Informacja

Definiowanie artykułów w epigenetyce

Definiowanie artykułów w epigenetyce


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dla kogoś, kto jest zainteresowany poznaniem odkrycia epigenetyki, jakie są podstawowe prace definiujące w tej dziedzinie?


Rozumiem, że Robin Holliday jako pierwszy omówił możliwą rolę metylacji DNA w kontroli ekspresji genów. W swoim artykule „Dziedziczenie defektów epigenetycznych” przedstawia jedno z pierwszych współczesnych sformułowań tego, co obecnie uważamy za epigenetykę. Sam termin „epigenetyka” został ukuty przez Conrada Waddingtona, chociaż wyprzedza on nasze współczesne rozumienie dziedziczności.

Wakacje, R., Dziedziczenie wad epigenetycznych, 1987, Nauka, 238, 4824


Istnieje kilka pojedynczych artykułów, które naprawdę same napędzają tę dziedzinę, epigenetyka była długim powolnym postępem (chociaż ostatnio definicja została zagmatwana i zaczęła obejmować nieepigenetyczne tryby regulacji genów). Całkiem dobry przegląd wielu badań, w tym bardziej ostrożną dyskusję na temat tego, czym jest epigenetyka, można znaleźć w rocznym przeglądzie Youngsona i Whitelawa (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18767965).


Znalazłem dwa ładne artykuły przeglądowe poświęcone epigenetyce i chorobom człowieka, jeden z 2004 roku, a drugi z 2006 roku. Ale może szukasz czegoś takiego?

Znalazłem również ten artykuł w wiadomościach BBC: Duch w twoich genach

Pokazali, że głód w krytycznych momentach życia dziadków może wpłynąć na długość życia wnuków. To pierwszy dowód na to, że efekt środowiskowy może być dziedziczony u ludzi.

Bibliografia:

  • Jiang Y-H, Bressler J, Beaudet AL. 2004. Epigenetyka a choroby człowieka. Roczny przegląd genomiki i genetyki człowieka 5: 479-510.

  • Rodenhiser D, Mann M. 2006. Epigenetyka a choroby człowieka: przełożenie podstaw biologii na zastosowania kliniczne. CMAJ : Czasopismo Kanadyjskiego Stowarzyszenia Medycznego = czasopismo de l'Association medicale canadienne 174: 341-8.

  • Haig D. 2004. (Podwójne) pochodzenie epigenetyki. Sympozja Cold Spring Harbor na temat biologii ilościowej 69: 67-70. [pdf]


Conrad Waddington i pochodzenie epigenetyki

Klasyka to felieton okazjonalny, prezentujący historyczne publikacje z literatury. Artykuły te, napisane przez współczesnych ekspertów w tej dziedzinie, omawiają wpływ każdego klasycznego artykułu na dziedzinę biologii i ich własną pracę.

Denis Noble Conrad Waddington i pochodzenie epigenetyki. J Exp Biol 15 marca 2015 r. 218 (6): 816–818. doi: https://doi.org/10.1242/jeb.120071

Denis Noble omawia klasyczną pracę Conrada Waddingtona „The genetic asymilation of the bithorax phenotype”, opublikowaną w Ewolucja w 1956 roku.

Denis Noble omawia klasyczną pracę Conrada Waddingtona pt. Ewolucja w 1956 roku.

W 1956 roku brytyjski biolog rozwoju Conrad Waddington opublikował artykuł w czasopiśmie Ewolucja (Waddington, 1956), w którym udało mu się wykazać dziedziczenie cechy nabytej w populacji w odpowiedzi na bodziec środowiskowy. Dużo wcześniej, bo w 1890 roku, August Weismann próbował tego dokonać i nie udało mu się tego osiągnąć. Amputował ogony pięciu kolejnym pokoleniom myszy i nie wykazał żadnych dowodów na wpływ na kolejne pokolenia. Odkrycie Weismanna, że ​​skutki bodźca środowiskowego (amputacja ogona) nie mogą być przenoszone na kolejne pokolenia, wraz z jego założeniem, że zmiana genetyczna jest losowa, stworzyły podstawy nowoczesnej syntezy (neodarwinizmu) naszego rozumienia dziedziczenia genetycznego.

Podejście Waddingtona było jednak znacznie subtelniejsze i bardziej prawdopodobne, że odniesie sukces, ponieważ zdał sobie sprawę, że sposobem na przetestowanie dziedziczenia cech nabytych jest najpierw odkrycie, jakie formy plastyczności rozwojowej już istnieją w populacji lub że populacja może być przekonany do demonstracji z niewielkim naciskiem ze strony otoczenia. Wykorzystując już istniejącą plastyczność, był znacznie bardziej skłonny naśladować ścieżkę, którą mogła obrać sama ewolucja.

Użył słowa „kanalizacja” dla tego rodzaju perswazji, ponieważ przedstawiał proces rozwojowy jako serię „decyzji”, które można było przedstawić jako „doliny” i „widły” w krajobrazie rozwojowym (ryc. 1). Wiedział ze swoich badań rozwojowych, że embrionkowe muszki owocowe można przekonać do różnych struktur klatki piersiowej i skrzydeł, po prostu przez zmianę temperatury otoczenia lub bodziec chemiczny. Na jego diagramie krajobrazowym można to przedstawić jako niewielką manipulację nachyleniem, która doprowadziłaby do uprzywilejowania jednego kanału w krajobrazie nad innym, tak aby dorosły mógł wykazywać inny fenotyp, zaczynając od tego samego genotypu.

Schemat krajobrazu rozwojowego Waddingtona. Sam krajobraz i kula na górze pochodzą z jego oryginalnego schematu. Kolejne pozycje kuli zostały dodane, aby zilustrować jego pogląd, że rozwój można ukierunkować na różne trasy (A i B). Plastyczność, która to umożliwia, istnieje już w dzikiej populacji organizmów (zmodyfikowany wykres K. Mitchella).

Schemat krajobrazu rozwojowego Waddingtona. Sam krajobraz i kula na górze pochodzą z jego oryginalnego schematu. Kolejne pozycje kuli zostały dodane, aby zilustrować jego pogląd, że rozwój można ukierunkować na różne trasy (A i B). Plastyczność, która to umożliwia, istnieje już w dzikiej populacji organizmów (zmodyfikowany wykres K. Mitchella).

Kolejnym krokiem w jego eksperymencie było wyselekcjonowanie i rozmnażanie zwierząt wykazujących nową charakterystykę. Wystawione na ten sam bodziec środowiskowy, dały początek potomstwu z jeszcze wyższym odsetkiem dorosłych wykazujących nowy charakter. Po stosunkowo niewielkiej liczbie pokoleń odkrył, że może następnie rozmnażać się od zwierząt i uzyskiwać silne dziedziczenie nowej postaci, nawet bez stosowania bodźca środowiskowego. Cecha ta została więc zablokowana w genetyce zwierzęcia. Nazwał ten proces asymilacją genetyczną. Udało mu się wykazać, że nabyta cecha może najpierw zostać odziedziczona jako to, co teraz nazwalibyśmy „miękkim” dziedziczeniem, a następnie można ją zasymilować jako standardowe „twarde” dziedziczenie genetyczne. Dzisiaj nazywamy „miękkim” dziedziczeniem dziedziczenie epigenetyczne i oczywiście znamy o wiele więcej mechanizmów, za pomocą których ten sam genom może być kontrolowany w celu wywołania różnych efektów epigenetycznych.

Co się działo na poziomie genów w eksperymentach Waddingtona? Standardowym neodarwinistycznym wyjaśnieniem może być pojawienie się pewnych mutacji. Jest to możliwe, ale skrajnie nieprawdopodobne w skali czasowej eksperymentu, który trwał zaledwie kilka pokoleń. Co więcej, losowe mutacje występowałyby u osobników, a nie w całej grupie. Pojedyncze małe mutacje zajęłyby bardzo wiele pokoleń, aby rozprzestrzenić się w całych populacjach i wiele takich mutacji byłoby wymaganych.

Ale myślę, że istnieje znacznie prostsze wytłumaczenie. Przypomnijmy, że w eksperymencie wykorzystano plastyczność, która jest już obecna w populacji. To silnie sugeruje, że wszystkie allele (warianty genów) niezbędne do dziedziczenia cechy były już obecne w populacji, ale początkowo nie u żadnego konkretnego osobnika we właściwej kombinacji. Eksperyment po prostu je łączy. Jest to modyfikacja wzoru genomu w odpowiedzi na zmianę środowiska, ale nie w sposób, który wymaga nowych mutacji. Doszedłem do tego wniosku przed przeczytaniem książki Waddingtona (1957), Strategia genów. Ale w rzeczywistości jest to jeden z własnych pomysłów Waddington! Pisze on: „Nie ma… powodu, który uniemożliwiłby nam wyobrażenie sobie, że wszystkie geny, które ostatecznie składają się na zasymilowany genotyp, były już obecne w populacji przed rozpoczęciem selekcji i wymagały jedynie połączenia” (s. 176). Nie tylko wyraźnie widzi tę możliwość, ale także ją testuje. Kontynuuje (s. 178) „Próby przeprowadzenia asymilacji genetycznej począwszy od linii wsobnych pozostały dość nieudane. To dostarcza dalszych dowodów na to, że proces zależy od wykorzystania zmienności genetycznej w materiale podstawowym, od którego zaczyna się eksperyment”. Jego tekst nie mógł być jaśniejszy.

Ortodoksyjni neodarwiniści odrzucili odkrycia Waddingtona jako zaledwie przykład ewolucji plastyczności fenotypu. To właśnie znajdziesz w wielu podręcznikach do biologii nawet dzisiaj (np. Arthur, 2010). Myślę, że Waddington pokazał więcej. Oczywiście plastyczność może ewoluować i to samo może być przez neodarwinistę lub jakikolwiek inny mechanizm. Ale Waddington nie tylko pokazywał ogólnie ewolucję plastyczności, ale pokazywał, jak można ją wykorzystać, aby umożliwić dziedziczenie i asymilację określonej cechy nabytej w odpowiedzi na zmianę środowiska w genomie. Co więcej, odszedł od ścisłego neodarwinistycznego poglądu, pokazując, że może się to zdarzyć, nawet jeśli nie pojawią się nowe mutacje (ryc. 2).

Diagram Waddingtona pokazujący, w jaki sposób krajobraz rozwojowy odnosi się do poszczególnych genów (kołki dolne) poprzez sieci interakcji w organizmie. Ponieważ pokazał również wpływ środowiska zewnętrznego na kanalizację rozwoju, rozszerzyłem diagram o górną część, aby przedstawić wpływy środowiskowe. To właśnie kombinacja tych wpływów może prowadzić do zmiany ewolucyjnej bez mutacji (zmodyfikowane z Waddington, 1957).

Diagram Waddingtona pokazujący, w jaki sposób krajobraz rozwojowy odnosi się do poszczególnych genów (kołki dolne) poprzez sieci interakcji w organizmie. Ponieważ pokazał również wpływ środowiska zewnętrznego na kanalizację rozwoju, rozszerzyłem diagram o górną część, aby przedstawić wpływy środowiskowe. To właśnie kombinacja tych wpływów może prowadzić do zmiany ewolucyjnej bez mutacji (zmodyfikowane z Waddington, 1957).

Epigenetyka oznacza „powyżej genetyki” i została pierwotnie wymyślona przez samego Waddingtona, aby opisać istnienie mechanizmów dziedziczenia oprócz (ponad i ponad) standardowej genetyki (Bard, 2008). Waddington uważał się za darwinistę, ponieważ Darwin również Pochodzenie gatunków, obejmowały dziedziczenie cech nabytych. Znamienne jest jednak, że Waddington nie był neodarwinistą, ponieważ neodarwinizm, idąc za Weismannem, wyraźnie wyklucza takie dziedziczenie. Waddington był głębokim myślicielem biologii i nie tylko. Strategia genów jest mistrzowskim opisem wielu powodów, dla których odstąpił od neodarwinizmu i przetrwał próbę czasu. Został przedrukowany ponad pół wieku później, w 2014 roku. Nie określił się jako Lamarcjanin, ale ujawniając mechanizmy dziedziczenia cech nabytych, myślę, że należy go za takiego uznać. Powodem, dla którego tego nie zrobił, jest to, że Lamarck nie mógł pojąć procesów, które ujawnił Waddington. Nawiasem mówiąc, prawdą jest również stwierdzenie, że Lamarck nie wymyślił idei dziedziczenia cech nabytych. Ale niezależnie od tego, czy jest to poprawne historycznie, czy nie, dziś utknęliśmy z terminem „Lamarckian” dla dziedziczenia cechy nabytej przez wpływ środowiska.

Koncepcje plastyczności i epigenetyki Waddingtona wywarły duży wpływ na moje własne myślenie o eksperymentach z rytmem serca. Odkryliśmy, że rozrusznik serca jest bardzo silny, do tego stopnia, że ​​mechanizmy białkowe normalnie odpowiedzialne za dużą część rytmu mogą zostać całkowicie zablokowane lub usunięte (Noble i wsp., 1992). Występują tylko bardzo małe zmiany rytmu, ponieważ w grę wchodzą inne mechanizmy zapewniające kontynuację działania stymulatora. W związku między poszczególnymi genami a fenotypem pośredniczą zatem sieci interakcji, które mogą buforować zmienność poszczególnych genów, tak jak przewidział Waddington w swoich diagramach efektów epigenetycznych i kanalizacji. Jest to jeden z powodów, dla których wiele lat temu zainteresowałem się biologią ewolucyjną, a także zbadałem sposoby integracji teorii ewolucji z najnowszymi odkryciami biologii molekularnej i fizjologicznej (Noble i in., 2014).

Koncepcje Waddingtona są również bardzo istotne dla biologów zainteresowanych sposobami, w jakie organizmy przystosowują się do ich środowiska, oraz dla biologów porównawczych zainteresowanych tym, jak różni się to między gatunkami. Wiele sposobów, w jakie współczesna epigenetyka odgrywa zasadniczą rolę w tych dziedzinach, zostało opisanych w specjalnym wydaniu tego czasopisma (patrz przegląd Knight, 2015). Odkrycie epigenetycznego znakowania DNA i powiązanych z nim białek chromatyny otworzyło nowe perspektywy dla biologii eksperymentalnej.

Kończę ten artykuł ostrzeżeniem: jeśli jesteś zainspirowany do powtórzenia eksperymentu Waddingtona z 1956 r., pamiętaj, że poniesiesz porażkę, jeśli spróbujesz to zrobić na sklonowanej populacji laboratoryjnej. Mechanizm polega na wykorzystaniu dzikiej populacji o naturalnej różnorodności genetycznej. Pod tym względem przypomina zjawisko, które po raz pierwszy zauważył James Baldwin (1896). Oznacza to, że osobniki w populacji z „właściwymi” kombinacjami alleli mogą wybrać nowe środowisko i w ten sposób trwale zmienić ewolucyjny rozwój w tym środowisku. Przypomina ideę Waddingtona, jak sam rozpoznał, ponieważ nie wymaga nowych mutacji. Niedawno Karl Popper, wielki logik nauki, również zwrócił uwagę na możliwe znaczenie asymilacji genetycznej bez mutacji w teorii ewolucji (Niemann, 2014 Noble, 2014). Popper i Waddington brali udział w dyskusjach na temat biologii ewolucyjnej w latach 30. i 40., kiedy dziedzina biologii molekularnej dopiero się rozwijała (Niemann, 2014).

