywka selektywna i pożywka zdefiniowana chemicznie
  4. pożywka selektywna, pożywka różnicująca i pożywka złożona

Haemophilus influenzae muszą być hodowane na agarze czekoladowym, który jest agarem z krwią poddanym działaniu wysokiej temperatury w celu uwolnienia czynników wzrostu z podłoża. H. grypy jest opisany jako ________.

Wypełnij puste miejsce

Agar z krwią zawiera wiele nieokreślonych składników odżywczych, wspomaga wzrost dużej liczby bakterii oraz umożliwia różnicowanie bakterii w zależności od hemolizy (rozpad krwi). Medium to ________ i ________.

Agar Rogosa zawiera ekstrakt drożdżowy. pH jest dostosowane do 5,2 i zniechęca do rozwoju wielu mikroorganizmów, jednak wszystkie kolonie wyglądają podobnie. Medium to ________ i ________.

Pomyśl o tym

Jaka jest główna różnica między kulturą wzbogacania a kulturą selektywną?

Krytyczne myślenie

Haemophilus, grypa najlepiej rośnie w temperaturze 35–37 °C z

5% CO2 (lub w świeczniku) i wymaga heminy (czynnik X) i dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD, znanego również jako czynnik V) do wzrostu. [1] Używając słownictwa poznanego w tym rozdziale, opisz H. grypy.


Aby dowiedzieć się, czy doszło do hemolizy, należy wykonać izolację na płytce agarowej z krwią. Pożywka jest inkubowana przez noc i będzie sprawdzana pod kątem jakichkolwiek oznak hemolizy.

Jeżeli kolor podłoża zmienia się, co charakteryzuje się ciemnym lub przebarwionym podłożem, oznacza to, że organizm przeszedł hemolizę alfa. Z drugiej strony hemoliza jest beta-hemolityczna, jeśli podłoże jest oczyszczane podczas wzrostu. Jeśli kolor podłoża nie uległ zmianie, oznacza to, że podłoże stanowi hemolizę gamma. (8, 9 i 10)


Identyfikacja nieznanych gronkowców, paciorkowców lub jelit

To laboratorium powinno dostarczyć podstawowych informacji i technik potrzebnych do pomyślnego wykonywania testów biochemicznych w celu identyfikacji nieznanych próbek bakterii. Strona internetowa mikrolaboratorium, Twój podręcznik, strona internetowa i różne książki dostępne w laboratorium będą materiałami referencyjnymi niezbędnymi do pomyślnego ukończenia kolejnych kilku tygodni pracy w laboratorium.

  • Każda para otrzyma do identyfikacji jeden nieznany organizm. Przeprowadzisz testy odpowiednie dla Twojego organizmu, aby określić rodzaj i identyfikację gatunku.
  • Każda para może być zmuszona do przedstawienia informacji na temat określonego organizmu, który zidentyfikowała, w tym: wyników badań, w przypadku gdy organizm jest częścią normalnej flory, kiedy i gdzie ten organizm staje się patogenem, możliwych chorób wywoływanych przez organizm.
  • W przypadku każdego wykonywanego testu biochemicznego należy zanotować w zeszycie laboratoryjnym następujące informacje:
    • Jak wygląda pozytywny wynik testu?
    • Jaka jest podstawa biochemiczna testu?

    Przepływ pracy

    Staph

    Gatunki Staphylococcus to normalna flora rozprzestrzeniona na powierzchni ciała. Są również ważnymi patogenami. Niektóre z najczęstszych chorób wywoływanych przez gatunki Staphylococcus to: liszajec, zespół wstrząsu toksycznego, bakteriemia, zapalenie wsierdzia, czyraki mieszków włosowych (czyraki) i zapalenie kości i szpiku (ropnie kości). Wiele gatunków gronkowców ma zdolność tworzenia biofilmów, które mogą następnie kolonizować struktury, takie jak cewniki medyczne, stenty, zastawki serca, protezy, zastawki i zastawki.

