Informacja

Degradacja DNA specyficzna dla plazmidu

Degradacja DNA specyficzna dla plazmidu


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Interesuje mnie, czy istnieje sposób na degradację plazmidowego DNA w komórce E. coli, tak aby metoda ta nie zaszkodziła chromosomowemu DNA. Najpierw myślałem o endonukleazach restrykcyjnych, ale obawiam się tego;

  • nie jest wystarczająco konkretny i zabija komórkę
  • albo nic nie robi, ponieważ E.coli metyluje również plazmidowe DNA

Moją drugą myślą był system CRISPR/Cas9, ale brzmi to jak nadmierne komplikowanie problemu. Jakieś prostsze pomysły? (Dla np. określonych enzymów)

EDYCJA: główną ideą jest stworzenie bardziej kompetentnych komórek E.Coli z ukierunkowaną ewolucją. Obecnie jest to tylko eksperyment myślowy, więc nie ma określonej sekwencji plazmidu. W szczegółach; Przekształciłbym plazmid w komórki, następnie wykonałbym część selekcyjną z antybiotykiem i pozwoliłby im rosnąć, następnie przeniósł komórki do pożywki, w której nie ma antybiotyku i dodałbym IPTG w celu indukcji enzymu hydrolazy plazmidu-DNA, a potem może można przeprowadzić inną część selekcyjną w celu usunięcia komórek, które wciąż zawierają plazmid (na przykład za pomocą FACS, jeśli na plazmidzie znajduje się gen GFP), a następnie ponownie nadać komórkom kompetencję za pomocą CaCl2 i powtarzać cały ten proces w kółko.


Tradycyjną metodą usuwania plazmidu z E. coli jest hodowanie komórek z użyciem bromku Etidium.

http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=186&sim=1097&cnt=1


Degradacja zewnątrzkomórkowego genomowego, plazmidowego DNA i specyficznych genów oporności na antybiotyki przez chlorowanie

Istnieje potrzeba lepszego zrozumienia wpływu dezynfekcji chlorem na geny oporności na antybiotyki (ARG) w celu ulepszenia odpowiednich metod leczenia wody pitnej, ścieków i ponownego wykorzystania. Jednak niewiele badań wyraźnie oceniło fizyczny wpływ na DNA. Tutaj zbadaliśmy wpływ wolnego chloru (1–20 mg Cl2/L) na zewnątrzkomórkowym genomowym, plazmidowym DNA i wybranych ARG. Stwierdzono, że chlorowanie zmniejsza sygnał fluorometryczny zewnątrzkomórkowego genomowego i plazmidowego DNA (w zakresie od 0,005 do 0,05 μg/ml) o 70% w stosunku do kontroli bez chloru. Otrzymany DNA poddano następnie analizie fragmentów przy użyciu Bioanalyzer, co wskazuje, że chlorowanie spowodowało fragmentację. Co więcej, chlor również skutecznie dezaktywował ARG zarówno chromosomalne, jak i plazmidowe, mecA i tetA, odpowiednio. Dla stężeń > 2 mg Cl2//L × 30 min, chlor skutecznie redukował sygnał qPCR, gdy początkowe stężenie ARG wynosiło 105 kopii/μl lub mniej. W szczególności genomowy DNA i mecSygnały genu A były łatwiej redukowane przez chlor niż przenoszone przez plazmid tetGen (by

2 razy). Na podstawie wyników qPCR z krótkim (

200 bps) i długie amplikony (

1200 bps), chlorowanie może zniszczyć integralność ARG, co prawdopodobnie zmniejsza możliwość naturalnej transformacji. Podsumowując, nasze odkrycia silnie ilustrują, że chlorowanie może być skuteczną metodą inaktywacji zewnątrzkomórkowego DNA i ARG pochodzących z chromosomów i plazmidów.


Podstawowe cechy wektorów plazmidowych

Tetracyklina wiąże się z podjednostką 30S rybosomu, aby zapobiec translokacji rybosomu
Oporność tet wytwarza białko, które zapobiega przedostawaniu się tetracykliny do komórki.