Świętując niedawny gwałtowny wzrost badań epigenetycznych (zob. Hoppeler, 2015 Knight, 2015), świętujmy również ojca epigenetyki, Conrada Waddingtona, który otworzył nam oczy na bogate możliwości adaptacji poprzez regulację epigenetyczną.


Dziedziczenie epigenetyczne a plastyczność

Docenienie roli chromatyny jako nośnika informacji epigenetycznej, która może propagować stany aktywnej i cichej aktywności podczas podziału komórki, pochodzi z badań nad różnymi procesami biologicznymi i organizmami modelowymi. Należą do nich, by wymienić tylko kilka, dziedziczenie heterochromatyny u drożdży, inaktywacja chromosomu X (proces, w którym jedna z kopii żeńskiego chromosomu X jest wyciszana) lub imprinting genomowy (represja specyficzna dla pochodzenia macierzystego niektórych genów) u ssaków wernalizacja (indukcja kwitnienia przez wystawienie na długotrwałe zimno w okresie zimowym) w roślinach efekt urozmaicenia (wyciszenie genu w niektórych komórkach poprzez jego nieprawidłowe zestawienie z heterochromatyną) w Drosophila. Badania te wykazały, że stany o zróżnicowanej ekspresji mogą być przenoszone przez podziały komórkowe, po ich ustanowieniu i przy braku oryginalnego sygnału. Badania nad przeprogramowaniem komórek w linii zarodkowej i wczesnej embriogenezy 19,20,21,22, podczas indukowanej pluripotencji (iPS)23,24 lub po przeniesieniu jądra somatycznego25,26 wykazały, że chromatyna i metylacja DNA działają jako ważne „bariery epigenetyczne” (ryc. 1), które zapobiegają zmianom w ekspresji genów i tożsamości komórek.

Systemy epigenetyczne (Ramka 1) obejmują kompleksy heterochromatyny (HP1 i H3K9me3 (trimetylacja histonu 3 lizyny 9)), Polycomb (PRC1 i PRC2) oraz Trithorax (COMPASS (złożone białka związane z SET1)). Uważa się, że kompleksy te utrwalają funkcjonalne odpowiedzi poprzez modyfikację białek histonowych w chromatynie i wiązanie własnych znaczników histonowych w celu zapewnienia stabilnego dziedziczenia. Rzeczywiście, nukleosomy podlegają ciągłej przebudowie, histony są wymieniane, a wszystkie odkryte do tej pory znaczniki DNA i histonów są odwracalne, chociaż szybkości wymiany i stabilność znaczników różnią się w różnych domenach genomowych27. Dlatego większość sygnałów regulacyjnych zostałaby szybko utracona przy braku ciasnych, samowzmacniających się pętli, które podtrzymują pamięć stanu chromatyny28. Ponadto dziedziczenie znaczników epigenetycznych poprzez podział komórek wymaga, aby przetrwały replikację DNA i mitozę (ryc. 2). Jest to szczególnie istotne w przypadku modyfikacji histonów, ponieważ nukleosomy nie mają systemu powielania opartego na matrycy DNA. Odkładanie się histonów rodzicielskich H3 i H4 następuje w obrębie kilkuset par zasad od ich pozycji sprzed replikacji, a po replikacji są one w przybliżeniu równomiernie rozmieszczone w cząsteczkach DNA wiodącej i opóźnionej nici potomnej, dzięki działaniu dedykowanych kompleksów molekularnych 29,30 . Czynniki dojrzewania chromatyny, w tym DNMT1–UHRF1, EZH2 i HP1, wykorzystują jądrowy antygen proliferacji komórek (PCNA – klamra DNA, która jest niezbędna do replikacji) lub białka kompleksu rozpoznającego początek (ORC) jako elementy wiążące 31,32,33,34 (Ryc. 2a). Ponadto komponenty Polycomb wykorzystują swoje czynniki zakotwiczające DNA do propagowania pamięci mitotycznej. Utrata elementów docelowej sekwencji DNA powoduje utratę białek PcG i wyciszenie genów w obrębie kilku podziałów komórkowych w Drosophila 35,36, chociaż niezależną od sekwencji propagację wyciszania można utrzymać w hodowli komórek ssaków37. Retencja mitotyczna składników regulatorowych (ryc. 2c), w tym czynników transkrypcyjnych i niektórych mechanizmów epigenetycznych opisanych powyżej 38,39, została dobrze udokumentowana w ostatnich latach40,41. Dziedziczenie poprzez mejozę jest również możliwe, przynajmniej do pewnego stopnia, jak pokazuje zdolność H3K27me3 zdeponowanego przez matkę do kontrolowania imprintingu DNA niezależnego od metylacji 42,43. Dodatkową możliwością jest to, że tylko część znaków może być przekazywana mejotycznie, ale może to wystarczyć do odtworzenia organizacji chromatyny w kolejnym pokoleniu44.

a, replikacja DNA podczas fazy S cyklu komórkowego jest wyzwaniem dla utrzymania znaczników nukleosomowych. Składniki epigenetyczne, takie jak HMT i UHRF1, oddziałują ze składnikami maszynerii replikacji DNA, takimi jak klamra PCNA, w celu odtworzenia domen chromatyny po przejściu widełek. Przypadek metylacji DNA jest przedstawiony schematycznie. Nowo zreplikowany DNA jest niemetylowany (puste lizaki, dla uproszczenia nie pokazano tu zmetylowanej matrycowej nici DNA). Kompleks UHRF1/DNMT1 związany z PCNA ułatwia remetylację hemimetylowanego DNA po replikacji DNA. b, Zarówno konstytutywna (z udziałem metylaz H3K9 i HP1), jak i fakultatywna (z udziałem PRC1 i PRC2) heterochromatyna, a także cechy euchromatyczne (obejmujące wzajemne oddziaływanie między PRC1, PRC2, Trithorax/COMPASS i ATP-zależnymi kompleksami przebudowy chromatyny) są stabilnie utrzymywane podczas interfazę, aby zapobiec niewłaściwemu przełączaniu przez geny ich stanów funkcjonalnych. SWI/SNF to kompleks przebudowy nukleosomów. CPodczas mitozy większość czynników związanych z chromosomem jest usuwana podczas kondensacji chromosomów, ale „zakładki mitotyczne” genów uzyskuje się poprzez utrzymanie kluczowych składników (takich jak niektóre czynniki transkrypcyjne lub polimeraza III RNA) związanych z ich docelowymi loci.

Ze względu na brak precyzyjnego procesu „replikacji” macierzystych nukleosomów oraz utratę wielu czynników wiążących DNA i składników związanych z chromatyną podczas mitozy i mejozy, dziedziczenie pojedynczych znaczników nukleosomów stwarza szczególne wyzwania 28 . Modelowanie matematyczne i dowody biologiczne sugerują, że dziedziczność chromatyny wymaga ustanowienia domen o wielkości kilku, a nawet setek kilozasad o wielkości 45,46,47. Rzeczywiście, obecnie wiadomo, że genom jest hierarchicznie zorganizowany w szereg struktur 3D, zaczynając od sprzężeń nukleosomowych, przez pętle chromatyny, do domen chromosomalnych zwanych domenami topologicznie asocjowanymi (TAD), a wreszcie do aktywnych lub represyjnych przedziałów i terytoriów chromosomowych 15, 46,48,49,50. TAD i kompartmenty mogą stabilizować stany funkcjonalne i napędzać własne dziedziczenie. Co więcej, wiele mechanizmów epigenetycznych często działa razem, aby stabilizować stany dziedziczne. Na przykład PRC2 współpracuje z kompleksami PRC1, a metylacja DNA jest podtrzymywana przez białka heterochromatyny i/lub szlaki małych RNA51. Podsumowując, dziedziczenie epigenetyczne może obejmować wiele warstw i zwykle wiąże się ze współpracą częściowo nakładających się sygnałów, początkowo zależnych od sekwencji DNA (wywoływanej przez wiązanie czynnika transkrypcyjnego lub mechanizmy za pośrednictwem RNA). Każda z tych warstw dodaje pewien stopień stabilności, ale każda z nich jest również odwracalna, umożliwiając plastyczność w obecności wskazówek regulacyjnych 47,52 . Dziedziczenie stanów chromatyny przy braku domen chromatyny lub bez mechanizmów samowzmacniających jest trudniejsze28. Może to wymagać zachowania czynników transkrypcyjnych, wariantów histonów i modyfikatorów histonów podczas replikacji DNA i zakładek mitotycznych 53 .


Epigenetyka: nauka o zmianie

Przez prawie sto lat po tym, jak termin „epigenetyka” po raz pierwszy pojawił się na drukowanej stronie, naukowcy, lekarze i inni grzebali w ciemnych szczelinach genu, próbując rozwikłać wskazówki, które sugerowały, że funkcja genu może zostać zmieniona przez coś więcej niż tylko zmiany kolejno. Obecnie wiele różnych chorób, zachowań i innych wskaźników zdrowia ma już pewien poziom dowodów łączący je z mechanizmami epigenetycznymi, w tym z nowotworami prawie wszystkich typów, dysfunkcjami poznawczymi oraz chorobami układu oddechowego, sercowo-naczyniowego, rozrodczego, autoimmunologicznego i neurobehawioralnego. Znane lub podejrzewane czynniki odpowiedzialne za procesy epigenetyczne obejmują wiele czynników, w tym metale ciężkie, pestycydy, spaliny z silników Diesla, dym tytoniowy, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, hormony, radioaktywność, wirusy, bakterie i podstawowe składniki odżywcze.

W ciągu ostatnich pięciu lat, a zwłaszcza w ciągu ostatniego roku lub dwóch, kilka przełomowych badań skupiło nową uwagę na epigenetyce. Zainteresowanie wzrosło, gdy stało się jasne, że zrozumienie epigenetyki i epigenomiki — rozmieszczenia zmian epigenetycznych w całym genomie — będzie niezbędne w pracach związanych z wieloma innymi tematami wymagającymi dokładnego zrozumienia wszystkich aspektów genetyki, takich jak komórki macierzyste, klonowanie, starzenie się , biologia syntetyczna, ochrona gatunków, ewolucja i rolnictwo.

Wiele mechanizmów

Słowo „epigenetyczny” dosłownie oznacza „oprócz zmian w sekwencji genetycznej”. Termin ewoluował, aby obejmować dowolny proces, który zmienia aktywność genów bez zmiany sekwencji DNA i prowadzi do modyfikacji, które mogą być przekazywane do komórek potomnych (chociaż eksperymenty pokazują, że niektóre zmiany epigenetyczne można odwrócić). Prawdopodobnie nadal będzie trwać debata na temat tego, co dokładnie oznacza termin i co obejmuje.

Zidentyfikowano wiele typów procesów epigenetycznych — obejmują one metylację, acetylację, fosforylację, ubikwitylację i sumolację. W miarę postępu prac prawdopodobnie pojawią się inne mechanizmy i rozważania epigenetyczne. Procesy epigenetyczne są naturalne i niezbędne dla wielu funkcji organizmu, ale jeśli zachodzą niewłaściwie, mogą wystąpić poważne niekorzystne skutki zdrowotne i behawioralne.

Być może najbardziej znanym procesem epigenetycznym, po części dlatego, że najłatwiej było go badać za pomocą istniejącej technologii, jest metylacja DNA. Jest to dodanie lub usunięcie grupy metylowej (CH3), głównie tam, gdzie zasady cytozyny występują kolejno. Po raz pierwszy potwierdzono, że metylacja DNA występuje w ludzkim raku w 1983 roku i od tego czasu jest obserwowana w wielu innych chorobach i stanach zdrowia.

Innym ważnym procesem epigenetycznym jest modyfikacja chromatyny. Chromatyna to kompleks białek (histonów) i DNA, który jest ciasno związany, aby dopasować się do jądra. Kompleks może być modyfikowany przez substancje, takie jak grupy acetylowe (proces zwany acetylacją), enzymy i niektóre formy RNA, takie jak mikroRNA i małe interferujące RNA. Ta modyfikacja zmienia strukturę chromatyny, aby wpływać na ekspresję genów. Ogólnie rzecz biorąc, ciasno pofałdowana chromatyna ma tendencję do wyłączania lub braku ekspresji, podczas gdy bardziej otwarta chromatyna jest funkcjonalna lub ulega ekspresji.

Jednym z efektów takich procesów jest nadruk. W genetyce imprinting opisuje stan, w którym jeden z dwóch alleli typowej pary genów jest wyciszany przez proces epigenetyczny, taki jak metylacja lub acetylacja. Staje się to problemem, jeśli wyrażony allel jest uszkodzony lub zawiera wariant, który zwiększa podatność organizmu na drobnoustroje, czynniki toksyczne lub inne szkodliwe substancje. Imprinting został po raz pierwszy zidentyfikowany w kukurydzy w 1910 roku, a po raz pierwszy potwierdzony u ssaków w 1991 roku.

Naukowcy zidentyfikowali około 80 ludzkich genów, które można wdrukować, chociaż liczba ta jest przedmiotem debaty, ponieważ siła dowodów jest różna. Ta przybliżona liczba prawdopodobnie nie wzrośnie znacznie w nadchodzących latach, pisze zespół, w tym Ian Morison, starszy pracownik naukowy w Laboratorium Genetyki Raka na Uniwersytecie Otago w Nowej Zelandii, w sierpniu 2005 r. Trendy w genetyce. Inni w tej dziedzinie nie zgadzają się. Randy Jirtle, profesor radioterapii onkologicznej w Duke University Medical Center, i jego koledzy oszacowali w wydaniu z czerwca 2005 roku Badania genomu że u myszy może być około 600 odciskanych genów w wywiadzie z października 2005 r. Jirtle powiedział, że przewiduje podobny wynik dla ludzi, mimo że znane odciskane geny myszy i ludzi pokrywają się tylko w około 35%.

Linki do choroby

Spośród wszystkich przeprowadzonych dotychczas badań epigenetycznych, najdokładniej zbadaną chorobą jest rak, a dowody łączące procesy epigenetyczne z rakiem stają się „niezwykle przekonujące”, mówi Peter Jones, dyrektor Norris Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Południowej Kalifornii. W połowie świata Toshikazu Ushijima jest tego samego zdania. Szef wydziału rakotwórczości japońskiego Narodowego Centrum Badań nad Rakiem mówi, że mechanizmy epigenetyczne są jednym z pięciu najważniejszych czynników w dziedzinie raka i odpowiadają za jedną trzecią do połowy znanych zmian genetycznych.

Zwrócono uwagę na wiele innych problemów zdrowotnych. Efekty epigenetycznego układu odpornościowego występują i można je odwrócić, zgodnie z badaniami opublikowanymi w numerze magazynu listopad-grudzień 2005 r. Journal of Proteome Research Nilamadhab Mishra, adiunkt reumatologii w Wake Forest University School of Medicine i jego współpracownicy. Zespół twierdzi, że jest pierwszym, który ustalił specyficzne powiązanie między nieprawidłową modyfikacją histonów a mechanizmami leżącymi u podstaw objawów podobnych do tocznia u myszy, i potwierdził, że lek na etapie badań, trichostatyna A, może odwrócić te modyfikacje. Wydaje się, że lek resetuje nieprawidłową modyfikację histonów poprzez korygowanie hipoacetylacji w dwóch miejscach histonów.