    Gatunki o znaczeniu klinicznym są zazwyczaj podzielone na gronkowce koagulazo-dodatnie (S. aureus) i koagulazo-ujemne (CoNS) (S. epidermidis, S. haemolyticus i S. saprophyticus).

    Streps

    Wielu przedstawicieli rodzaju Streptococcus to normalna flora jamy ustnej, nosa i gardła. Rodzaj Streptococcus to złożona grupa wywołująca szeroki zakres chorób, takich jak: gorączka reumatyczna, liszajec, zapalenie gardła, zapalenie krtani, zespół wstrząsu toksycznego, szkarlatynę i zapalenie wsierdzia.
    Paciorkowce są często klasyfikowane na podstawie hemolizy, co można zobaczyć na podstawie ich reakcji na agarze z krwią. Gatunki alfa-hemolizujące wytwarzają alfa-hemolizynę, która redukuje hemoglobinę (czerwoną) do methemoglobiny (zielona), powodując brązowawą lub zielonkawą strefę wokół kolonii. Gatunki beta-hemolizujące wytwarzają hemolizynę, która tworzy czystą strefę wokół kolonii, co wskazuje na całkowitą lizę czerwonych krwinek. Gatunki hemolityczne gamma nie są hemolityczne, nie mają widocznego wpływu na czerwone krwinki.

    Dojelitowe

    Bakterie Gram-ujemne są ważne zarówno jako naturalna flora w przewodzie pokarmowym, jak i jako patogeny chorób przewodu pokarmowego i innych miejsc. Gram-ujemne bakterie jelitowe obejmują cztery główne rodziny z licznymi rodzajami i gatunkami: Enterobacteriacea, Pseuodmonadaceae, Vibrionaceae i Camplyobacteraceae. Będziesz pracować tylko z organizmami z dwóch pierwszych rodzin.

    Procedura laboratoryjna

    Poniżej zamieściliśmy podstawową procedurę wykonywania wielu typowych testów biochemicznych. Na kolejnych stronach znajdziesz bardziej szczegółowe procedury dla konkretnych testów biochemicznych. Więcej informacji na temat selektywnych i różnicowych mediów można uzyskać, zapoznając się z instrukcjami Difco w laboratorium. Będziesz musiał sprawdzić poszczególne testy, aby uzyskać bardziej szczegółowy opis, w tym biochemiczną podstawę każdego testu.

    Testy biochemiczne na organizmy gronkowca

    Tabela 1: Krótki opis testów biochemicznych dla mikroorganizmów Staphylococcus.

    Test Krótkie instrukcje Prawdopodobne wyniki
    TSA Ogólne nośniki konserwacyjne dla Staphs Określ makromorfologię
    Bejca Grama Aby potwierdzić czystość kultury Gronkowce i paciorkowce są Gram-dodatnie Dojelitowe są Gram-ujemne
    McFarland
    Standard
    Rozcieńcz organizm w probówce ze sterylną wodą, aby uzyskać zmętnienie odpowiadające standardowi testu 0,5 McFarlanda. Przytrzymaj rozcieńczoną probówkę i standard testowy 0,5 McFarland na karcie referencyjnej McFarland z czarną linią, aby dokładnie ocenić zmętnienie.
    Koagulaza Dodaj pełną ezę lub 0,5 ml czystej kultury do 0,5 ml osocza królika. Delikatnie obracaj probówkę, aby wymieszać, nie wstrząsaj. Inkubować przez 24 godziny w 37°C. Obecność skrzepu wskazuje S. aureus
    Wrażliwość krążka na antybiotyk Novobiocin Rozcieńczyć kolonie z czystej kultury w sterylnej soli fizjologicznej do standardu 0,5 McFarland. Wacikiem połowę powierzchni płytki agarowej z krwią. Lekko połóż krążek z nowobiocyną na powierzchni. Inkubować przez 24 godziny w 37°C. Strefa zahamowania wzrostu o średnicy ≤16 mm w gronkowcu koagulazy(-) wskazuje na S. saprofit. Zobacz prawdopodobne wyniki w tabeli 2 poniżej.
    Hemoliza Posmaruj drugą połowę płytki agarowej z krwią, aby sprawdzić hemolizę. Dźgnij w powierzchnię agaru w ostatniej części swojej smugi. Inkubuj 24 godziny w O2. Hemoliza beta wskazuje na S. aureus. Zobacz prawdopodobne wyniki w tabeli 2 poniżej.