Chloramfenikol wiąże się z podjednostką 50S rybosomu, aby zapobiec syntezie białek
cat (odporność na chloramfenikol) wytwarza składnik układu enzymatycznego, który przekształca chloramfenikol do postaci, która nie może wiązać rybosomu.

Kanamycin (i blisko spokrewniona neomycyna) to aminoglikozydy, które wiążą podskładniki rybosomu i zapobiegają syntezie białek.
Oporność kan (i neo) zależy od syntezy fosfotransferazy aminoglikozydowej zlokalizowanej w przestrzeni peryplazmatycznej, która hamuje ich transport do komórki.


Degradacja liniowego DNA przez specyficzną wobec nici aktywność egzonukleazy w oocytach Xenopus laevis.

Liniowy DNA wstrzyknięty do jąder oocytów Xenopus laevis rekombinuje z wysoką wydajnością, jeśli sekwencje homologiczne są obecne na nakładających się końcach molekularnych. Odkryliśmy, że wstrzyknięty liniowy DNA został zdegradowany przez aktywność egzonukleazy specyficzną dla 5'----3' podczas inkubacji w jądrze oocytu, pozostawiając niejednorodną populację cząsteczek o ogonach 3'. Zmniejszenie stężenia wstrzykiwanego DNA zwiększało niejednorodność i średnie tempo degradacji. Utworzone ogony 3' były stosunkowo stabilne wśród cząsteczek utrzymujących się po całonocnej inkubacji, wiele z nich miało nienaruszone ogony 3' w granicach 10 zasad od pierwotnych końców. Cząsteczki DNA, które były wydajnymi substratami do homologicznej rekombinacji w oocytach, również uległy częściowej degradacji, pozostawiając ogony 3'. Nie znaleźliśmy dowodów na inne silne działania nukleaz. Jeśli wstrzyknięto cząsteczki z zagiętymi końcami 3'-OH, endogenna polimeraza wydajnie resyntetyzowała komplementarne nici zanim nastąpiła degradacja ogonów 5'. Cząsteczki z 3'-ogonami są prawdopodobnymi pośrednikami w inicjacji zdarzeń homologicznej rekombinacji w jądrach oocytów Xenopus.


Materiały i metody

Przygotowanie plazmidowego DNA

Cząsteczki plazmidu pGEM-5S, superskręcony zamknięty kolisty dwuniciowy podklon plazmidu pGEM-9Z-f(-) o wielkości 3126 pz, zawierający gen rybosomalnego RNA 5S z Xenopus borealis (18), przygotowano i oczyszczono w celu wyeliminowania zanieczyszczenia DNA o mniejszej masie, kwasem rybonukleinowym i solami. Plazmid miał przewidywaną MW 1 945 664 Da dla wolnego kwasu obliczoną z sekwencji zasad (18). Plazmid hodowano w transformowanych Escherichia coli JM109 i po lizie alkalicznej superskręcony DNA oddzielono przez wirowanie w gradiencie gęstości CsCl. Po kolejnym wytrąceniu 100% etanolu z roztworu octanu amonu przeprowadzono ultrafiltrację z użyciem Centricon-100 (Amicon, Danvers, MA). Preparaty składały się głównie z form superskręconych, z niewielkim udziałem naciętego okrągłego i linearyzowanego plazmidu.