Toczeń był również przedmiotem zainteresowania Bruce'a Richardsona, szefa Sekcji Reumatologii w Ann Arbor Veterans Affairs Medical Center i profesora University of Michigan Medical School. W badaniach opublikowanych w numerze maj-sierpień 2004 r Międzynarodowe recenzje immunologii oraz w wydaniu z października 2003 r Immunologia klinicznazauważył, że farmaceutyki, takie jak lek nasercowy prokainamid i środek przeciwnadciśnieniowy hydralazyna, powodują tocznia u niektórych osób i wykazał, że choroba toczniopodobna u myszy narażonych na działanie tych leków jest powiązana ze zmianami metylacji DNA i przerwaniem szlaków sygnałowych podobnych do te w ludziach.

Istotne zmiany

Uważa się, że większość modyfikacji epigenetycznych, niezależnie od mechanizmu, jest usuwana z każdym nowym pokoleniem, podczas gametogenezy i po zapłodnieniu. Jednak jeden z bardziej zaskakujących raportów opublikowanych w 2005 roku kwestionuje to przekonanie i sugeruje, że zmiany epigenetyczne mogą trwać w co najmniej czterech kolejnych pokoleniach organizmów.

Michael Skinner, profesor biologii molekularnej i dyrektor Center for Reproductive Biology na Washington State University, wraz z zespołem opisanym w wydaniu z 3 czerwca 2005 r. Nauki ścisłe jak krótko wystawili ciężarne szczury na indywidualne stosunkowo wysokie poziomy insektycydu metoksychlor i fungicydu winklozoliny i udokumentowali skutki, takie jak zmniejszona produkcja plemników i zwiększona niepłodność samców u samców. Szukając więcej informacji, odkryli zmienioną metylację DNA dwóch genów. Kontynuując eksperyment, odkryli, że niekorzystne skutki utrzymywały się u około 90% samców we wszystkich czterech kolejnych pokoleniach, które obserwowali, bez dodatkowej ekspozycji na pestycydy.

Nie wiadomo, czy wyniki zostały odtworzone. Jeśli jednak są odtwarzalne, może to „zapewnić nowy paradygmat etiologii chorób i podstawowych mechanizmów w toksykologii i ewolucji, których wcześniej nie doceniano” – mówi Skinner. On i jego koledzy prowadzą dalsze badania, oceniając wiele innych genów i przyglądając się innym skutkom, takim jak guzy piersi i skóry, zwyrodnienie nerek i wady krwi.

Inne badania wykazały, że efekty epigenetyczne występują nie tylko w łonie matki, ale przez cały okres ludzkiego życia. Manel Esteller, dyrektor Laboratorium Epigenetyki Raka w Hiszpańskim Narodowym Centrum Onkologicznym w Madrycie, wraz z kolegami zbadali 40 par bliźniąt jednojajowych w wieku od 3 do 74 lat i znaleźli uderzający trend, opisany w numerze z 26 lipca 2005 r. Materiały Narodowej Akademii Nauk. Młodsze pary bliźniaków i te, które prowadziły podobny styl życia i spędziły ze sobą więcej lat, miały bardzo podobne wzorce metylacji DNA i acetylacji histonów. Ale starsze bliźnięta, zwłaszcza te, które prowadziły inny tryb życia i spędziły razem mniej lat, miały wiele różnych wzorców w wielu różnych tkankach, takich jak limfocyty, nabłonkowe komórki jamy ustnej, tłuszcz w jamie brzusznej i wybrane mięśnie.

Jako jeden z przykładów, naukowcy odkryli cztery razy więcej genów o zróżnicowanej ekspresji między parą 50-letnich bliźniąt w porównaniu z 3-letnimi bliźniakami i 50-letnim bliźniakiem z większą hipometylacją DNA i hiperacetylacją histonów ( zmiany epigenetyczne zwykle związane z aktywnością transkrypcyjną) miały większą liczbę genów ulegających nadekspresji. Stopień zmiany epigenetycznej był zatem bezpośrednio związany ze stopniem zmiany funkcji genetycznej.

Czasami efekty mechanizmów epigenetycznych ujawniają się w żywych kolorach. Zmiany w pigmentacji sierści mysich szczeniąt, od żółtej do brązowej, były bezpośrednio związane z suplementacją diety ciężarnej matki witaminą B12, kwas foliowy, cholina i betaina, według badań Jirtle i Roberta Waterlanda opublikowanych w sierpniu 2003 r. (wydanie 15) w Biologia molekularna i komórkowa. Zmiany koloru były bezpośrednio związane ze zmianami metylacji DNA. W badaniu opublikowanym w kwietniowym wydaniu EHPJirtle i jego koledzy również wywołali te zmiany poprzez przyjmowanie przez matkę genisteiny, głównego fitoestrogenu w soi, w dawkach porównywalnych do tych, jakie człowiek mógłby otrzymać na diecie bogatej w soję. Ponadto wydaje się, że zmiany metylacji chronią potomstwo myszy przed otyłością w wieku dorosłym, chociaż istnieją przesłanki, że genisteina może również powodować problemy zdrowotne poprzez addytywne lub synergistyczne działanie na metylację DNA, gdy wchodzi w interakcje z innymi substancjami, takimi jak kwas foliowy.

Inne siły napędowe zmian

Substancje nie są jedynymi źródłami zmian epigenetycznych. Metody lizania, pielęgnowania i pielęgnowania, które samice szczurów stosują ze swoimi młodymi, mogą wpływać na długoterminowe zachowanie ich potomstwa, a wyniki te mogą być powiązane ze zmianami w metylacji DNA i acetylacji histonów w promotorze genu receptora glukokortykoidowego w hipokampie szczenięcia . To odkrycie zostało opublikowane w wydaniu z sierpnia 2004 r Neuronauka przyrody autorstwa Moshe Szyfa, profesora na Wydziale Farmakologii i Terapii Uniwersytetu McGill oraz jego współpracowników. W tym samym badaniu naukowcy odkryli, że efekty nie były wyryte w kamieniu, podawanie trichostatyny A starszym szczeniętom może pomóc w odwróceniu skutków złej opieki matczynej, jaką otrzymali, gdy były młodsze. W dniu 6 czerwca 2003 r. Czasopismo Chemii Biologicznej oraz 23 listopada 2005 r. Dziennik NeuronaukiSzyf i wielu z tych samych współpracowników wykazali również, że podawanie aminokwasu l-metioniny starszym szczeniętom może zniweczyć korzyści płynące z wysokiej jakości opieki matczynej, jaką otrzymują, gdy były młodsze.

Arturas Petronis, szef Laboratorium Epigenetyki Rodziny Krembil w Centrum Uzależnień i Zdrowia Psychicznego w Toronto, mówi, że wraz z zachowaniem na zdrowie psychiczne mogą wpływać zmiany epigenetyczne. Jego laboratorium jest jednym z pierwszych na świecie i wciąż jednym z niewielu, które bada powiązania między epigenetyką a psychiatrią. On i jego koledzy prowadzą szeroko zakrojone badania nad powiązaniami między schizofrenią a nieprawidłową metylacją i mówi, że zrozumienie mechanizmów epigenetycznych jest jednym z najwyższych priorytetów w badaniach nad biologią chorób człowieka. „Naprawdę potrzebujemy radykalnej zmiany kluczowych zasad tradycyjnego programu badań genetycznych”, mówi. „Epigenetyka wnosi nowe spojrzenie na stary problem i nowe narzędzia analityczne, które pomogą przetestować teorię epigenetyczną”. Sugeruje, że należy położyć większy nacisk na badanie procesów nie-Mendlowskich w chorobach takich jak schizofrenia, astma, stwardnienie rozsiane i cukrzyca.

Ostatnia dekada była również owocna w rozwijaniu silnych powiązań między nieprawidłową metylacją DNA a starzeniem się, mówi Jean-Pierre Issa, profesor medycyny na University of Texas, MD Anderson Cancer Center. Przedstawił on informacje na temat starzenia się i efektów epigenetycznych na konferencji w listopadzie 2005 r. zatytułowanej „Epigenomika środowiskowa, imprinting i podatność na choroby”, która odbyła się w Durham w Karolinie Północnej i była częściowo sponsorowana przez NIEHS. Niektóre z najsilniejszych dowodów sprzed dekady wskazują na postępujący wzrost metylacji DNA w starzejących się tkankach okrężnicy, a nowsze dowody łączą hipermetylację z miażdżycą. Zmienioną, związaną z wiekiem metylację stwierdzono również w tkankach żołądka, przełyku, wątrobie, nerkach i pęcherzu, a także w typach tkanek badanych przez Estellera. Wiele z obecnych prac Issy koncentruje się na powiązaniach między procesami epigenetycznymi, starzeniem się, środowiskiem i rakiem oraz możliwymi sposobami terapeutycznego odwrócenia metylacji związanej z rakiem.

Obecne i przyszłe kłopoty

Zgromadzone dowody wskazują, że wiele genów, chorób i substancji środowiskowych jest częścią obrazu epigenetycznego. Jednak dowody są wciąż zbyt skąpe, aby stanowić podstawę dla jakichkolwiek nadrzędnych teorii na temat tego, które substancje i które geny docelowe najprawdopodobniej pośredniczą w niekorzystnym wpływie środowiska na choroby, mówi Melanie Ehrlich, profesor biochemii w Tulane University School of Centrum Medycyny i Onkologii Tulane, które od ponad dwóch dekad prowadzi badania na ten temat.

To poczucie niepewności generalnie wyklucza epigenetykę z obrazu regulacji. „W tej chwili jest [za wcześnie], aby z niego korzystać” – mówi Julian Preston, pełniący obowiązki dyrektora ds. zdrowia w Narodowym Laboratorium Badawczym EPA ds. Zdrowia i Skutków Środowiskowych. Ale Preston mówi, że agencja już teraz w większym stopniu polega na lepszym zrozumieniu procesów mechanistycznych, w tym epigenetyki, a EPA podejmuje wyraźny wysiłek, aby rozszerzyć wysiłki w zakresie genomiki zarówno w agencji, jak i z innymi, z którymi agencja współpracuje.

W FDA naukowcy badają wiele leków, które działają poprzez mechanizmy epigenetyczne (chociaż, jak zauważa rzeczniczka Christine Parker, agencja opiera swoje zgody na wynikach badań klinicznych, a nie na mechanizmie działania leku). Jeden z takich leków, azacytydyna, został zatwierdzony do stosowania w Stanach Zjednoczonych w leczeniu zespołu mielodysplastycznego, choroby krwi, która może rozwinąć się w białaczkę. Lek uruchamia geny, które zostały wyłączone przez metylację. Funkcja epigenetyczna leku nie czyni go jednak „cudownym lekiem”. Badania wykazały, że przynosi on korzyści tylko 15% osobom, które go przyjmują, a wysoki odsetek osób cierpi z powodu poważnych skutków ubocznych, w tym nudności (71%), anemii (70%), wymiotów (54%) i gorączki (52%).

Ehrlich wskazuje, że azacytydyna ma również działanie na poziomie molekularnym – takie jak hamowanie replikacji DNA i apoptozy – które mogą być częścią jej terapeutycznych korzyści. Mieszane wyniki leku można również częściowo wyjaśnić badaniem opublikowanym w październikowym wydaniu Komórka rakowa Andrew Feinberg, dyrektor Centrum Epigenetyki Powszechnych Chorób Ludzkich Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa i jego współpracownicy. Odkryli, że każdy z dwóch testowanych leków, trichostatyna A i 5-aza-2′-deoksycytydyna (związana z azacytydyną), może aktywować setki genów, a także wyłączać setki innych. Jeśli to odkrycie utrzymuje się w innych badaniach, sugeruje to jeden z kluczowych powodów, dla których tak trudno jest stworzyć lek, który nie powoduje niezamierzonych skutków ubocznych.

Publiczny i prywatny

Pomimo potencjalnie ogromnej roli, jaką epigenetyka może odgrywać w chorobach człowieka, inwestycje w ten obszar badań pozostają niewielkie w porównaniu z tymi, które poświęcono tradycyjnej genetyce. Kilka prób zmiany, które są w toku.

W Europie Human Epigenome Project został oficjalnie uruchomiony w 2003 roku przez Wellcome Trust Sanger Institute, Epigenomics AG oraz Centre National de Génotypage. Grupa koncentruje się na badaniach nad metylacją DNA związaną z chromosomami 6, 13, 20 i 22. Niedługo mogą do nich dołączyć organizacje w Niemczech i Indiach, gdzie naukowcy planują pracować odpowiednio nad chromosomami 21 i X, mówi starszy badacz Sanger Stephan Skinienie.

Jednak kompleksowe badanie wszystkich czynników epigenetycznych i epigenomicznych związanych z wieloma chorobami i stanami zdrowia będzie wymagało znacznie więcej pracy. „[Kompleksowy] projekt ludzkiego epigenomu jest o wiele bardziej skomplikowany niż projekt ludzkiego genomu” — mówi Jones. „Istnieje tylko jeden genom, [ale] epigenom różni się w każdej tkance”. Projekt Ludzkiego Genomu był ogólnoświatowym wysiłkiem, którego ukończenie zajęło ponad dekadę i miliardy dolarów.

Jones i Robert Martienssen odnieśli się do niektórych złożoności kompleksowego, ogólnoświatowego Projektu Epigenomu Ludzkiego w wydaniu z 15 grudnia 2005 r. Badania nad rakiem. Relacjonując warsztaty z czerwca 2005 r. zwołane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Badań nad Rakiem, doszli do wniosku, że pomimo wszystkich pojawiających się trudności taki projekt jest niezbędny, a technologia jest wystarczająco zaawansowana, aby rozpocząć.

„Myślę, że stanie się to znacznie wcześniej, niż myślałem zaledwie rok temu” — mówi Jirtle. Grupa badaczy już rozpoczęła pracę nóg w celu uruchomienia amerykańskiego uzupełnienia wysiłków Europejskiego Projektu Epigenomu Człowieka [patrz ramka, s. A165].

Inne wysiłki zyskują na popularności. Inna europejska grupa, Epigenome Network of Excellence, wystartowała w czerwcu 2004 r. Ta sieć wymiany informacji obejmuje członków z sektora publicznego i prywatnego rozsianych po dziesięciu krajach Europy Zachodniej. Ich celem jest koordynacja badań, zapewnienie mentorów i zachęcanie do dialogu za pośrednictwem ich strony internetowej. A w Azji konferencja, która odbyła się w dniach 7–10 listopada 2005 r. w Tokio, „Genome-Wide Epigenetics 2005”, była w dużej mierze poświęcona ułatwieniu skoordynowanych wysiłków badawczych w dziedzinie epigenomiki w Japonii i prawdopodobnie w całej Azji, mówi Ushijima, jeden z uczestników konferencji. organizatorzy.