    Tabela 2: Prawdopodobne wyniki dla mikroorganizmów Staphylococcus

    Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus xylosus
    Makromorfologia Kremowy/Opalacz Średni Kremowy/Opalenizna Pinpoint Biały Mały Kremowy/Opalany Falisty Margines Żółty/Pomarańczowy Średni
    FTM Beztlenowce fakultatywne Beztlenowce fakultatywne Beztlenowce fakultatywne Beztlenowce fakultatywne Beztlenowce fakultatywne
    Poruszanie się Nieruchliwy Nieruchliwy Nieruchliwy Nieruchliwy Nieruchliwy
    Katalaza Pozytywny Pozytywny Pozytywny Pozytywny Pozytywny
    Oksydaza Negatywny Negatywny Negatywny Negatywny Negatywny
    Koagulaza Pozytywny Negatywny Negatywny Negatywny Negatywny
    Nowobiocyna Podatny Podatny Podatny Odporny Odporny
    Hemoliza Hemoliza alfa Prime lub beta Hemoliza alfa lub alfa Prime Hemoliza alfa Prime lub beta Hemoliza alfa Hemoliza alfa

    Hemoliza - Agar z krwią

    Przeznaczenie

    Agar z krwią służy do wspomagania wzrostu wybrednych organizmów i określania rodzaju hemolizy (zniszczenia ścian krwinek czerwonych) wytwarzanej przez organizm.

    Zasada

    Agar z krwią jest bogatym podłożem uzupełnionym 5-10% świeżą krwią. Odpowiedź hemolityczna może zależeć od rodzaju krwi. Powszechnie używa się krwi owczej, ale niektóre organizmy wymagają krwi króliczej lub bydlęcej.

    Procedura testowa

    1. Posmaruj płytkę agarem z krwią w celu izolacji.
      • Opcjonalnie: zrób ostatnią smugę igłą i wbij do agaru. Daje to zwykle wyraźne, niezawodne strefy hemolizy beta i jest szczególnie ważne, aby zobaczyć działanie streptolizyny O, która jest niestabilna w obecności tlenu. Patrz strona 84 podręcznika Difco/BBL.
    2. Inkubować płytki w 37°C przez 24-48 godzin. Organizmy Strep powinny być inkubowane w CO2 inkubator.
      • Po 48 godzinach płytka przybierze brązowo-czerwony kolor.

    Wyniki

    Na podstawie wyglądu agaru można rozróżnić cztery rodzaje hemolizy.

    • Hemoliza beta jest wskazany przez przezroczystą bezbarwną strefę otaczającą kolonie. Nastąpiła całkowita liza krwinek czerwonych.
    • hemoliza alfa jest wskazywany przez niewielką strefę od zielonkawego do brązowawego przebarwienia podłoża. Jest to spowodowane redukcją hemoglobiny do methemoglobiny, a następnie jej dyfuzją do otaczającego środowiska.
    • hemoliza alfa prime jest oznaczony strefą całkowitej hemolizy, otoczoną strefą częściowej hemolizy, różową aureolą. Ten wzór może być łatwiejszy do zauważenia, jeśli zeskrobujesz kolonię.
    • Hemoliza gamma wskazuje na brak zmian w mediach.

    Ograniczenia

    • Wzorce hemolizy mogą się różnić w zależności od atmosfery inkubacji i rodzaju krwi w pożywce.
    • Niektóre drobnoustroje Staph wykazują hemolizę dopiero po umieszczeniu w lodówce po inkubacji.