Elektroforeza plazmidowego DNA poddanego elektrorozpylaniu

Los plazmidu po jonizacji przez elektrorozpylanie badano przez zbieranie próbek na powierzchniach przewodzących, a następnie analizę elektroforetyczną w żelu agarozowym (5). Cele składały się z chemicznie czystej folii ze stali nierdzewnej lub wodnego 9 mM Tris, 9 mM kwasu borowego i 0,2 mM kropelki buforowanej EDTA (TBE) (50 µl) stabilizowanej 1% żelem agarozowym. Plazmid (10 µg/µl w wodzie dejonizowanej) dostarczano do źródła jonów z szybkością 0,2–0,5 µl/min, a cele umieszczano pod ciśnieniem atmosferycznym na płytce wejściowej interfejsu ESI-MS (patrz poniżej) w identycznych poza tym warunkach dla eksperymenty ESI-MS opisane dalej (tj. w obecności gazu osłonowego i przeciwprądowego, a także pompowania różnicowego za płytą). Po wysuszeniu celu plazmid wyekstrahowano do 50 µl buforu TBE. Analizę elektroforetyczną odzyskanych próbek plazmidu przeprowadzono w 1% żelach agarozowych buforowanych w TBE z wizualizacją bromkiem etydyny (0,5 ug/ml).

Spekrtometria masy

Wstępne eksperymenty ESI-MS przeprowadzono przy użyciu potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego Sciex (Thornhill, ON, Kanada) TAGA 6000E o mocy rozdzielczej (m/Δm) ∼800 i zakresie mas 1400 ( m/z ). Instrument ten był wyposażony w prototypowe źródło ESI posiadające interfejs dysza-skimmer (19). Do zbierania próbek plazmidu i do akwizycji widm masowych plazmidowego DNA zastosowano następujące parametry: 10 µM próbki DNA w wodzie dejonizowanej szybkość wlewu próbki 0,2 µl/min napięcie rozpylania -2,5 kV napięcie dyszy -60 V napięcie odpieniacza -150 V Przepływy współosiowe SF 6 i przeciwprąd N 2 zostały wykorzystane do ESI próbek DNA.

Eksperymenty FTICR przeprowadzono przy użyciu zmodyfikowanego IonSpec (Irvine, CA) FTICR z nadprzewodnikowym magnesem Oxford 7-Tesla i wykorzystując zmodyfikowane źródło ESI Analytica (Branford, CT) (7). Akwizycję sygnału w dziedzinie czasu zrealizowano przy użyciu systemu danych Omega (wersja 3.0) oraz oddzielnego, samodzielnego, rozszerzonego systemu akwizycji danych w dziedzinie czasu (8, 15). Próbkę plazmidowego DNA przygotowano jak opisano powyżej w końcowym stężeniu 0,2 mg/ml (0,1 µM) w wodzie dejonizowanej. Próbka została poddana elektrorozpylaniu, jak powyżej, a jony były gromadzone w ogniwie FTICR przez 1 s przy ∼10 -4 Torr (azot), kolizyjne chłodzone przez 15 s i wykrywane za pomocą wzbudzenia chirp (częstotliwość przemiatania 35 Hz/µs) i akwizycji danych szerokopasmowych (z częstotliwością próbkowania 200 kHz) przez 40 s ( 7 ). Do określenia masy i ładunku wykorzystano reakcję fazy gazowej poszczególnych jonów DNA z kwasem octowym w celu wywołania zmian stanu ładunku. Widma masowe uzyskano kilka minut po impulsowym dodaniu kwasu octowego do układu (co podniosło ciśnienie w układzie z 10-9 do 10-7 Tor na kilka sekund) (15), co ułatwiało reakcje przenoszenia ładunku przy pożądanym wskaźnik.