W Stanach Zjednoczonych Narodowy Instytut Raka i Narodowy Instytut Badań nad Genomem Człowieka formalnie rozpoczęły 13 grudnia 2005 r. duży wysiłek, który będzie obejmował prace nad epigenomią. Projekt pilotażowy The Cancer Genome Atlas, finansowany przez oba instytuty kwotą 50 milionów dolarów każdy, ma na celu stworzenie podstaw do kompleksowych badań nad czynnikami genomowymi związanymi z rakiem u ludzi. Oczekuje się, że początkowe trzyletnie wysiłki skupią się na zaledwie dwóch lub trzech z ponad 200 znanych nowotworów, ale jeśli odniesie sukces w opracowywaniu metod i technologii, liczba ocenianych nowotworów może się zwiększyć. Jeśli w końcu przeanalizuje się dużą liczbę genów nowotworowych, wysiłek będzie równoznaczny z tysiącami Projektów Ludzkiego Genomu.

Aby pomóc przesuwać granice dalej, NIEHS i National Cancer Institute są w trakcie przyznawania grantów w wysokości 3,75 miliona dolarów na badanie szerokiego zakresu tematów epigenetycznych, takich jak identyfikacja populacji wysokiego ryzyka, wpływ diety na raka i szczegółowe badania wielu specyficznych mechanizmów łączących czynniki środowiskowe z mechanizmami epigenetycznymi i wynikającą z nich chorobą. Oczekuje się, że kilkunastu odbiorców rozpocznie swoje projekty do jesieni 2006 roku.

NIEHS rozpoczął również włączanie projektów epigenomicznych do swojego portfolio badawczego w ciągu ostatnich pięciu do sześciu lat. „To rozwijający się obszar, który jest bardzo ważny”, mówi Frederick Tyson, administrator programu w Dziale Badań i Szkoleń Zaocznych NIEHS. Według dyrektora instytutu Davida Schwartza, epigenetyka będzie prawdopodobnie jednym z pół tuzina najważniejszych kwestii, gdy NIEHS realizuje swój Projekt Genomu Środowiskowego.

Towarzystwo Metylacji DNA, grupa zawodowa, rozwija się powoli, ale stale w ciągu ostatniej dekady, mówi założyciel i obecny wiceprezes Ehrlich. W ramach swoich starań towarzystwo uruchomiło pismo, Epigenetyka, w styczniu 2006 roku w celu objęcia pełnego spektrum rozważań epigenetycznych — medycznych, żywieniowych, psychologicznych, behawioralnych — w każdym organizmie. Takie grupy są cennym punktem zbiorczym w tej dziedzinie, mówi Jirtle. On sam powoli wszedł w epigenetykę od początkowego ogniska raka, a jego segue jest typowe dla wielu. „Jeśli studiujesz epigenetykę, nie masz domu, w którym pochodzimy z różnych dziedzin”, mówi.

Wzrasta również zainteresowanie sektorem prywatnym. Na przykład Epigenomics AG z biurami w Berlinie i Seattle pracuje nad wczesnym wykrywaniem i diagnozowaniem raka i endometriozy (w przypadku których istnieją ograniczone dowody na element epigenetyczny), a także opracowywaniem produktów do przewidywania skuteczności leków do leczenia te choroby. Założona w 1998 roku, a obecnie zatrudniająca około 150 pracowników, firma koncentruje się na mechanizmach metylacji DNA i współpracuje z takimi firmami, jak Abbott Laboratories, Johnson & Johnson, Philip Morris, Roche Diagnostics, Pfizer i AstraZeneca. CEO Oliver Schacht mówi, że rosnące zainteresowanie tą dziedziną jest typowe dla różnicy między konferencją American Association for Cancer Research w 2004 roku, na której odbyło się około pół tuzina wykładów lub plakatów na temat epigenetyki, a wydarzeniem w 2005 roku, na którym odbyło się około 200.

Czas narzędzia

Wielu obserwatorów twierdzi, że jeśli praca epigenetyczna ma nadal przełamywać nowe obszary, technologia będzie musiała dalej się rozwijać. Jones i Martienssen zauważają w swoim artykule, że muszą istnieć dodatkowe ulepszenia w wysokowydajnych technologiach, technikach analitycznych, zdolnościach obliczeniowych, badaniach mechanistycznych i strategiach bioinformatycznych. Mówią również, że istnieje zapotrzebowanie na podstawowe, takie jak standaryzowane odczynniki i stałe zaopatrzenie w przeciwciała do testów.

Preston zgadza się z wieloma z tych pomysłów i mówi, że istnieje również potrzeba opracowania kompleksowego zestawienia wszystkich białek w komórce i uzyskania lepszych informacji o modyfikacji białek. Twierdzi, że uniwersytety dostrzegają zapotrzebowanie na talenty potrzebne do rozwiązywania problemów epigenomicznych i intensyfikują wysiłki, aby na różne sposoby omawiać te tematy, zwłaszcza na poziomie szkół podyplomowych.

Inne grupy robią swoją część, tworząc narzędzia do dalszego rozwoju pola. Wszystkie odciśnięte geny zidentyfikowane do tej pory są śledzone w ramach uzupełniających wysiłków grup Morisona i Jirtle'a oraz Jednostki Genetyki Ssaków Brytyjskiej Rady ds. Badań Medycznych. Europejscy menedżerowie bazy danych metylacji DNA stworzyli kompendium znanych metylacji DNA, które choć nie jest wyczerpujące, nadal stanowi użyteczne narzędzie dla badaczy badających około 22 000 ludzkich genów.

Kunio Shiota, profesor biochemii komórkowej na Uniwersytecie Tokijskim i jeden ze współorganizatorów tokijskiej konferencji z listopada 2005 r., mówi, że postępy epigenetyczne będą częściowo polegać na szeregu procesów, które powoli stają się znane większej liczbie badaczy – masowo równoległych. sekwencjonowanie sygnaturowe (MPSS), analiza mikromacierzy immunoprecypitacji chromatyny (chIP-chip), identyfikacja metylotransferazy adeninowej DNA (Dam-ID), mikromacierze wiążące białka (PBM), analiza mikromacierzy immunoprecypitacji DNA (chip DIP) i inne. Mówi, że pewnego dnia terminy te mogą stać się w pełni tak znane, jak MRI i EKG.

Gwałtownie rosnąca akceptacja epigenetyki, sto lat po jej pojawieniu się, jest, zdaniem Jirtle'a, ogromnym krokiem naprzód. „Do tej pory praktycznie nic nie zrobiliśmy” – mówi. „Jestem stronniczy, ale wierzchołek góry lodowej to genomika i polimorfizmy pojedynczych nukleotydów. Dno góry lodowej to epigenetyka”.


III. GENETYKA

A. Podatność genetyczna

1. Badania asocjacyjne całego genomu

W ostatniej dekadzie nastąpiła eksplozja badań mających na celu zrozumienie, w jaki sposób zmienność genetyczna przyczynia się do powstawania chorób. Te badania populacyjne, znane jako badania asocjacyjne całego genomu, mają na celu wykrycie wariantów genetycznych, najczęściej polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), które są powiązane ze złożonymi cechami w populacjach (np. podatność na raka). 30 Ostatnie badania na ludziach i psach z kostniakomięsakiem ujawniły wiele SNP związanych z ryzykiem rozwoju kostniakomięsaka. 31,32

W ciągu ostatnich 15 lat opublikowano wiele badań łączących wspólne warianty genetyczne z ryzykiem wystąpienia kostniakomięsaka. 33� Podczas gdy w tych badaniach ryzyko SNP powiązano ze szlakami biologicznymi o znanym znaczeniu dla osteosarkomagenezy, ich moc statystyczna została ograniczona przez małą wielkość próby ze względu na rzadkość występowania tego typu nowotworu. Niedawno opublikowane badanie miało na celu przezwyciężenie takich ograniczeń poprzez międzynarodową współpracę porównującą genotypy 941 przypadków kostniakomięsaka u ludzi z 3291 kontrolnymi. Dane z tego badania wykazały istotny związek 3 SNP z ryzykiem kostniakomięsaka. Pierwszy (rs1906953 P = 8,1 × 10 𢄩) znajduje się w obrębie intronu 7 metabotropowego receptora glutaminianu 4 (GRM4) gen w 6p21.3. 31 GRM4 odgrywa rolę w cyklicznej sygnalizacji AMP, która została powiązana z kostniakomięsakiem w wielu badaniach, 40,41 wskazując na jego prawdopodobną zdolność do zwiększania ryzyka kostniakomięsaka. Locus mapuje się do regionu nadwrażliwości na DNazę I w zestawie danych Encyclopedia of DNA Elements, co sugeruje, że może zawierać aktywne elementy regulatorowe. Drugi i trzeci SNP (rs7591996 i rs10208273 P = 1,0 × 10 𢄨 i 2,9 × 10 𢄧) są zlokalizowane na pustyni genów w 2p25.2. Chociaż żaden z tych wiodących SNP nie był powiązany z elementami regulatorowymi lub miejscami wiązania czynnika transkrypcyjnego w zestawie danych Encyklopedii elementów DNA, kilka zastępczych SNP wystąpiło w miejscach wiązania czynnika transkrypcyjnego lub zmienionych znanych motywach regulatorowych. 31

U psów domowych rozwija się kostniakomięsak, który ma wiele cech wspólnych z chorobą ludzką, w tym histologię guza, ekspresję genów, odpowiedź na chemioterapię i ryzyko przerzutów do płuc. 42 W związku z tym pies z kostniakomięsakiem stanowi cenny model do badania genów związanych z rakiem, opracowywania leków i markerów prognostycznych. Niedawno opublikowane badanie asocjacyjne całego genomu miało na celu zidentyfikowanie loci ryzyka kostniakomięsaka u 3 ras psów z wysokim ryzykiem kostniakomięsaka. Badanie objęło 286 chartów, 135 rottweilerów i 141 wilczarzy irlandzkich, przy stosunkowo równej liczbie przypadków i kontroli dla każdej rasy. W badaniu zidentyfikowano 33 dziedziczone loci ryzyka, które odpowiadają za 55�% wariancji fenotypu w obrębie rasy. SNP o najsilniejszym związku z rozwojem kostniakomięsaka u chartów znajdowało się 150 kilozasad powyżej CDKN2A/B geny, o których wiadomo, że odgrywają kluczową rolę w rozwoju i progresji kostniakomięsaka (patrz rozdział III, B, 3, a). Najwyższy SNP u rottweilerów i wilczarzy irlandzkich zmienia ewolucyjnie ograniczony element wzmacniający, który był aktywny w ludzkich komórkach kostniakomięsaka. Loci wśród wszystkich ras wzbogacono o geny pełniące kluczowe funkcje w różnicowaniu i rozwoju kości. 32

2. Zespoły genetyczne związane z kostniakomięsakiem

Zwiększone ryzyko kostniakomięsaka jest związane z wieloma dobrze zdefiniowanymi zespołami genetycznymi: dziedzicznym siatkówczakiem (mutacja germinalna Rb gen), zespół Li-Fraumeni (mutacja germinalna p53 gen), zespół Blooma (mutacja germinalna RECQL2 gen), zespół Wernera (mutacja germinalna RECQL3 genu) oraz zespół Rothmunda-Thomsona (mutacja germinalna RECQL4 gen). 43 Wiele z tych genów i szlaków jest często zmienianych przez mutacje somatyczne w guzach kostniakomięsaka, chociaż mechanizm mutacji jest często odmienny od tych mutacji germinalnych.

B. Somatyczne zmiany genetyczne w kostniakomięsaku

Jak wspomniano powyżej, rzadkość występowania kostniakomięsaka w populacji utrudnia kompleksowe analizy genetyczne i genomiczne. Odnotowano liczne badania, często badające tylko podzbiór powszechnych mutacji genetycznych w stosunkowo małych kohortach pacjentów lub linii komórkowych. Nic dziwnego, że takie badania utrudniają wiarygodną ocenę częstości i funkcjonalnych konsekwencji badanych nieprawidłowości genetycznych w kostniakomięsaku. W związku z tym częstości mutacji są często podawane jako zakres zidentyfikowany z wielu publikacji. Należy zauważyć, że obecnie trwają badania mające zastosowanie terapeutycznie w celu wygenerowania skutecznych metod leczenia osteosarcoma (http://ocg.cancer.gov/programs/target/projects/osteosarcoma). Jest to zakrojona na szeroką skalę, wieloinstytucjonalna współpraca mająca na celu kompleksową identyfikację aberracji genetycznych i epigenetycznych w kostniakomięsaku przy użyciu kombinacji podejść genomicznych. Oczekuje się, że wyniki tego badania zostaną opublikowane w ciągu najbliższego roku i powinny rzucić nowe światło na genetyczne i epigenetyczne przyczyny kostniakomięsaka. Wysiłek ten przeniesie kostniakomięsaka w erę postgenomiczną, pozwalając na przeprowadzenie badań wkładu genetycznego w kostniakomięsaka in silico, co jest luksusem dostępnym w badaniach nad innymi częstszymi nowotworami, ale nie jest jeszcze możliwe w przypadku kostniakomięsaka.

1. Niejednorodność genetyczna

Jak opisano szczegółowo poniżej, krajobraz mutacyjny kostniakomięsaka jest bardzo złożony i różni się znacznie w zależności od guza. 5 Ten wysoki stopień niejednorodności międzyguzowej zaburza nasze rozumienie molekularnej patogenezy kostniakomięsaka i może wyjaśniać pewne trudności w identyfikacji środków terapeutycznych, które prawdopodobnie poprawią wyniki leczenia u pacjentów z kostniakomięsakiem.

2. Nieprawidłowości chromosomalne

Cechą charakterystyczną kostniakomięsaka jest niestabilność chromosomowa (CIN), 44,45 forma zmiany w całym genomie charakteryzująca się wysokim stopniem utraty i wzmocnienia pełnych chromosomów lub segmentów chromosomów. 46,47 Wykazano, że CIN jest wynikiem utraty funkcji w punktach kontrolnych cyklu komórkowego i szlaków odpowiedzi na uszkodzenia DNA. 48,49 Jak opisano poniżej, te szlaki mogą być rozregulowane w kostniakomięsaku zarówno poprzez mechanizmy genetyczne, jak i epigenetyczne. Wykazano, że nieprawidłowe utrzymywanie telomerów poprzez mechanizm znany jako alternatywne wydłużanie telomerów również powoduje CIN w kostniakomięsaku. 50,51

W przeciwieństwie do wielu innych mięsaków, kostniakomięsak nie ma kanonicznej translokacji ani mutacji genetycznej. 4,5,52� Osteomięsak jest raczej nowotworem charakteryzującym się rozległymi i niejednorodnymi nieprawidłowościami w liczbie i podstrukturze chromosomów. Ploidia kostniakomięsaka może wahać się od haploidii do heksaploidii. 52,58 Podczas gdy zidentyfikowano niezliczoną ilość strat/wzrostów chromosomów, chromosom 1 jest najczęściej uzyskiwany, a chromosomy 9, 10, 13 i 17 są najczęściej tracone. 52,58 Najczęstsze zmiany liczby kopii to delecje fragmentów chromosomów 3, 6, 9, 10, 13, 17 i 18 oraz amplifikacje fragmentów chromosomów 1, 6, 8 i 17. Regiony te kodują szereg odpowiednio supresory guza i onkogeny. 5

3. Supresory nowotworów

A. Ścieżka Rb

Rb jest krytycznym regulatorem G1Przejście cyklu komórkowego do S. W przypadku braku bodźców mitogennych, Rb pozostaje defosforylowany i wiąże się z czynnikami transkrypcyjnymi z rodziny E2F, zapobiegając ich aktywacji progresji cyklu komórkowego. Podczas normalnej mitozy jest to odwracane przez fosforylację Rb przez CDK4. Utrata funkcji Rb mutacje usuwają ten punkt kontrolny cyklu komórkowego. 59 Locus CDKN2A (znany również jako INK4A) koduje 2 funkcjonalnie i strukturalnie różne geny poprzez alternatywny splicing. Pierwszy, p16 INK4a , jest negatywnym regulatorem CDK4. Drugi, p14 ARF , jest kluczowym regulatorem p53 (patrz poniżej). Utrata p16 INK4a funkcja łagodzi negatywną regulację CDK4, powodując inaktywację Rb. 60 Tak więc mutacje w CDKN2A gen może fenokopiować utratę funkcji Rb mutacje.