    Test koagulazy

    Przeznaczenie

    Różnicuje Staphylococcus aureus z innych gatunków Staphylococcus.

    Zasada

    Test na koagulazę wykrywa obecność wolnej i związanej gronkoagulazy. Enzym ten jest wydalany pozakomórkowo przez ludzkie szczepy Staph. aureus. Mechanizm działania jest nieznany.

    Procedura testowa

    1. Rozmrozić probówkę z 0,5 ml osocza króliczego.
    2. Zaszczepić ezę pełną organizmu do probówki. Wybierz dobrze odizolowaną kolonię.
    3. Najlepiej inkubować probówkę w temperaturze 35°C przez 4 godziny, sprawdzając co 30 minut pod kątem tworzenia się skrzepu. Inkubujemy je przez noc i wkładamy do lodówki do następnego okresu laboratoryjnego z porównywalnymi wynikami.
    4. Sprawdź, czy nie tworzą się skrzepy.
    5. Wyrzucić rurkę do pojemnika na zagrożenie biologiczne.

    Wyniki

    Za wynik pozytywny uważa się powstanie skrzepu na dnie probówki. Skrzep nie poruszy się podczas przechylania rurki. W probówce popłynie nieskrzepnięta osocze.

    Ograniczenia

    • Odporny na metycylinę Staph. aureus mają zmniejszony współczynnik zbrylania.
    • Nie wstrząsać ani nie wstrząsać probówką, ponieważ może to spowodować rozbicie skrzepu.
    • Niektóre szczepy gronkowców wytwarzają fibrolizynę po dłuższej inkubacji w temperaturze 35°C, która może rozbić skrzep, dając wynik fałszywie ujemny. Inkubuj probówkę przez noc w temperaturze pokojowej, jeśli w ciągu 4 godzin nie pojawi się skrzep.
    • Niektóre inne rzadko spotykane gatunki gronkowców są również koagulazo-dodatnie metodą probówkową.

    Testy biochemiczne dla mikroorganizmów Streptococcus

    Tabela 3: Krótki opis testów biochemicznych dla mikroorganizmów Streptococcus.

    Test Instrukcja obsługi Prawdopodobne wyniki
    BH Ogólne środki konserwacyjne dla paciorkowców Określ makromorfologię
    Bejca Grama Aby potwierdzić czystość kultury Gronkowce i paciorkowce są Gram-dodatnie Dojelitowe są Gram-ujemne
    Standard McFarland Rozcieńcz organizm w probówce ze sterylną wodą, aby uzyskać zmętnienie odpowiadające standardowi testu 0,5 McFarlanda. Przyłóż rozcieńczoną probówkę i standard testowy 0,5 McFarland do karty referencyjnej McFarland z czarną linią, aby dokładnie ocenić zmętnienie.
    Optochina
    Bacytracyna
    SXT
    Użyj swojego standardu 0,5 McFarlanda, aby wymazać połowę powierzchni płytki agarowej z krwią. Równomiernie umieść po jednym z każdego krążka na wymazanej powierzchni agaru. Każda strefa zahamowania wzrostu wokół krążka Bacytracyny wskazuje na S. pyogenes. Zobacz prawdopodobne wyniki w tabeli 4 poniżej.
    Hemoliza Posmaruj drugą połowę płytki, aby sprawdzić hemolizę. Dźgnij w powierzchnię agaru w ostatniej części swojej smugi. Inkubuj przez 24 godziny w CO2. Hemoliza beta wskazuje (czasami) na S. pyogenes i S. agalactiae. Zobacz prawdopodobne wyniki w tabeli 4 poniżej.
    Tolerancja na sól Lekko zaszczepić bulion. Luźno zakręcić i inkubować przez 24-48 godzin w CO2. Zmiana koloru żółtego wskazująca na Enterococcus faecalis. Zobacz prawdopodobne wyniki w tabeli 4 poniżej.
    Eskulina z żółcią Smugaj powierzchnię skosu. Zostaw nakrętkę luźną. Inkubuj przez 24-48 godzin w CO2. Czernienie agaru wskazuje na S. bovis oraz S. faecalis. Zobacz prawdopodobne wyniki w tabeli 4 poniżej.