Ultradźwiękowa degradacja DNA

Różne wyniki uzyskuje się, gdy DNA w roztworze wodnym i DNA w tkance biologicznej są poddawane działaniu ultradźwięków. Przy natężeniach ultradźwięków porównywalnych z tymi stosowanymi klinicznie, ultradźwięki są w stanie degradować oczyszczone DNA w roztworze wodnym, dzięki czemu ultradźwięki są użytecznym narzędziem do przygotowywania fragmentów DNA in vitro. Ultradźwiękowa degradacja DNA w roztworze następuje poprzez zerwanie wiązań wodorowych oraz jednoniciowe i dwuniciowe pęknięcia helisy DNA. Odpowiedzialne są głównie dwa mechanizmy: kawitacja oraz efekt termiczny lub mechaniczny. Stabilna kawitacja jest widoczna przy niskich natężeniach ultradźwięków. Po zwiększeniu natężenia ultradźwięków powyżej 2 W/cm 2 następuje wzrost pęknięć pojedynczych nici spowodowanych powstawaniem wolnych rodników przez przejściową kawitację. Po sonikacji rozkład powstałych fragmentów DNA zbliża się do dolnej granicy wielkości 100-500 pz. Pęknięcia w helisie DNA występują głównie między atomami tlenu i węgla, co skutkuje fragmentami DNA z fosforylowanym końcem 5' i wolnym alkoholem na końcu 3'. Względny brak specyficzności w degradacji helisy DNA sprawia, że ​​ultradźwięki stanowią komplementarną alternatywę dla wysoce specyficznej fragmentacji uzyskanej przez endonukleazy restrykcyjne.


Degradacja DNA specyficzna dla plazmidu - Biologia

Wszystkie artykuły publikowane przez MDPI są natychmiast udostępniane na całym świecie na podstawie licencji otwartego dostępu. Nie jest wymagane żadne specjalne pozwolenie na ponowne wykorzystanie całości lub części artykułu opublikowanego przez MDPI, w tym rysunków i tabel. W przypadku artykułów opublikowanych na otwartej licencji Creative Common CC BY dowolna część artykułu może być ponownie wykorzystana bez pozwolenia, pod warunkiem, że oryginalny artykuł jest wyraźnie cytowany.

Artykuły tematyczne reprezentują najbardziej zaawansowane badania o dużym potencjale wywierania dużego wpływu w tej dziedzinie. Artykuły fabularne są nadsyłane na indywidualne zaproszenie lub rekomendację redakcji naukowych i przed publikacją podlegają recenzowaniu.

Artykuł może być oryginalnym artykułem badawczym, istotnym nowatorskim badaniem, które często obejmuje kilka technik lub podejść, lub obszernym artykułem przeglądowym ze zwięzłymi i precyzyjnymi aktualizacjami na temat najnowszych postępów w tej dziedzinie, które systematycznie przeglądają najbardziej ekscytujące postępy w nauce literatura. Tego typu artykuł przedstawia perspektywę przyszłych kierunków badań lub możliwych zastosowań.

Artykuły Editor’s Choice oparte są na rekomendacjach redaktorów naukowych czasopism MDPI z całego świata. Redaktorzy wybierają niewielką liczbę artykułów opublikowanych ostatnio w czasopiśmie, które ich zdaniem będą szczególnie interesujące dla autorów lub ważne w tej dziedzinie. Celem jest przedstawienie migawki niektórych z najbardziej ekscytujących prac opublikowanych w różnych obszarach badawczych czasopisma.


Degradacja DNA specyficzna dla plazmidu - Biologia

Czystość i koncentracja szablonu są dwoma najważniejszymi czynnikami w uzyskiwaniu optymalnych wyników przy automatycznym sekwencjonowaniu fluorescencyjnym kapilar. Niska jakość matrycy DNA lub suboptymalna ilość matrycy DNA będzie miała znaczący wpływ na powodzenie reakcji sekwencjonowania.

Jeśli przygotowujesz matryce DNA (plazmidowe DNA, amplikony PCR) do sekwencjonowania DNA Sangera, rozważ skorzystanie z naszej wiedzy merytorycznej, postępując zgodnie z naszymi zaleceniami i wytycznymi. Chcielibyśmy, aby próbki Sanger DNA Sequencing działały za pierwszym razem i dawały wysokiej jakości dane - bez konieczności powtarzania lub rozwiązywania problemów!

Przygotowanie matrycy plazmidowego DNA do sekwencjonowania kapilarnego:

Obecnie dostępnych jest wiele metod i zestawów do przygotowania plazmidów, które dają matrycę DNA o doskonałej jakości. Większość, jeśli nie wszystkie z tych opcji, wykorzystują zmodyfikowaną procedurę lizy alkalicznej. Różnorodne czynniki, często spowodowane przez niektóre typowe błędy lub pominięcie określonych kroków protokołu, mogą zagrozić jakość matrycy plazmidowego DNA.