Utrata funkcji Rb mutacje występują nawet w 70% przypadków kostniakomięsaka 61-64, najczęstszą jest utrata heterozygotyczności. 62,65,66 Inne rodzaje Rb mutacje obejmują rearanżacje strukturalne i mutacje punktowe. 61�,67� W jednym badaniu 70% pacjentów miało delecje lub rearanżacje w CDKN2A gen z potencjałem zmniejszania ekspresji lub funkcji p16 INK4a . 57,70�

B. p53 Ścieżka

p53 jest czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje krytyczne geny w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, progresję cyklu komórkowego i szlaki apoptozy. 74 p53 działa jako supresor nowotworu w zasadzie we wszystkich typach nowotworów, a na jego funkcję mogą wpływać mutacje samego genu lub mutacje wcześniejszych lub dalszych mediatorów jego aktywności. 75 s14 ARF normalnie działa sekwestrując ligazę ubikwityny E3 MDM2 w jąderku, zapobiegając promowaniu degradacji p53. 74 s14 ARF jest wyrażony z tego samego CDKN2A locus kodujący p16 INK4a (patrz wyżej). 60 Podobny do p16 INK4a w szlaku Rb, mutacje utraty funkcji w p14 ARF gen może fenokopiować mutacje do TP53. 74

Utrata funkcji TP53 mutacje występują aż w trzech czwartych przypadków kostniakomięsaka. 5 Mutacje te obejmują utratę alleli (75�%), rearanżacje (10�%), oraz mutacje punktowe (20– 30%). 76� Niedawne badanie wykazało, że 9,5% młodych pacjentów (<w wieku 30 lat) ze sporadycznym kostniakomięsakiem, noszącym rzadką linię zarodkową TP53 wariant egzoniczny lub kanoniczna mutacja Li-Fraumeni, ale te warianty są nieobecne u pacjentów, u których rozwinie się kostniakomięsak w późniejszym życiu. 84 Jak wspomniano powyżej, aż 70% guzów kostniakomięsaka zawiera mutacje mogące wpływać na p14 ARF ekspresję lub funkcję, a zatem zmienić funkcję p53. 57,70�

C. Inne leki przeciwnowotworowe

Inne supresory nowotworów związane z delecjami lub utratą heterozygotyczności w kostniakomięsaku obejmują: APC, BUB3, FGFR2, LSAMP, RECQL4, oraz WWOX. 65,85�

4. Onkogeny

A. Ścieżka Rb

Oszacowano, że E2F3 i CDK4, z których oba przeciwdziałają kontroli progresji cyklu komórkowego przez Rb, posiadają mutacje polegające na przejściu funkcji odpowiednio w 60% i 10% nowotworów. 88,98,99

B. p53 Ścieżka

MDM2 to ligaza ubikwityny E3, która działa jako negatywny regulator p53 (patrz powyżej). ten MDM2 Gen jest amplifikowany w 3�% guzów kostniakomięsaka. 61,99� COPS3 promuje również proteosomalną degradację p53 i szacuje się, że powoduje mutacje w celu uzyskania funkcji w 20�% kostniakomięsaków. 92,94,103�

C. c-Myc

c-Myc jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym, który działa jako ogólny wzmacniacz ekspresji genów, wzmacniając transkrypcję zasadniczo wszystkich genów z aktywnymi promotorami w danej komórce, 107,108 i jest dobrze opisanym onkogenem, który zyskał funkcję w większości typów nowotworów. 109 c-Myc jest amplifikowany w 7�% guzów kostniakomięsaka 88,94,103,110� i nadeksprymowany w co najmniej 34% guzów. 115 116

D. Inne onkogeny

Inne onkogeny związane z amplifikacją w kostniakomięsaku obejmują CDC5L, MAPK7, SPOTKAŁ, PIM1, PMP22, PRIM1, RUNX2, oraz VEGFA. 85,88,94,98,104,114,117� Łącznie odkrycie, że prawie wszechobecne zmiany w funkcjonowaniu szlaku Rb i p53 w kostniakomięsaku poprzez mutacje polegające na uzyskaniu i utracie funkcji wskazują, że utrata kontroli cyklu komórkowego i niewłaściwa odpowiedź na uszkodzenie DNA są kluczowymi czynnikami rozwoju kostniakomięsaka. Rola, jaką te zmiany genetyczne odgrywają w progresji guza i przerzutach, pozostaje jednak mniej jasna.

C. Mechanizmy aberracji genetycznych w kostniakomięsaku

Jak opisano powyżej, guzy kostniakomięsaka wykazują kompendium nieprawidłowości genetycznych o wysokim stopniu heterogeniczności międzyguzowej. Podczas gdy niektóre geny są powszechnie zmieniane w guzach, najczęstszą genetyczną cechą guzów kostniakomięsaka jest niezwykły zakres zmian genetycznych w stosunku do normalnej tkanki. Podobnie jak same mutacje, mechanizmy, dzięki którym te zmiany genetyczne są nabywane, prawdopodobnie reprezentują szerokie spektrum zarówno w obrębie guzów, jak i między nimi. Wiadomo, że w kostniakomięsaku występują klasycznie zdefiniowane tryby mutacji genetycznych. Na przykład mutacje punktowe są prawdopodobnie wynikiem błędów w replikacji DNA i późniejszym odczycie dowodowym, podczas gdy aneuploidia jest wynikiem błędów w segregacji chromosomów podczas podziału komórki. 126� Oprócz tych dobrze zdefiniowanych sposobów mutacji genetycznych, niedawno zidentyfikowano nowy mechanizm nabywania mutacji, znany jako chromothripsis. Termin ten opisuje zjawisko, w którym dochodzi do dziesiątek do setek rearanżacji genomowych podczas rozwoju raka w jednorazowym kryzysie komórkowym. Dzieje się to poprzez wzajemną wymianę materiału genetycznego w obrębie chromosomów lub pomiędzy nimi. W przeciwieństwie do stopniowego trybu nagromadzonych aberracji genetycznych w komórkach rakowych nabytych w wyniku pojedynczych zdarzeń mutacyjnych i późniejszej darwinowskiej selekcji klonalnej, model ten zakłada „przerywaną równowagę” jako podstawowy tryb ewolucji nowotworu. W swoim przełomowym artykule Stephens i in. 6 wykazali, że chromothripsis występuje w co najmniej 2𠄳% wszystkich nowotworów i około 33% guzów kostniakomięsaka.


Dziedziczenie epigenetyczne

Oczywiste jest, że przynajmniej niektóre modyfikacje epigenetyczne są dziedziczne, przekazywane z rodziców na potomstwo w zjawisku ogólnie określanym jako dziedziczenie epigenetyczne lub przekazywane z pokolenia na pokolenie poprzez międzypokoleniowe dziedziczenie epigenetyczne. Mechanizm dziedziczenia informacji epigenetycznej jest niejasny, wiadomo jednak, że informacja ta, ponieważ nie jest uchwycona w sekwencji DNA, nie jest przekazywana przez ten sam mechanizm, który stosuje się w przypadku typowej informacji genetycznej. Typowa informacja genetyczna jest zakodowana w sekwencjach nukleotydów tworzących DNA, dlatego informacja ta jest przekazywana z pokolenia na pokolenie tak wiernie, jak dokładny jest proces replikacji DNA. W rzeczywistości wiele modyfikacji epigenetycznych jest spontanicznie „wymazywanych” lub „resetowanych”, gdy komórki rozmnażają się (czy to przez mejozę, czy mitozę), uniemożliwiając w ten sposób ich dziedziczenie.


Epigenetyka: definicje i przykłady

Epigenetyka dosłownie oznacza „powyżej” lub „na szczycie” genetyki. Odnosi się do zewnętrznych modyfikacji DNA, które włączają lub wyłączają geny. Te modyfikacje nie zmieniają sekwencji DNA, ale zamiast tego wpływają na sposób „odczytywania” genów przez komórki.

Przykłady epigenetyki

Zmiany epigenetyczne zmieniają fizyczną strukturę DNA. Jednym z przykładów zmiany epigenetycznej jest metylacja DNA — dodanie grupy metylowej lub „czapki chemicznej” do części cząsteczki DNA, co zapobiega ekspresji niektórych genów.

Innym przykładem jest modyfikacja histonów. Histony to białka, wokół których owija się DNA. (Bez histonów DNA byłoby zbyt długie, aby zmieścić się w komórkach.) Jeśli histony mocno ściskają DNA, komórka nie może „odczytać” DNA. Modyfikacje, które rozluźniają histony, mogą uczynić DNA dostępnym dla białek, które „odczytują” geny.

Dzięki epigenetyce komórka skóry wygląda inaczej niż komórka mózgowa lub komórka mięśniowa. Wszystkie trzy komórki zawierają to samo DNA, ale ich geny ulegają różnej ekspresji (włączone lub wyłączone), co powoduje powstanie różnych typów komórek.

Dziedziczenie epigenetyczne

Możliwe jest przekazanie zmian epigenetycznych przyszłym pokoleniom, jeśli zmiany zachodzą w plemnikach lub komórkach jajowych. Większość zmian epigenetycznych zachodzących w plemnikach i komórkach jajowych zostaje wymazana, gdy łączą się w zapłodnioną komórkę jajową w procesie zwanym „przeprogramowaniem”. To przeprogramowanie pozwala komórkom płodu „zacząć od zera” i dokonywać własnych zmian epigenetycznych. Jednak naukowcy sądzą, że niektóre zmiany epigenetyczne w plemnikach i komórkach jajowych rodziców mogą uniknąć procesu przeprogramowania i przejść do następnego pokolenia. Jeśli to prawda, rzeczy takie jak jedzenie, które dana osoba spożywa przed poczęciem, mogą wpłynąć na ich przyszłe dziecko. Jednak nie zostało to udowodnione u ludzi.

Epigenetyka a rak

Naukowcy sądzą, że epigenetyka może odgrywać rolę w rozwoju niektórych nowotworów. Na przykład zmiana epigenetyczna, która wycisza gen supresorowy guza — taki jak gen, który kontroluje wzrost komórki — może prowadzić do niekontrolowanego wzrostu komórek. Innym przykładem może być zmiana epigenetyczna, która „wyłącza” geny, które pomagają naprawić uszkodzone DNA, prowadząc do wzrostu uszkodzeń DNA, co z kolei zwiększa ryzyko raka.


Podziękowanie

CDA i T.J. Jesteśmy wdzięczni wszystkim członkom naszego laboratorium, byłym i obecnym, a także naszym kolegom naukowym w tej dziedzinie za pomoc w „napisaniu” historii, którą tutaj omawiamy. Ich ciężka praca, spostrzeżenia i pasja do dziedziny epigenetyki sprawiły, że ostatnie 20 lat było tak przyjemną jazdą. Dziękujemy P. Jonesowi (Grand Rapids, Michigan, USA) i A. Tarakhovsky'emu (Nowy Jork, USA) za przekazanie nam opinii na temat tego rękopisu oraz M. Onishi-Seebacher (Freiburg, Niemcy) za pomoc w przygotowaniu figur i spisach bibliograficznych . Naszym celem w tym artykule jest bycie bardziej refleksyjnym niż wyczerpującym, i trzeba przyznać, że przedstawiliśmy nasze osobiste poglądy. Prosimy o zrozumienie tych kolegów, których ważnego wkładu nie można było jednoznacznie wymienić.


Naukowcy zajmujący się epigenetyką, genetyką, biologią systemów i biologią obliczeniową z doświadczeniem w biologii molekularnej, genetyce

Sekcja II: Gdzie jestem? Cechy genomowe i zasady sekwencji DNA definiujące miejsca regulacji epigenetycznej: uczenie maszynowe

Rozdział 1. Identyfikacja obliczeniowa elementów odpowiedzi Polycomb/Trithorax

  • Abstrakcyjny
  • Wprowadzenie do elementów odpowiedzi Polycomb/Trithorax
  • 2003 Podejście ad hoc do przewidywania PRE, wraz z jego szczególnymi motywacjami
  • Ocena wyników klasyfikacji
  • Wyniki prognozy PRE z 2003 r.
  • Odkryto nowe motywy
  • Przekształcenie prognozy PRE jako problem z uczeniem maszynowym
  • Koszty błędnej klasyfikacji i wymiar kompromisu
  • Analiza ewolucyjna i redukcja przestrzeni wyszukiwania
  • Dzisiaj: dane profilowania całego genomu
  • Jak dobra jest nasza metoda oceniana na podstawie tych danych?
  • Czułość i specyficzność profilowania całego genomu
  • Wniosek
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów

Rozdział 2. Modelowanie stanów chromatyny

  • Abstrakcyjny
  • Cel modelowania stanów chromatyny
  • Wspólne podejście
  • Czego nauczyliśmy się z tych modeli?
  • Modele statyczne a modele dynamiczne
  • Stany chromatyny są atraktorami
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów

Rozdział 3. Przekraczanie granic: metody modelowania w celu zrozumienia domen chromatyny i ich granic

  • Abstrakcyjny
  • Wstęp
  • Rozszerzający się wszechświat domen strukturalnych
  • Techniki eksperymentalne
  • Modelowanie struktury chromatyny wyższego rzędu
  • Formalizacja wywoływania przedziałów i przewidywania granic
  • Perspektywy
  • Bibliografia
  • Lista akronimów i skrótów

Rozdział 4. Wnioskowanie o sygnalizacji chromatyny z danych ChIP-seq dla całego genomu

  • Abstrakcyjny
  • Wstęp
  • Techniki eksperymentalne
  • Modelowanie
  • Zakłócanie systemu
  • Perspektywy
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów

Sekcja III: Wszystko się w ruchu: dynamika regulatorów epigenetycznych in vivo: modele kinetyczne oparte na równaniach różniczkowych zwyczajnych

Rozdział 5. „Biochemia in vivo”: bezwzględna kwantyfikacja i modelowanie kinetyczne w zastosowaniu do regulacji Polycomb i Trithorax

  • Abstrakcyjny
  • Wstęp
  • Absolutna kwantyfikacja in vivo: wyzwanie techniczne
  • Wszystko się w ruchu: metody pomiaru parametrów kinetycznych In Vivo
  • Biochemia in vivo układu epigenetycznego: czego się nauczyliśmy?
  • Matematyczne modelowanie systemu: definiowanie tego, czego nie wiemy
  • Powrót do ławki: testowanie modelu przez zakłócanie systemu
  • Perspektywy
  • Podziękowanie
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów

Rozdział 6. Modelowanie dystrybucyjnej modyfikacji histonów przez metylotransferazy Dot1: od mechanizmu do wglądu biologicznego

  • Abstrakcyjny
  • Wstęp
  • Modelowanie modyfikacji histonów przez Dot1
  • Podziękowanie
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów
  • Załącznik: Estymacja parametrów i formalny opis matematyczny modeli

Sekcja IV: Pogodzenie losowości i precyzji: bistabilna pamięć epigenetyczna i przełączanie: modele stochastyczne

Rozdział 7. Modelowanie bistabilnych stanów chromatyny

  • Abstrakcyjny
  • Pamięć komórkowa dzięki epigenetyce opartej na chromatynie
  • Podejście do modelowania i filozofia
  • Epigenetyka za pośrednictwem nukleosomów
  • Epigenetyka za pośrednictwem metylacji DNA
  • Perspektywy
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów

Rozdział 8. Ilościowe, wyzwalane przez środowisko przełączanie między stabilnymi stanami epigenetycznymi

  • Abstrakcyjny
  • Wstęp
  • Pamięć zimna jest cyfrowa i przechowywana lokalnie w chromatynie
  • Zimna rejestracja jest cyfrowa
  • Walidacja modelu
  • Perspektywy
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów

Sekcja V: Trzeci i Czwarty Wymiar: Chromosomalne Oddziaływania Dalekiego Zasięgu: Modele Polimerowe

Rozdział 9. O naturze organizacji chromatyny 3D: lekcje z modelowania

  • Abstrakcyjny
  • Wstęp
  • Polimerowe modele chromatyny
  • Modele do rekonstrukcji konformacji 3D na podstawie danych kontaktowych
  • Wnioski
  • Bibliografia
  • Słowniczek

Rozdział 10. Od wychwytywania konformacji chromosomów do fizyki polimerów i z powrotem: badanie trójwymiarowej struktury chromatyny w obrębie domen powiązanych topologicznie

  • Abstrakcyjny
  • Wstęp
  • Od map 5C/Hi-C do struktur trójwymiarowych
  • Opis modelu polimeru opartego na danych
  • Czego można się nauczyć z opartych na danych, polimerowych rekonstrukcjach struktury chromosomów?
  • Jakie są mechanizmy molekularne stojące za energiami interakcji?
  • Wnioski i perspektywy
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów

Rozdział 11. Podejście kombinacyjne oparte na obrazowaniu żywych komórek i modelowaniu obliczeniowym w celu lepszego zrozumienia chromatyny, epigenetyki i genomu

  • Abstrakcyjny
  • Wprowadzenie: genomowy DNA, nukleosomy i chromatyna
  • Techniki eksperymentalne: obrazowanie pojedynczych nukleosomów w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej
  • Modelowanie: Symulacja Monte Carlo dynamiki chromatyny
  • Kolejny wynik z modelu: fizyczna wielkość kompleksów transkrypcyjnych
  • Perspektywiczny
  • Bibliografia
  • Słowniczek
  • Lista akronimów i skrótów

Rozdział 12. Wychwytywanie strukturalnych właściwości chromosomów z ich przestrzennych i czasowych fluktuacji


Wstęp

W komórkach eukariotycznych DNA jest upakowane jako chromatyna, której jednostkami funkcjonalnymi są nukleosomy. Każdy nukleosom składa się z oktameru czterech histonów rdzeniowych (H3, H4, H2A i H2B), wokół których owiniętych jest 147 par zasad DNA [1]. Kuliste regiony histonów tworzą rdzeń nukleosomu, podczas gdy N-końcowe ogony wystają z nukleosomów i są wzbogacone różnymi modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM). PTM mogą również występować na bocznej powierzchni regionów rdzenia nukleosomowego histonów, które są w kontakcie z DNA [2], przy czym modyfikacje zarówno ogona, jak i rdzenia wpływają na strukturę chromatyny poprzez zmianę ładunku netto histonów poprzez zmianę interakcji międzynukleosomalnych oraz ułatwiając rekrutację specyficznych białek, takich jak białka zawierające bromo-, chromo-, Tudor, PWWP, MBT i PHD [1].

Modyfikacje histonów i implementujące je enzymy mogą przyczyniać się do zagęszczania chromatyny, dynamiki nukleosomów i transkrypcji. Te modyfikacje mogą być wprowadzane w odpowiedzi na bodźce wewnętrzne i zewnętrzne. Rozregulowanie tych procesów może zmienić równowagę ekspresji genów i dlatego jest często obserwowane w ludzkich nowotworach, albo poprzez zyskanie lub utratę funkcji, nadekspresję, supresję przez hipermetylację promotora, translokację chromosomów lub mutacje enzymów/kompleksów modyfikujących histony, a nawet miejsce modyfikacji histonu [2,3,4]. Rzeczywiście, mutacje w białkach związanych z chromatyną są jednymi z najczęściej mutowanych celów w raku [5]. Rozregulowanie niektórych białek związanych z chromatyną może działać jako czynniki napędzające w pewnych typach nowotworów [6, 7]. W konsekwencji podczas progresji choroby może wystąpić nieprawidłowa proliferacja komórek, inwazja, przerzuty i chemiooporność [8]. Jednak nadal istnieje znaczna baza wiedzy, którą należy zdobyć, aby określić role modyfikacji histonów i ich maszynerii enzymatycznej podczas rozwoju i warunków chorobowych.

Niniejszy przegląd koncentruje się na niedawnym postępie w zrozumieniu modyfikacji histonów u ssaków, podkreślając mechanizmy PTM w nowotworach dzięki dostępności nowych testów, technik i inhibitorów do dokładnego mapowania modyfikacji w całym genomie oraz możliwości zastosowania w leczeniu nowotwory. Zdefiniujemy, jakie znaczniki są epigenetyczne oraz dlaczego iw jaki sposób utrzymywana jest równowaga pomiędzy różnymi modyfikacjami w celu prawidłowej regulacji ekspresji genów. Zajmiemy się również modyfikacjami histonów w raku jako biomarkerami progresji nowotworu i/lub rokowania.

Modyfikacje histonów, modyfikatory i ich funkcje w rozwoju i nowotworach

Aktywację i represję transkrypcji kontroluje szereg modyfikatorów histonów i białek związanych z chromatyną. Równowaga między określonymi modyfikacjami i modyfikatorami jest utrzymywana w stałym stanie komórki, aby utrzymać strukturę chromatyny, wykonać właściwy program ekspresji genów i kontrolować wynik biologiczny (ryc. 1). Gdy równowaga jest zaburzona, fenotypy komórek mogą ulec zmianie i mogą być predestynowane do wystąpienia i progresji choroby [9,10,11]. Dlatego zrozumienie funkcji kluczowych regulatorów modyfikacji histonów pomoże nam opracować sondy chemiczne do utrzymania homeostazy i przywrócenia zrównoważonego stanu komórki (ryc. 2).

Zrównoważone stany transkrypcji utrzymywane przez wszechstronne białka chromatyny i modyfikacje histonów. Zrównoważone stany transkrypcji są utrzymywane przez modyfikatory chromatyny i modyfikacje histonów. Enzymy modyfikujące histony przedstawiono odpowiednio jako jabłka (aktywacja) i pomarańcze (represja) na dwóch szalkach wagi. Stany chromatyny są utrzymywane i równoważone przez szereg znaków aktywacji i represji. Oznaczenia histonów wyróżnione pogrubioną czcionką są uważane za cechy charakterystyczne odpowiednio euchromatyny (H4K16ac) i heterochromatyny (H3K9me3 i H3K27me3)

Farmakologiczne przywrócenie równowagi epigenetycznej ekspresji genów w nowotworach ludzkich. a Translokacja MLL i SEC promują białaczkę w białaczce z rearanżacją MLL. Zwiększenie rekrutacji MLL1 typu dzikiego do chromatyny przez przejęcie szlaków IL1/IRAK4 i CKII/tasapse1 wypiera chimerę MLL i SEC oraz hamuje leukemogenezę. b Mutacja MLL3 w PHD prowadzi do utraty funkcji MLL3/COMPASS i zmniejszenia metylacji wzmacniacza H3K4. Hamowanie EZH2 przez małe cząsteczki (np. GSK-126) hamuje aktywność enzymatyczną EZH2 i zmniejsza metylację H3K27 w celu przywrócenia ekspresji genu supresorowego guza. C Mutacja H3K27M prowadzi do globalnego wzrostu acetylacji H3K27 i nieprawidłowej ekspresji genów. Hamowanie BRD4 przez małe cząsteczki (np. JQ-1) wypiera białko z chromatyny i przywraca normalną ekspresję genów oraz hamuje progresję DIPG

Niniejszy przegląd koncentrujemy się przede wszystkim na metylacji, acetylacji i ubikwitynacji PTM związanych z rozwojem i nowotworami. Inne rodzaje modyfikacji, w tym nowo zidentyfikowane, zostaną również pokrótce omówione pod koniec przeglądu. Główne typy modyfikacji histonów na ogonach lub w rdzeniu nukleosomu, które omówiono w tym przeglądzie, podsumowano w Tabeli 1.

Metylacja

Metylacja histonów jest procesem dynamicznym, który odgrywa kluczową rolę w rozwoju i różnicowaniu [30, 31]. Na przykład metylotransferazy H3K4 odgrywają kluczową rolę w regulacji genu Hox w fazie rozwojowej [32, 33]. Nieprawidłowe poziomy metylacji histonów prawdopodobnie odgrywają rolę przyczynową w onkogenezie. Skutki metylacji histonów są silnie zależne od kontekstu i mogą być związane z różnym stanem ekspresji genów. Metylacja histonów jest ściśle związana z regulacją transkrypcji poprzez wpływ na architekturę chromatyny, rekrutację czynników transkrypcyjnych, interakcję z czynnikami inicjacji i elongacji oraz wpływ na przetwarzanie RNA [34].

Metylacja histonów zachodzi na atomach azotu w łańcuchu bocznym zarówno reszt lizyny, jak i argininy, najsilniej na histonie H3, a następnie na H4 [35]. W przypadku metylacji lizyny i argininy istnieje wiele stanów metylacji, które mogą wywołać różne wyniki w regulacji transkrypcji. Lizyna może być mono-, di- lub trimetylowana przez sześć głównych klas kompleksów metylotransferazy lizyny histonowej (KMT1-6) [36]. Rodzina KMT1 zawiera co najmniej czterech członków u ssaków, w tym SUV39H1/2, G9a, GLP i SETDB1, z H3K9 jako substratem do metylacji [37, 38]. Enzymy z rodziny KMT2 znajdują się w makrocząsteczkowym kompleksie zwanym kompleksem białek związanych z Set1 (COMPASS) i odkładają mono-, di- lub trimetylowe znaczniki na H3K4 [16,17,18]. Rodzina KMT3 obejmuje NSD1, NSD2 (WHSC1) i NSD3 (WHSC1L1) oraz głównie metylany H3K36 [39]. W rodzinie KMT4 jedynym członkiem jest DOT1L, który realizuje metylację H3K79 [24, 40]. Rodzina KMT5 obejmuje PR-Set7 i SUV4-20H1/2, które realizują odpowiednio monometylację i di-/trimetylację H4K20 [41]. Rodzina KMT6 obejmuje funkcjonalnie redundantne enzymy EZH1 i EZH2 dla mono-, di- i trimetylacji H3K27 [23].

Wiadomo, że metylacja lizyny jest procesem odwracalnym od czasu odkrycia demetylazy lizyny LSD1 [42]. Istnieje co najmniej sześć rodzin demetylaz histonów lizynowych o zarówno unikalnych, jak i nakładających się funkcjach. Rodzina KDM1 obejmuje LSD1 (KDM1A) i LSD2 (KDM1B), z których oba mogą demetylować H3K4me2/me1, ale nie H3K4me3 [42, 43].Co więcej, LSD1 może również działać na demetylację H3K9 poprzez przełączenie z jego kompleksu represyjnego z interakcją CoREST na kompleks aktywujący z interakcją receptora androgenowego (AR) [19, 44, 45, 46]. Wszyscy pozostali członkowie rodziny demetylaz lizynowych mają domenę Jumonji (JmjC), która ze względu na różne zaangażowane chemię może usuwać znak trimetylowy, w przeciwieństwie do rodziny LSD. JHDM1A (KDM2A) i JHDM1B (KDM2B) należą do rodziny KDM2 o aktywności wobec H3K36me2/me1 i H3K4me3 [19]. JHDM1A była pierwszą zidentyfikowaną demetylazą zawierającą domenę JmjC [47]. Rodzina KDM3 obejmuje KDM3A, KDM3B i JMJD1C, wykazujące aktywność demetylazy dla H3K9me2/me1 [19]. Rodzina KDM4 obejmuje KDM4A, KDM4B, KDM4C i KDM4D o zróżnicowanej aktywności demetylazy w kierunku H3K9me3/me2 i H3K36me3/me2. Rodzina KDM5 zawiera KDM5A, KDM5B, KDM5C i KDM5D, z których wszystkie mogą demetylować H3K4me3/me2. Rodzina KDM6 obejmuje UTX (KDM6A), JMJD3 (KDM6B) i UTY. UTX i JMJD3 są specyficzne dla H3K27me3/me2, podczas gdy paralog sprzężony z Y, UTY, ma niewielką aktywność katalityczną. Kilka z KDM uznano za czynniki przyczyniające się do rozwoju wielu nowotworów, a zatem postulowano, że mogą być potencjalnymi celami leków. Inhibitory KDM mogą być cenne zarówno w wyjaśnianiu ich funkcji komórkowych, jak i jako potencjalne terapeutyki [48,49,50].

Do najlepiej scharakteryzowanych znaków metylacji reszt lizyny związanych z aktywacją transkrypcji należą H3K4 [51], H3K36 [39] i H3K79 [24], a metylacje związane z represją transkrypcji występują na H3K9 [37], H4K20 [41] i H3K27 [52] (rys. 1). Warto zauważyć, że współwystępowanie dużych regionów metylacji H3K27 z mniejszymi regionami znaczników metylacji H3K4 stanowi „domeny biwalentne”, które uważa się za ważne dla utrzymania pluripotencji poprzez wyciszanie genów rozwojowych w embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) przy jednoczesnym utrzymaniu ich w gotowości do aktywacji w fazie rozwojowej [53,54,55]. Zmiana równowagi tych histonowych modyfikacji ekspresji genów może przyczynić się do patogenezy nowotworów [9, 10].