    Tabela 4: Prawdopodobne wyniki dla mikroorganizmów Streptococcus

    Streptococcus agalactiae Streptococcus bovis Streptococcus faecalis Streptococcus mutans Streptococcus pyogenes
    Makromorfologia Średni Sprecyzować Średni Sprecyzować Mały
    FTM Beztlenowce fakultatywne Beztlenowce fakultatywne Beztlenowce fakultatywne Beztlenowce fakultatywne Beztlenowce fakultatywne
    Poruszanie się Nieruchliwy Nieruchliwy Nieruchliwy Nieruchliwy Nieruchliwy
    Katalaza Negatywny Negatywny Negatywny Negatywny Negatywny
    Oksydaza Negatywny Negatywny Negatywny Negatywny Negatywny
    Optochina Odporny Odporny Zmienny Odporny Odporny
    Bacytracyna Zmienny Odporny Odporny Odporny Podatny
    SXT Odporny Zmienny Zmienny Zmienny Odporny
    Hemoliza Hemoliza gamma Hemoliza alfa Hemoliza alfa Hemoliza gamma Hemoliza beta
    Tolerancja na sól Zmienny Negatywny Pozytywny Negatywny Negatywny
    Eskulina z żółcią Negatywny Zmienny Pozytywny Pozytywny Negatywny

    Wrażliwość na bacytracynę/SXT

    Przeznaczenie

    Krążki różnicujące Bacytracynę stosuje się do przypuszczalnej identyfikacji paciorkowców beta-hemolizujących grupy A od innych paciorkowców beta-hemolizujących. Połączenie czułości SXT zwiększa dokładność wyników.

    Zasada

    Bacytracyna jest antybiotykiem wyizolowanym z Bacillus subtilis. Hamuje syntezę ściany komórkowej głównie poprzez hamowanie biosyntezy peptydoglikanu. SXT hamuje metabolizm folianów, co zaburza syntezę DNA bakterii. Paciorkowce beta-hemolizujące z grupy A są bardziej wrażliwe na bacytracynę niż inne paciorkowce beta-hemolizujące.

    Procedura testowa

    Standardowy protokół został zmodyfikowany dla naszego laboratorium.

    1. Używając ezy, wybrać 3-4 dobrze wyizolowane kolonie, najlepiej z 18-24 godzinnej hodowli. Przenieść do niewielkiej ilości sterylnej wody.
      • Dostosuj zmętnienie do normy 0,5 McFarlanda.
    2. Użyj procedury opisanej w testowaniu wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, aby wymazać całą płytkę w celu uzyskania zlewnego wzrostu.
    3. Wizualnie podzielić płytkę na trzy części, umieścić bacytracynę i SXT w ich części płytki. Używając sterylnych kleszczyków lub wacika, lekko, ale mocno dociśnij krążki do powierzchni agaru, aby je przykleić.
      • Zapisz drugą sekcję dla dysku optochin.
    4. Odwróć płytki i inkubuj je przez 18-24 godziny w 35°C w 5-10% CO2.
    5. Inkubować kolejne 24 godziny, jeśli wyniki są negatywne.

    Wyniki

    • Każda strefa zahamowania wokół dysku jest uważana za wrażliwą (S).
    • Żadna strefa zahamowania wzrostu do krążka nie jest uważana za oporność (R).

    Ta tabela pochodzi z MacFaddin, Biochemiczne testy do identyfikacji bakterii medycznych.