  • - Zanieczyszczenia takie jak sole, chemikalia organiczne (fenol, chloroform lub etanol) i pozostałości detergentów
  • - Obecność składników komórkowych, takich jak RNA, białka, polisacharydy lub chromosomalny DNA
  • - Przenoszenie miału krzemionkowego - Degradacja podczas przechowywania
  • - Heterogeniczna populacja cząsteczek plazmidowego DNA (zanieczyszczenie innym plazmidem)

Niska jakość matrycy DNA może skutkować zaszumionymi danymi (tj. małe drugorzędowe piki poniżej pierwszorzędowych pików w odczytanej sekwencji), bezużytecznymi danymi sekwencyjnymi (tj. dane sekwencji zawierające głównie N) lub słabym sygnałem. Ponadto matryca DNA o niskiej jakości może skrócić czas życia macierzy kapilarnej.

Chociaż nie popieramy żadnych produktów dostępnych na rynku, sugerujemy uważne przestrzeganie protokołów przygotowania plazmidów i uwzględnienie następujących rekomendacje:

  • Wytrącony izopropanolem DNA plazmidowy należy przemyć (co najmniej raz zgodnie z zaleceniami) 70% etanolem w celu usunięcia nadmiaru soli. Resztkowa sól w końcowym preparacie matrycy będzie miała negatywny wpływ na aktywność polimerazy Taq.
  • Matryca DNA musi być całkowicie wysuszona przed ostatecznym zawieszeniem w wodzie wolnej od nukleaz, w 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (bufor EB) lub w buforze Low TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,5- 8.0). Pozostały etanol jest szkodliwy dla sekwencjonowania cyklu Taq. Jeżeli metoda oczyszczania plazmidowego DNA obejmuje użycie kolumny wirówkowej, należy zachować ostrożność, aby usunąć etanol, który może zostać uwięziony w kolumnie po ostatnim etapie płukania (przed wymywaniem plazmidowego DNA z kolumny). Zalecamy najpierw obrócić kolumnę (umieszczoną na probówce pojemnika) o 180 stopni i przejść do drugiego etapu wirowania („na sucho”).
  • Zalecamy dodatkowy etap wirowania po elucji z kolumny wirowej, aby usunąć resztki żywicy z kolumny, co mogłoby skutkować słabymi wynikami sekwencjonowania. Po wirowaniu wymytego plazmidowego DNA przez 5 minut przy maksymalnej prędkości, najwyższą część próbki należy przenieść do świeżej probówki.
  • Należy postępować zgodnie ze wskazówkami dotyczącymi wzrostu komórek, aby uniknąć przeładowania kolumn, co skutkowałoby niską wydajnością DNA i przenoszeniem niepożądanych zanieczyszczeń.
    Szczep gospodarza E. coli stosowany do namnażania plazmidu może mieć istotny wpływ na jakość oczyszczonego DNA. Najczęściej stosowane szczepy, takie jak DH1, DH5&alfa i XL1-Blue konsekwentnie wytwarzają plazmidowy DNA o wysokiej jakości. Wiadomo, że szczepy gospodarza, takie jak HB101 i jego pochodne (takie jak TG1 i seria JM100), są źródłem zmienności w odniesieniu do jakości matrycy.
  • Chcielibyśmy podkreślić znaczenie przestrzegania dobrych praktyk mikrobiologicznych:
    • Powinieneś mieć unikalny produkt DNA w swojej próbce: Czyste „pojedyncze” klony bakteryjne powinny być uzyskane przed zaszczepieniem pożywki wzrostowej (poprzez posiew kolonii z płytek transformacyjnych).
    • Propagację klonu zawierającego plazmid należy zawsze przeprowadzać w obecności odpowiedniego antybiotyku.