Metylacja histonów H3K4 jest realizowana przez metylotransferazy z rodziny COMPASS, w tym SET1A, SET1B i MLL1-4 na wzmacniaczach i promotorach [16, 54, 56, 57, 58, 59, 60]. Wykazano również, że różne podjednostki COMPASS regulują di- i/lub trimetylację H3K4, w tym WDR5, Ash2L, RbBP5 i Dyp30, które są podjednostkami wspólnymi dla wszystkich członków rodziny COMPASS [61, 62]. SET1A i SET1B głównie trimetylują histon H3K4 na promotorach [16, 63], aczkolwiek większość SET1B jest zlokalizowana w cytoplazmie [57]. Co ciekawe, onkogenna funkcja SET1A została powiązana z przerzutami raka piersi, rakiem płuca i nowotworzeniem raka jelita grubego poprzez odpowiednio zarówno metylację histonów, jak i niehistonowy substrat YAP [64, 65]. MLL1 i MLL2 realizują di- i trimetylację na promotorach i/lub elementach odpowiedzi Polycomb (PRE), a MLL2 może również metylować H3K4 na obu promotorach genów dwuwartościowych i wzmacniaczach [17, 54, 59]. Co ciekawe, zrekonstytuowana domena SET MLL1 z kompleksem WRAD pozwala na mono-, di- i trimetylację H3K4 in vitro [61, 66], chociaż dotychczas nie wykazano monometylacji MLL1 in vivo. MLL3 i MLL4 są zdolne do monometylowania H3K4 na wzmacniaczach [67]. Kinetyka metylacji przez kompleks rdzeniowy MLL1 wykazana w testach rekonstytucji in vitro sugeruje, że di- lub trimetylacja przez SET1A, SET1B, MLL1 i MLL2 może nie wymagać monometylacji przez MLL3 i MLL4. Zostało to również poparte odrębną lokalizacją genomową różnych metylotransferaz COMPASS wykazaną w ChIP-seq tych czynników [58, 59, 67, 68].

Chociaż struktury rodziny COMPASS metylotransferaz H3K4 zostały ostatnio rozwiązane [61, 69, 70], inhibitory małocząsteczkowe, które bezpośrednio hamują aktywność enzymatyczną, są nadal niedostępne. Opracowanie tych inhibitorów posłużyłoby nie tylko jako narzędzia molekularne do analizy szczegółowych funkcji, ale także przyczyniłoby się do klinicznego leczenia różnych nowotworów o nieprawidłowej aktywności lub ekspresji metylotransferaz COMPASS. Oprócz dobrze zbadanej aktywności metylotransferaz z rodziny COMPASS, ostatnie wysiłki zostały poświęcone zbadaniu katalitycznie niezależnych ról metylotransferaz COMPASS (i to samo podejście można zastosować do innych typów modyfikatorów histonów) [58, 71, 72, 73,74]. Na przykład usunięcie domeny katalitycznej SET nie wpływa na wymóg SET1A w proliferacji ESC i samoodnawianiu, podczas gdy domena SET jest wymagana do prawidłowego różnicowania [58]. Podobnie SET1B, niezależnie od swojej domeny SET, jest niezbędny do tłumienia sygnalizacji ADIPOR1 w cytoplazmie w celu wywołania efektu rakotwórczego [57]. Biorąc pod uwagę znaczenie sygnalizacji SET1B-ADIPOR1 w potrójnie ujemnym raku piersi (TNBC), AdipoRon, agonista ADIPOR1, został zaproponowany jako nowa strategia terapeutyczna w klinicznym leczeniu TNBC [57].

MLL1 jest często mutowany poprzez translokację z innymi partnerami onkogennymi w ostrej białaczce szpikowej i limfoidalnej (AML i ALL), co odpowiada za

80% białaczki dziecięcej i 5–10% białaczki dorosłej [75]. Białka chimeryczne nie posiadają katalitycznej domeny SET MLL1 i napędzają leukemogenezę. Ostatnio zidentyfikowaliśmy strategie leczenia białaczki z rearanżacją MLL poprzez stabilizację kopii MLL typu dzikiego w celu osłabienia nieprawidłowej transkrypcji, w której pośredniczą białka fuzyjne MLL i ich onkogenny kofaktor, kompleks super elongacji (SEC) [76, 77 ] (rys. 2a). Badania te wskazują również, że nie tylko aktywność katalityczna, ale także poziom białka/obrót białka determinują wynik ich działania. Niemniej jednak całkowite wyeliminowanie onkogennych białek fuzyjnych nadal pozostaje trudnym do ukierunkowania problemem w białaczce z rearanżacją MLL.

Stwierdzono, że zarówno MLL3, jak i MLL4 są silnie zmutowane w raku [4, 10, 18, 78]. MLL3 ma gorący punkt mutacji w skupisku homeodomen roślinnych (PHD), podczas gdy mutacje MLL4 są bardziej równomiernie rozmieszczone w białku [10, 18]. Nasze ostatnie badanie udokumentowało, że mutacje w obrębie klastra MLL3 PHD zakłócają jego interakcję z supresorem guza BAP1 i korelują ze słabym przeżyciem pacjentów [10]. Ponieważ aktywność katalityczna MLL3 i MLL4 jest zbędna dla rozwoju i syntezy wzmacniacza RNA [72, 73], ważne będzie zbadanie katalitycznej i niekatalitycznej roli tych białek jako supresora nowotworu.

Znacznik histonowy H3K4me3 może pomóc w rekrutacji czynników przebudowy chromatyny CHD1 [79] i BPTF [80], remodelerów chromatyny, które mogą pomóc w otwarciu chromatyny. Ponadto nasze laboratorium odkryło, że BRWD2/PHIP może rozpoznawać znaczniki metylacji H3K4 poprzez domenę CryptoTudor sąsiadującą z bromodomeną, co sugeruje synergię między acetylacją i metylacją w regulacji transkrypcji przez to białko [81]. Farmakologiczne ukierunkowanie na aktywność katalityczną metylotransferaz COMPASS, interakcje białko-białko (PPI) między kluczowymi podjednostkami COMPASS lub wiązanie białek do zmetylowanego H3K4, mogą być wykorzystane w celu dalszego ułatwienia zrozumienia dalszych zdarzeń i otwarcia nowych podejść terapeutycznych dla lek na raka. Z nadzieją na leczenie MLL opracowano czynniki zakłócające PPI interakcji Menin-MLL, a mianowicie MI-463, MI-503 i M-525 [82, 83] oraz OICR-9429 dla interakcji WDR5-MLL [84]. -rearanżacja i białaczka z mutacją CEBPA. Pełna lista związków omawianych w tym przeglądzie znajduje się w Tabeli 2.

Histon H3K36me3 jest wykrywany w organizmie aktywnie transkrybowanych genów dzięki połączeniu enzymu SET2 z ufosforylowaną formą CTD RNA Pol II [39]. Mniej zrozumiała jest funkcja H3K36me2, zaimplementowana przez ASH1L i rodzinę NSD1-3. Ostatnio wykazano, że potencjalny przesłuch między H3K4me3 i H3K36me2 występuje w centrum LEDGF [98]. LEDGF bezpośrednio oddziałuje z Meniną i MLL1 poprzez swoją domenę wiążącą integrazę i jest wymagany do zależnej od MLL1 transkrypcji i transformacji białaczkowej [99, 100]. Tymczasem LEDGF wiąże się z dimetylowanym H3K36 poprzez swoją domenę PWWP [98, 101]. LEDGF przyciąga coraz większą uwagę, ponieważ badania wykazały, że LEDGF jest niezbędny w białaczce z rearanżacją MLL, ale nie w przypadku hematopoezy, co zwiększyło potencjał terapeutyczny skutecznego celowania w LEDGF bez ogólnych skutków ubocznych w układzie krwiotwórczym [102, 103]. Ze względu na wieloaspektowe role LEDGF i jego interakcje z mnóstwem białek o rozbieżnych funkcjach [99, 104, 105], należy ustalić, czy jego rola podczas leukemogenezy zależy od MLL1. Ograniczony sukces w leczeniu białaczki z rearanżacją MLL osiągnięto poprzez celowanie w LEDGF za pomocą CP65, cyklicznego peptydu stosowanego do hamowania replikacji wirusa HIV, ponieważ ta sama domena na LEDGF wiąże się zarówno z integrazą HIV, jak i MLL1 [92]. Degradacja LEDGF może być nowym kierunkiem przy użyciu technologii proteolizy ukierunkowanej na chimerę (PROTAC) [106], która zostanie omówiona w dalszych rozdziałach. H3K36 me3 może również zapobiegać metylacji przez PRC2 pobliskiej reszty H3K27 na tym samym ogonie histonowym [107].

Znacznik metylacji histonów H3K79 implementowany przez DOT1L, jedyny enzym odpowiedzialny za odkładanie, znajduje się na globularnej domenie histonów skorelowanej z aktywną ekspresją genów [2, 40, 108]. DOT1L jest również jedynym enzymem katalizującym metylację lizyny, który ma metylotransferazę różną od domeny SET, a demetylaza dla H3K79 nie została dotychczas zidentyfikowana. DOT1L znajduje się w kompleksie o nazwie DotCom z partnerami translokacji MLL AF9 lub jego paralogiem ENL i AF10 [109]. Aktywność DOT1L sprzyja również proliferacji i przerzutom komórek raka piersi [110]. Nieprawidłowa regulacja w górę metylacji H3K79 w białaczce [111] doprowadziła do opracowania i zastosowania inhibitora DOT1L EPZ-5676 do leczenia białaczki z rearanżacją MLL [85], która jest obecnie w trakcie badań klinicznych [86].

Metylacje histonów H3K9 i H3K27 są wymagane do powstania różnych form heterochromatyny [112]. Histon H3K9me3 i H3K27me3 zostały zaproponowane jako jedyne prawdziwe „znaczniki epigenetyczne”, ponieważ zdefiniowały mechanizmy dziedziczenia po replikacji DNA [112]. Maszyny do osadzania H3K9me3 i H3K27me3 mają odrębny mechanizm „zapisu i odczytu” z aktywnością enzymatyczną i zdolnością do wiązania i rozpoznawania modyfikacji w obrębie tego samego enzymu lub kompleksu enzymatycznego, umożliwiając w ten sposób pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego. W przypadku H3K9me3, SUV39H1 zawiera zarówno moduł zapisu i odczytu (chromodomenę i domenę SET) [113], jak i rozpoznawanie metylolizyny dodatkowo promuje aktywność metylacji [114]. Białka HP1 — HP1α (CBX5), HP1β (CBX1) i HP1γ (CBX3) zawierają chromodomenę wiążącą metylo-lizynę [115] i odgrywają ważną rolę w tworzeniu heterochromatyny. Metylacja histonu H3 lizyny 9 napisanego przez SUV39H1 tworzy miejsce wiązania dla białek HP1, które z kolei rekrutują więcej SUV39H1 i ten mechanizm przyczynia się do propagacji tworzenia heterochromatyny [116]. W przypadku H3K27me3, EZH2 realizuje metylację H3K27 w obrębie kompleksu PRC2, podczas gdy podjednostka EED rozpoznała tę metylację i dalej allosterycznie aktywuje domenę SET EZH2 [23, 117]. Podobnie do odrębnych dystrybucji H3K4me1/2/3 przez rodzinę COMPASS, dystrybucje H3K27me1/2/3 w całym genomie wzajemnie się wykluczają, przy czym H3K27me3 głównie w promotorach (zwłaszcza w genach dwuwartościowych), H3K27me2 w regionach międzygenowych, a H3K27me1 w ciałach genów aktywnie transkrybowanych genów [9]. Ponieważ podjednostki EZH2 i SUZ12 PRC2 są wymagane do stabilności HP1α, markery metylacji heterochromatyny H3K27me3 i H3K9 mogą współpracować, aby utrzymać białko 1α heterochromatyny w chromatynie, podkreślając kluczowe przesłuchy między szlakami wyciszania genów H3K9me2/3 i H3K27me3 [118]. Inhibitory EZH2 są często stosowane w celu zapobiegania niepożądanej metylacji histonów genów supresorowych nowotworu, gdy EZH2 ulega nieprawidłowej ekspresji w komórkach nowotworowych lub jest zmutowany (zysk funkcji, Y641 w domenie SET) [9, 77, 119]. Nasze ostatnie badanie wykazało, że komórki nowotworowe niosące mutacje MLL3 PHD są bardziej wrażliwe na deplecję EZH2, SUZ12 i EED w kompleksie PRC2 [10]. Wykorzystanie syntetycznej śmiertelności i zależności osi regulacyjnej MLL3-UTX-PRC2 jest obiecującą stratyfikacji terapeutyczną dla stosowania inhibitorów EZH2 (ryc. 2b).

Oprócz częstych mutacji szerokiego spektrum modyfikatorów histonów, kilka mutacji na ogonach histonów (H3K27M, H3K36M i H3G34V/R) jest związanych z nowotworzeniem w różnych typach nowotworów [120]. Wspólną cechą zmutowanych „onkohistonów” jest to, że wszystkie one utrudniają odkładanie odpowiedniej modyfikacji histonów w miejscu mutacji lub otaczających reszt w przypadku mutacji H3G34, prowadząc do przeprogramowania transkrypcji i nowotworzenia [120]. Nawracającą substytucję pojedynczego nukleotydu prowadzącą do H3.3K27M odkryto w rozlanych wewnętrznych glejakach mostu (DIPG) z globalną utratą H3K27me3 i zmniejszoną aktywnością katalityczną PRC2, ale wyższymi poziomami acetylacji H3K27, co czyni ją obiecującą dla terapii hamującej BRD4 [ 9, 87] (ryc. 2c). Mutacja histonowa H3K36M występuje w chrzęstniaku zarodkowym, raku płaskonabłonkowym głowy i szyi oraz raku jelita grubego, natomiast mutacje H3G34V/R stwierdzono zarówno w nowotworach glejaka, jak i kości [120]. Pomimo ograniczonych postępów w zrozumieniu roli tych zmutowanych histonów w rozwoju raka, istnieje niezaspokojona potrzeba przeprowadzenia kompleksowego badania syntetycznej śmiertelności w celu zbadania, czy guzy niosące określone mutacje są bardziej zależne od pewnych ścieżek sygnałowych w celu zbadania potencjalnych strategii terapeutycznych skuteczniej dostosowywać schematy leczenia do pacjentów.

Metylacja H4K20 jest związana zarówno z aktywacją transkrypcyjną, jak i represją w zależności od stanów metylacji. H4K20me1 katalizowana przez PR-Set7 jest związana z aktywacją i zaznaczaniem punktów pochodzenia replikacji DNA [121, 122]. Z drugiej strony, H4K20me2/3 katalizowana przez SUV4-20H1/2 wiąże się z represją transkrypcji poprzez utrzymywanie heterochromatyny pericentrycznej i telomerycznej [121]. Metylacja H4K20me2/3 może nasilać kondensację chromatyny in vitro [25]. Utrata H4K20me3 została opisana jako cecha charakterystyczna raka [26]. Dynamiczna regulacja metylacji H4K20 została ostatnio zgłoszona w C. elegans, gdzie stwierdzono, że nowa podrodzina demetylaz histonowych Jumonji C (JmjC), DPY-21, przekształca H4K20me2 w H4K20me1 w celu kontrolowania struktury wyższego rzędu dwóch żeńskich chromosomów X, promowania upakowania chromosomów i tłumienia ekspresji genów [27] . Pozostaje do zbadania, czy ludzki odpowiednik, RSBN1, odgrywa rolę w redukcji H4K20me3 w ludzkim raku.

Oprócz wszechstronnych stanów metylacji lizyny, reszty argininy można również modyfikować poprzez monometylację oraz symetryczną i asymetryczną dimetylację (MMA, SDMA i ADMA) przez podzbiór białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT), w tym PRMT1, CARM1, PRMT5 i PRMT6 [123, 124]. Usunięcie metylacji argininy może nastąpić poprzez jej deiminację do cytruliny przez PADI4 [21] (proszę zapoznać się z rozdziałem „Inne rodzaje modyfikacji histonów” w celu dalszej dyskusji). PRMT metylują nie tylko ogony histonów, ale także dużą liczbę substratów niehistonowych [123]. Należy to wziąć pod uwagę podczas interpretacji badań z użyciem inhibitorów PRMT, ponieważ wyniki mogą dotyczyć wielu ścieżek sygnałowych regulowanych przez substraty danego członka PRMT. Niemniej jednak udało się opracować specyficzne inhibitory CARM1/PRMT4 do leczenia szpiczaka mnogiego [125], które mogą metylować H3R17me2a i H3R26me2a zaangażowane w aktywację transkrypcji [123].