    Bacytracyna SXT Domniemany identyfikator
    S r Grupa A b-paciorkowce
    r r B-paciorkowce grupy B
    r S Nie B-paciorkowce z grupy A lub B
    S S Wyklucz grupę A lub B z testami serologicznymi

    Ograniczenia

    • Należy badać wyłącznie paciorkowce beta-hemolizujące.
    • Chociaż ten test jest dokładny, nie jest wysoce specyficzny. Do dokładnej identyfikacji wymagane są inne testy biochemiczne lub serologiczne.
    • Wzrost powinien być zlewny. Zbyt słaby wzrost może spowodować, że niektóre paciorkowce spoza grupy A będą wydawały się wrażliwe na bacytracynę.

    Hemoliza - Agar z krwią

    Przeznaczenie

    Agar z krwią służy do wspomagania wzrostu wybrednych organizmów i określania rodzaju hemolizy (zniszczenia ścian krwinek czerwonych) wytwarzanej przez organizm.

    Zasada

    Agar z krwią jest bogatym podłożem uzupełnionym 5-10% świeżą krwią. Odpowiedź hemolityczna może zależeć od rodzaju krwi. Powszechnie używa się krwi owczej, ale niektóre organizmy wymagają krwi króliczej lub bydlęcej.

    Procedura testowa

    1. Posmaruj płytkę agarem z krwią w celu izolacji.
      • Opcjonalnie: zrób ostatnią smugę igłą i wbij do agaru. Daje to zwykle wyraźne, niezawodne strefy hemolizy beta i jest szczególnie ważne, aby zobaczyć działanie streptolizyny O, która jest nietrwała w obecności tlenu. Patrz strona 84 podręcznika Difco/BBL.
    2. Inkubować płytki w 37°C przez 24-48 godzin. Organizmy Strep powinny być inkubowane w CO2 inkubator.
      • Po 48 godzinach płytka przybierze brązowo-czerwony kolor.

    Wyniki

    Na podstawie wyglądu agaru można rozróżnić cztery rodzaje hemolizy.

    • Hemoliza beta jest wskazany przez przezroczystą bezbarwną strefę otaczającą kolonie. Nastąpiła całkowita liza krwinek czerwonych.
    • hemoliza alfa jest wskazywany przez niewielką strefę od zielonkawego do brązowawego przebarwienia podłoża. Jest to spowodowane redukcją hemoglobiny do methemoglobiny, a następnie jej dyfuzją do otaczającego środowiska.
    • Alpha prime hemolysis is indicated by a zone of complete hemolysis, surrounded by a zone of partial hemolysis, a pink halo. This pattern can be easier to see if you scrape off the colony.
    • Gamma hemolysis is indicated by no change in the media.

    Ograniczenia

    • The patterns of hemolysis can vary with the incubation atmosphere and the type of blood in the media.
    • Some Staph organisms will only show hemolysis after they have been refrigerated following incubation.

    Salt Tolerance Broth

    Intended Use

    Salt tolerance broth is intended to differentiate non-beta-hemolytic strains of streptococci.

    Principle of Use

    Brain Heart Infusion (BHI) broth is supplemented with 6.5% sodium chloride and bromcresol purple as a pH indicator. The indicator is included to make reading the test results easier. The broth also includes dextrose. The fermentation of dextrose (glucose) results in the production of acid. This changes the pH of the media causing the media to turn from purple to yellow.

    Test Procedure

    1. Select no more than 2-3 colonies (preferably from an overnight culture) to inoculate a tube of salt tolerance broth.
      • It is important to lightly inoculate the tube otherwise you may get a false positive.
    2. Loosen the cap and incubate aerobically for 24 hours at 37°C.
    3. Continue incubation up to 72 hours if you get a negative result at 24 hours.

    Wyniki

    A positive reaction is indicated by obvious turbidity in the media with or without a color change. A negative result is indicated by no growth after 72 hours. Enterokoki spp. typically changes the media color within 24 hours.

    Ograniczenia

    • Many staphylococci can grow in media containing 10% salt. Mannitol salt agar has 7.5% salt.
    • Salt tolerance media was intended to differentiate catalase negative gram-positive cocci. Be sure to perform a catalase test before you proceed with the salt tolerance broth test.
    • Other species of catalase negative gram-positive organisms can grow in this media.