    Ocena ilościowa DNA

    Podobnie jak w przypadku jakości DNA, ilość matrycowego DNA jest równie ważnym wyznacznikiem powodzenia reakcji sekwencjonowania - tj. jest warunkiem wstępnym uzyskania bardzo dokładnych i wiarygodnych danych dotyczących sekwencji DNA. Zbyt mała ilość szablonu powoduje reakcje z małym lub zerowym sygnałem i słabym sprawdzeniem lub brakiem sprawdzenia bazy. Zbyt dużo DNA powoduje przedwczesne zakończenie reakcji sekwencjonowania, często dając mniej niż 250 zasad wiarygodnych danych sekwencyjnych. Dlatego dokładna ocena ilościowa wysokiej jakości matrycy DNA jest ważnym krokiem w całym procesie sekwencjonowania.

    Poświęć chwilę na zapoznanie się z naszymi rekomendacjami do oznaczania stężenia DNA:

    • W miarę możliwości stężenie DNA powinno być określane za pomocą spektrofotometrii.
    • Należy pamiętać, że większość spektrofotometrów nie jest dokładna przy wartościach OD (gęstości optycznej) poniżej 0,05. Wartości OD260 powinny mieścić się w zakresie od 0,05 do 0,8, aby zapewnić powtarzalne i wiarygodne wyniki. Uwaga: Wiele spektrofotometrów może odczytywać przy 0,05, ale tylko wtedy, gdy są bardzo dokładnie skalibrowane z odniesieniem (ślepa próba). Minipreparacja plazmidowego DNA (lub PCR, patrz poniżej) zwykle nie daje wystarczającej ilości DNA, aby uzyskać dokładne oznaczenie ilościowe na typowych spektrofotometrach znajdujących się w większości laboratoriów. Powinieneś być bardzo ostrożny z wynikami - chyba że możesz wykonać pomiar OD z kuwetą o objętości 10 ul (lub nawet 100 ul, w zależności od specyfiki próbki).
    • Jeśli korzystasz ze spektrofotometru NanoDrop UV, upewnij się, że często czyścisz podstawę i okresowo ponownie kalibrujesz urządzenie. Jeśli zauważysz niezwykle wysoką OD podczas pomiaru stężenia minipreparatu plazmidowego DNA, możesz mieć RNA lub chromosomalny DNA w twojej próbce. Jest to główna przyczyna niepowodzenia sekwencjonowania za pomocą minipreparacji plazmidowego DNA.
    • Stosunek 260/280 w twojej próbce powinien w idealnym przypadku wynosić od 1,8 do 2,0. Wartości niższe niż 1,6 i wyższe niż 2,0 wskazują na zanieczyszczenia w próbce. Mogą one zakłócać oznaczanie stężenia i mogą hamować reakcję sekwencjonowania.
    • Jeśli to możliwe, zalecamy pomiary OD przy 230 nm i 320 nm. Obie wartości powinny wynosić idealnie 0,0, a stosunek 230/260 powinien być niższy niż 0,6. Wysoka wartość przy OD320 wskazuje na zanieczyszczenie.
    • Jeśli nie powinieneś mieć dostępu do spektrofotometru lub mikrospektrofotometru (NanoDrop), zdecydowanie zalecamy przeprowadzenie co najmniej dwóch różnych ilości matrycowego DNA na analitycznym żelu agarozowym, sąsiadującym z serią rozcieńczeń (50-500 ng) referencyjny fragment DNA o podobnej wielkości i znanym stężeniu, aby oszacować stężenie próbki.

    Rozcieńczenie DNA

    Po określeniu stężenia należy rozcieńczyć matrycę do właściwego stężenia końcowego (patrz tutaj) przy użyciu jałowej wody wolnej od nukleaz lub 10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0. Proszę nie używać żadnych buforów zawierających Na2EDTA lub kationy dwuwartościowe (Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ ).

    Prosimy o zapoznanie się z naszą stroną przesyłania próbek Sanger, aby upewnić się, że przesyłasz wystarczającą ilość szablonu DNA do sekwencjonowania.

    Przygotowanie produktów PCR do sekwencjonowania kapilarnego:

    Podobnie jak w przypadku matryc plazmidowego DNA, produkty PCR powinny mieć wystarczającą jakość, aby zapewnić pomyślne sekwencjonowanie. Niezbędne jest usunięcie potencjalnie zakłócających substancji, które mogą pozostać w roztworze po reakcji PCR. Potencjalne zanieczyszczenia obejmują nadmiar starterów PCR, nukleotydów, enzymów i składników buforowych z reakcji PCR, jak również nieswoiste produkty amplifikacji. Zanieczyszczenia te mogą czasami uczestniczyć, a tym samym ingerować w reakcję sekwencjonowania cykli i prowadzić do niskiej jakości danych lub ich braku.

    Proszę wziąć pod uwagę następujące rekomendacje przygotowując reakcję (reakcje) PCR do przesłania:

    • Wszystkie startery PCR muszą zostać usunięte przed sekwencjonowaniem. Sekwencjonowanie wykorzystuje tylko jeden starter - zamiast dwóch użytych w reakcji PCR. Jeśli w roztworze PCR pozostaną zarówno startery do reakcji do przodu, jak i do tyłu, oba będą działać jako startery do sekwencjonowania i hybrydyzują z komplementarnymi nićmi o różnym składzie nukleotydów, a tym samym dadzą dwie sekwencje nakładające się na siebie, które nie są czytelne („sekwencja mieszana” ).
    • Nadmiar dNTPs musi być również usunięty przed sekwencjonowaniem, ponieważ zaburzają one specyficzne stosunki dNTP/ddNTP wymagane do optymalnego wydłużenia i zakończenia w reakcji sekwencjonowania cyklicznego. Uwaga: Chociaż dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów do czyszczenia PCR, wolimy nie polecać określonych produktów.

    UWAGA:
    Nasza grupa ds. sekwencjonowania DNA oferuje w pełni zautomatyzowaną (format 96-dołkowy) usługę czyszczenia dla reakcji PCR, które składają się z jednego produktu powyżej 100 pz. Szczegółowe informacje na temat usługi można znaleźć tutaj.


    Jakość plazmidowego DNA

    Czystość i jakość plazmidowego DNA ma kluczowe znaczenie dla udanej transfekcji. Najlepsze wyniki uzyskuje się z plazmidowym DNA o najwyższej czystości, wolnym od fenolu, chlorku sodu i endotoksyn. Zanieczyszczenia zabiją komórki, a sól zakłóci kompleksowanie lipidów, zmniejszając wydajność transfekcji. Endotoksyny, znane również jako lipopolisacharydy, są uwalniane podczas etapu lizy preparatów plazmidowych i często są współoczyszczane z plazmidowym DNA. Ich obecność znacznie zmniejsza wydajność transfekcji w pierwotnych i innych wrażliwych komórkach. Zalecamy izolację plazmidowego DNA za pomocą zestawów PureLink HiPure Plasmid Kit (Mini, Midi, Maxi, Mega i Giga), które zapewniają najwyższą jakość DNA do transfekcji.

    Chociaż prążkowanie chlorkiem cezu daje również wysoce oczyszczone DNA, jest to proces pracochłonny i czasochłonny. Nadmierne wirowanie kompleksów DNA-lipid lub roztworów DNA może powodować pewne ścinanie, zwłaszcza w przypadku większych cząsteczek, zmniejszając w ten sposób wydajność transfekcji. Stężenie EDTA w rozcieńczonym DNA nie powinno przekraczać 0,3 mM.