    Biochemical Tests for Enteric Organisms

    Table 5: Brief Description of Biochemical Tests for Enteric Organisms.

    Test Brief Instructions Probable Results
    TSA General Maintenance Media for Staphs Determine macromorphology
    Gram Stain To confirm culture purity Staphs are Gram positive
    McFarland Standard Dilute your organism in a tube of sterile water to obtain a turbidity equivalent to a 0.5 McFarland test standard. Hold your diluted tube and the 0.5 McFarland test standard against the black-lined McFarland reference card to accurately rate the turbidity.
    Prochowiec Streak for isolation. Incubate 24-48 hrs at 37°C. See probable results table below.
    EMB Streak for isolation. Incubate 24-48 hrs at 37°C. See probable results table below.
    Citrate Streak surface only. Incubate loosely-capped 24-48hrs at 37°C. See probable results table below.
    TSI With a needle pick the center of a well isolated colony. Stab the center of the tube to within 3-5 mm of the bottom. Withdraw the needle and lightly streak the surface of the slant. Incubate for 24 hrs at 37°C. See probable results table below.
    Mocznik Heavily inoculate a tube of urea broth. Shake tube to distribute organisms. Incubate for 24-48 hrs at 37°C.
    Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhimurium Shigella flexneri
    Macromorphology Creamy/Tan Medium Mucoid/Tan Medium Translucent Diffusible Translucent Diffusible Creamy/Tan Medium Creamy/Tan Medium
    FTM Facultative Anaerobe Facultative Anaerobe Facultative Anaerobe Strict Aerobe Facultative Anaerobe Facultative Anaerobe
    Motility Motile Non Motile Motile Motile Motile Non Motile
    Katalaza Pozytywny Pozytywny Pozytywny Pozytywny Pozytywny Pozytywny
    Oxidase Negatywny Negatywny Negatywny Pozytywny Negatywny Negatywny
    Prochowiec Pink/Purple w/ precipitate Purple/Yellow w/ precipitate Colorless Yellow Media Colorless Yellow Media Colorless Yellow Media Colorless Yellow Media
    EMB Black w/Green Metallic Sheen Purple maybe Green Metallic Sheen Colorless or Pink Colorless or Pink Colorless or Pink Colorless or Pink
    Citrate Negatywny Zmienny Negatywny Pozytywny Pozytywny Negatywny
    TSI Yellow Slant
    Yellow Butt Gas
    Yellow Slant
    Yellow Butt Gas
    Yellow Slant
    Yellow Butt Gas, H2S
    Unchanged Slant & Butt Red Slant
    Yellow Butt Gas, H2S
    Unchanged Slant
    Yellow Butt
    Mocznik Negatywny Zmienny Pozytywny Negatywny Negatywny Negatywny

    Simmons Citrate Agar Slant

    Simmons Citrate Agar Slant

    Zasada

    Used for the differentiation and identification of Enterobacteriaceae on the basis of citrate utilization, citrate being the sole carbon source.

    Cel, powód

    Colonies capable of utilizing citrate as a carbon source produce a local increase in pH, changing the color of the medium from green to blue. Only citrate positive organisms will grow on this medium.

    Test Procedure

    1. Inoculate the organism directly onto the surface of a Citrate slant.
    2. Incubate aerobically at 35-37°C.
    3. Examine for growth and color change after 18-24 hours of incubation.

    Interpretations

    Good growth with the medium color turning blue indicative of Enterobacter aerogenes oraz Salmonella choleraesuis.

    Eosin Methylene Blue (EMB) Agar

    Eosin Methylene Blue (EMB) Agar

    Zasada

    A differential plating medium for the detection & isolation of the gram-negative enteric bacteria.


    Obejrzyj wideo: Trombocyty normy, za niski i za wysoki poziom płytek krwi (Sierpień 2022).