    Plazmid pAMI2 z Paracoccus aminophilus JCM 7686 nosi n,nGeny związane z degradacją dimetyloformamidu, których ekspresja jest aktywowana przez regulator rodziny LuxR

    FIGA. 1 . Schematyczny szlak degradacji n,n-dimetyloformamid, pokazujący pierwszy etap katalizowany przez kodowany przez pAMI2 n,n-dimetyloformamidaza. FIGA. 2 . Degradacja DMF i stopa wzrostu trzech P. aminophilus szczepy. A. Stężenia DMF w supernatantach hodowli, określone metodą HPLC. B. Tempo wzrostu kultur bakteryjnych określone na podstawie liczby żywych komórek (CFU). Szczepy hodowano w płynnej pożywce mineralnej (50 ml) z dodatkiem DMF (1500 mg/litr) jako jedynego źródła węgla i energii, a próbki pobierano co 24 godziny przez 96 godzin. Wykreślone wartości są średnimi z trzech powtórzeń, ze słupkami błędów wskazującymi odchylenia standardowe. FIGA. 3 . Organizacja genetyczna plazmidu pAMI2. Wykres przedstawia zawartość G+C w sekwencji pAMI2, ze średnią wartością (~62 mol%) zaznaczoną linią przerywaną. Przewidywane moduły plazmidu zaznaczono zacienionymi ramkami. Strzałki oznaczają przewidywane regiony kodujące i ich kierunek transkrypcji. Lokalizacja domniemanego początku replikacji (oriV), pochodzenie przeniesienia małżeńskiego (oriT) i witrynę partycjonowania (parS) są pokazane. FIGA. 4 . Analiza RT-PCR dmfR-dmfA1-dmfA2 klaster genów. A. Genetyczna organizacja modułu DMFase. Wskazano pozycje starterów użytych do analiz RT-PCR. Regiony DNA zawierające PdmfR, PdmfA1, i pdmfA2 promotory (sklonowane w wektorze sondy promotorowej pCM132) zaznaczono szarymi ramkami. Sekwencja nukleotydów dmfR region promotora pokazano poniżej diagramu. Przypuszczalne heksamery -10 i -35 i przewidywana sekwencja wiązania DmfR są otoczone ramką i wskazano miejsce wiązania rybosomu (rbs) i kodon start. Wskazano miejsca restrykcyjne stosowane do analizy mutacyjnej. B. Elektroforeza w żelu agarozowym produktów RT-PCR. Analizę przeprowadzono z użyciem całkowitego RNA wyizolowanego z P. aminophilus JCM 7686R uprawiany na podłożu mineralnym z arabinozą (panel lewy) lub DMF (panel prawy) jako jedynym źródłem węgla i energii. Rozmiary amplifikowanych fragmentów potwierdzono przez porównanie ze ścieżką markerową po prawej stronie. Reakcje kontrolne przeprowadzono z traktowanymi DNazą matrycami RNA i pAMI2 DNA (odpowiednio kontrola negatywna i pozytywna). FIGA. 5 . Wpływ białka DmfR na aktywność promotorów zidentyfikowanych w obrębie dmfR-dmfA1-dmfA2 klaster genów. Aktywności β-galaktozydazy wytwarzane przez wektor sondy promotorowej pCM132 (kontrola -) i pochodne niosące lacZ fuzje transkrypcyjne z PdmfR, PdmfA1, i pdmfA2 promotorzy w obecności trans plazmidu pBBR-dmfR (źródło W białka DmfR) lub pBBR-ΔdmfR (M zawiera zmutowane dmfR gen) są pokazane. Aktywności enzymatyczne określono w P. aminovorans JCM 7685R hodowany na pożywce minimalnej z arabinozą (panel lewy) lub DMF (panel prawy) jako jedynym źródłem węgla i energii.


    Obejrzyj wideo: pUC19 Vector and its Features - Usefulness in Cloning (Czerwiec 2022).


Uwagi:

  1. Toirdealbhach

    Coś w tym jest. Teraz wszystko stało się dla mnie jasne, dziękuję za informację.

  2. Galileo

    Między nami.

  3. Quenton

    Bez względu na to, jak bardzo się staramy, nadal będzie tak, jak zamierzał wszechświat. Podczas czytania mój mózg umarł.

  4. Tlacelel

    współczujące pytanie



Napisać wiadomość