Pomimo ogromnego postępu poczynionego w odkryciu rodzin metylotransferaz histonowych, demetylaz i mutacji histonów w raku, wciąż jest wiele do nauczenia się o biologicznej roli tych białek i ich wzajemnym oddziaływaniu w różnych stadiach rozwoju i warunkach choroby.

Acetylowanie

Acetylowanie jest odwracalną modyfikacją grupy ε-aminowej reszt lizyny, która jest kontrolowana przez dwie grupy enzymów: acetylotransferazy histonowe (HAT) [126] i deacetylazy histonowe (HDAC) [91]. Istnieją trzy główne rodziny HAT u ludzi, które są dobrze zbadane, w tym GNAT (HAT1, GCN5, PCAF), MYST (Tip60, MOF, MOZ, MORF, HBO1) i p300/CBP [127]. Warto zauważyć, że HAT mogą również katalizować acetylację szerokiego zakresu białek niehistonowych, w tym supresorów nowotworów i onkogenów, a mianowicie p53, Rb i Myc w celu regulacji stabilności białka, wiązania DNA, interakcji białko-białko, aktywności enzymatycznej lub lokalizacji białka [ 89]. Acetylowanie ogonków histonów neutralizuje dodatnio naładowane lizyny, co, jak sugerowano, zakłóca oddziaływanie między ogonem a ujemnie naładowanym nukleosomalnym DNA, aby ułatwić otwieranie chromatyny w celu promowania aktywnej transkrypcji. Acetylowane lizyny na chromatynie mogą również promować otwartą chromatynę poprzez wiązanie przez różne czynniki transkrypcyjne zawierające bromodomeny, w tym te w kompleksach przebudowujących chromatynę, takich jak kompleks BAF [128, 129].

Dobrze zachowany znak H4K16ac zmniejsza zagęszczenie chromatyny in vitro [130] i jest związany z bardziej otwartą chromatyną in vivo [131]. Badania genetyczne na Drosophila wykazały, że po zmianie H4K16 na argininę, samice muszek są zdolne do życia i umierają tylko samce, ze względu na szczególną rolę H4K16ac w promowaniu kompensacji dawki chromosomu X. Zmniejszone stężenie H4K16ac jest związane z różnymi nowotworami [26, 126] i może w niektórych przypadkach mieć wartość prognostyczną [28].

Acetylowanie na H3K27 jest widoczne na aktywnych promotorach i wraz z p300 i H3K4me1 oznacza aktywne wzmacniacze [29, 132]. Histon H3K27ac jest odkładany przez CBP/p300 i służy częściowo do przeciwdziałania wyciszeniu Polycomb, ponieważ acetylacja wyklucza metylację PRC2 w tym miejscu [133]. Acetylacja nie tylko wpływa na ładunek i promuje zmiany strukturalne chromatyny, ale grupa acetylowa działa również jako sygnał rozpoznawany przez białka zawierające bromodomenę (BRD) (białka wiążące acetylo-lizynę), takie jak białka bromodomeny i domeny pozakońcowej (BET) BRD2, BRD3 i BRD4 [128]. W tych białkach stwierdzono mutacje, nieprawidłową ekspresję i fuzje genów, co implikuje ich rolę w rozwoju i progresji raka [22, 128, 134].

Deacetylacja histonów przez HDAC zmniejsza dostępność czynników transkrypcyjnych poprzez tworzenie zamkniętej konformacji chromatyny [135].Istnieje 18 HDAC u ssaków podzielonych na cztery główne rodziny: Klasa I (HDAC 1, 2, 3 i 8) są powszechnie wyrażane w ludzkich liniach komórkowych i tkankach w jądrze Klasa II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9 i 10) wykazują ekspresję specyficzną dla tkanki i mogą przemieszczać się między jądrem a cytoplazmą Klasa III lub sirtuinami (SIRT1-7), które są zależne od NAD+ i mają bardzo wyraźny mechanizm katalityczny deacetylacji w porównaniu z innymi klasami HDAC. Klasa IV ma tylko jeden niedawno zidentyfikowany członek, HDAC11 [136]. HDAC11 jest zdolny do deacetylacji rozbieżnych miejsc histonowych, dzięki czemu specyficzność substratu jest niska i funkcjonalnie zbędna w pewnych scenariuszach [3]. Podobnie jak HAT, HDAC mają również szereg substratów niehistonowych, takich jak p53, Hsp90, TCF i β-katenina [89].

Ze względu na dynamiczny charakter acetylacji histonów, opracowano inhibitory ukierunkowane na HDAC, HAT i białka bromodomeny, które znajdują się na różnych etapach przedklinicznych i klinicznych w leczeniu raka. Nadekspresja HDACs została stwierdzona w różnych nowotworach i koreluje ze znacznym spadkiem zarówno przeżycia wolnego od choroby, jak i przeżycia całkowitego oraz prognozuje złe rokowanie dla pacjentów [136,137,138]. Aktywność HDAC jest kluczowym mediatorem przeżywalności i zdolności rakotwórczej, co czyni ją atrakcyjnym celem dla panelu różnych nowotworów, a inhibitory HDAC są najbardziej dojrzałymi lekami epigenetycznymi opracowanymi do tej pory. Worinostat i romidepsyna są zatwierdzonymi przez FDA inhibitorami HDAC do leczenia opornego skórnego chłoniaka z komórek T (CTCL), a wiele innych znajduje się obecnie na różnych etapach oceny klinicznej, z których większość koncentruje się na nowotworach hematologicznych [138]. Należy zauważyć, że niektóre inhibitory HDAC wykazują również działanie hamujące wobec PI3K (CUDC-907), EGFR (CUDC-101) i innych. Może to być pożądane z perspektywy klinicznej w celu ograniczenia dawki i toksyczności poprzez podwójne ukierunkowanie na dwa szlaki onkogenne. Jest to jednak zastrzeżenie przy stosowaniu tego związku do badania funkcji molekularnych HDAC, ponieważ mogą one wywierać skuteczność poprzez szlaki sygnałowe inne niż deacetylacja histonów. Pomimo ogromnego sukcesu w walce z HDAC w klinice, celowanie w HAT pozostaje w tyle. C646 [139] i A-485 [90] są jedynymi stosunkowo silnymi i selektywnymi syntetycznymi inhibitorami p300/CBP opartymi na wirtualnym skriningu przy użyciu struktury krystalicznej p300 HAT/Lys-CoA. Ich skuteczność w modelach przedklinicznych musi być rygorystycznie ustalona w przyszłych badaniach.

BET-bromodomeny BET są intensywnie badane, czerpiąc znaczne korzyści z dostępności selektywnych inhibitorów [88, 140]. Silne zmiany fenotypowe wywołane inhibicją białka BET uzasadniają odkrycie i rozwój inhibitorów BET w celu zmniejszenia ich funkcji w guzach hematologicznych i litych. Inhibitory swoiste dla bromodomeny BET, JQ1 [141], I-BET [142] i I-BET151 [93], reprezentują początkowe sukcesy rozwoju inhibitorów BET. Początkowy sukces degradatorów bromodomen BET doprowadził do serii badań zwiększających siłę działania związków poprzez połączenie ugrupowania inhibitora BET z ligandem, który rekrutuje ligazę E3 przy użyciu technologii PROTAC [106] do degradacji w leczeniu obu hematologicznych choroby i guzy lite, takie jak oporny na kastrację rak prostaty i potrójnie ujemny rak piersi (TNBC) [94, 95, 143]. Degradery BET, dBET1 i dBET6, silnie i specyficznie celują w białka bromodomeny BET w leczeniu AML i T-ALL [144, 145]. W tym przypadku do ugrupowania ftalimidowego jest dołączony kompetycyjny antagonista bromodomen BET JQ-1, a białko ulegnie degradacji zależnej od ligazy ubikwityny cereblonu (CRBN) E3 [144]. Co ciekawe, badania wykazały, że degradację ukierunkowaną na talidomid można również zastosować do selektywnego ukierunkowania na „niedrugujące” czynniki transkrypcyjne palca cynkowego (ZF) przy użyciu pochodnych analogów talidomidu [96].

Ubikwitynacja

Monoubikwitynacja histonów występuje najczęściej na H2A i H2B [97]. Ubikwitynacja H2AK119 jest realizowana przez RING1A/B w kompleksie PRC1 [146] i jest usuwana przez kompleks deubikwitynazy BAP1 [147]. H2AK119ub1 jest powiązany z zagęszczaniem chromatyny i wyciszaniem transkrypcji [146]. H2BK120ub1 jest przeprowadzany przez enzym sprzęgający ubikwitynę UBE2A/B (RAD6) E2 i ligazę RNF20/40 E3 w genach aktywnie transkrybowanych [12]. Obecność H2BK120ub1 jest sprzężona z wysokim poziomem metylacji na H3K4 i H3K79 [13, 15, 148]. Podobnie jak w przypadku innych modyfikacji, ubikwitynacja histonów jest również powiązana z aktywacją i wyciszeniem transkrypcji poprzez wpływ na strukturę chromatyny wyższego rzędu [97] i zachowuje się jak sygnał do kolejnych modyfikacji histonów poprzez rekrutację innych maszyn [149].

Przesłuch między czynnikami epigenetycznymi występuje na dwóch głównych poziomach. Po pierwsze, liczne badania wykazały wzajemne oddziaływanie między różnymi modyfikacjami histonów [3, 60]. Na przykład monoubikwitynacja histonu H2B jest warunkiem wstępnym metylacji H3K4 przez COMPASS, a H3K79 przez DOT1L [60]. Wręcz przeciwnie, metylacja H3K4 przez MLL/COMPASS hamuje osadzanie się H3R2me2a przez PRMT6 i vice versa, sprawiając, że te dwa znaki wzajemnie się wykluczają [3]. Po drugie, przesłuch między samymi modyfikatorami histonów może kontrolować normalne i złośliwe stany proliferacji komórek. Na przykład deubikwitynaza BAP1 H2A rekrutuje monometylazę H3K4 MLL3 do wzmacniaczy genu monometylowania, podczas gdy zakłócenie interakcji między BAP1 i MLL3 przyczynia się do patogenezy wielu nowotworów [10]. Demetylaza H3K27 UTX jest również kluczowym składnikiem MLL3/COMPASS, a jej rekrutacja i aktywność są również zależne od BAP1 do wykonywania odpowiednich funkcji na wzmacniaczach [10]. Inne demetylazy histonów znajdują się również w dużych kompleksach modyfikujących histony, takich jak KMT i HDAC. W tym przypadku LSD1 znajduje się w kompleksie CoREST-HDAC w połączeniu z HDACs, CoREST i BHC80, a interakcja z tymi czynnikami reguluje jego stabilność i aktywność [46].

Inne rodzaje modyfikacji histonów

Fosforylacja ogonków histonowych dodaje ładunek ujemny do ogonków histonowych, zmieniając w ten sposób konformację struktury chromatyny i oddziaływania z czynnikami transkrypcyjnymi. Fosforylacja histonów H3S10 jest dobrze scharakteryzowaną modyfikacją związaną z kondensacją chromosomów podczas mitozy i jest realizowana przez kinazy Aurora, natomiast H3S10p implementowany przez rodzinę MSK/Jil1 jest zaangażowany w pozytywną regulację transkrypcji [150]. W defosforylacji tego miejsca pośredniczy PP2A i jest ona związana z represją ekspresji genów [150]. Fosforylacja na serynie 139 H2AX (γH2AX) jest indukowana przez bodźce uszkodzenia DNA i jest wczesną odpowiedzią na sygnalizację pęknięcia dwuniciowego DNA. W fosforylacji w tym konkretnym miejscu może pośredniczyć wiele kinaz, w tym ATM, ATR i DNA-PK [151]. Chociaż te dwie modyfikacje są intensywnie wykorzystywane jako markery progresji cyklu komórkowego i odpowiedzi na uszkodzenie DNA, konsekwencje modyfikacji i dalszych wydarzeń pozostają w dużej mierze nieznane [20]. Fosforylacja seryny 31 jest unikalna dla histonu H3.3 i została pierwotnie zidentyfikowana jako zlokalizowana w sąsiedztwie centromerów w chromosomach metafazowych [14]. Jest również markerem specyficznym dla mitozy, innym niż H3 S10P i S28P pod względem czasu i lokalizacji [14]. Grupa Banaszyńskiego niedawno odkryła, że ​​funkcją H3.3.S31P jest promowanie aktywności p300 i acetylacji wzmacniacza w mESC [152].

Ponieważ szeroko zakrojone badania skupiały się na metylacji, acetylacji, ubikwitynacji i fosforylacji histonów, zgłoszono również mnóstwo innych modyfikacji histonów, w tym krotonylację lizyny, butyrylację, propionylację, hydroksylację tyrozyny, biotynylację, neddylację, sumoilację, O-GlcNAc, ADP rybozylacja, N-formylacja, izomeryzacja proliny i cytrulinacja [31,153,154,155,156].

Dzięki zastosowaniu zintegrowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas, krotonylacja lizyny została wyznaczona jako swoisty znak aktywnych genów sprzężonych z chromosomem płci w postmejotycznych męskich komórkach rozrodczych poprzez kojarzenie z aktywną chromatyną, w tym promotorami i aktywnymi wzmacniaczami [82]. ]. Co ciekawe, białka domeny YEATS wykazują wysokie powinowactwo wiązania z krotonylo-lizyną, łącząc tę ​​modyfikację z aktywną transkrypcją [157]. Dwa ostatnie badania podkreślają możliwość ukierunkowania na domeny YEATS w białaczce z rearanżacją MLL, potencjalnie synergicznie z hamowaniem BET i DOT1L [158, 159]. Oprócz krotonylacji, butyrylacja i propionylacja są dwiema innymi modyfikacjami acylowania nieacetylo-lizyny aktywnie zajmującymi promotory genów i pełniącymi swoje funkcje w podobny sposób jak acetylacja histonów [160,161,162].

Neddylacja, kowalencyjna koniugacja NEDD8, białka podobnego do ubikwityny, jest odkładana na histonie H2A przez ligazę E3 RNF168. Nedylacja H2A na K119 zapobiega ubikwitynacji w tym miejscu i skutkuje zmniejszoną odpowiedzią na uszkodzenie DNA, co sugeruje rolę szlaku neddylacji w naprawie uszkodzeń DNA [163]. Oprócz ubikwitynacji i neddylacji histonów, histon H4 może być również modyfikowany za pomocą białek z rodziny SUMO (small ubiquitin-related modifier) ​​w celu pośredniczenia w represji transkrypcji poprzez rekrutację deacetylaz histonów i białka heterochromatyny 1 (HP1) [164].

Biotynylacja lizyn na histonach została również opisana jako rzadka modyfikacja [165], ale nie była szeroko badana, a jej znaczenie biologiczne nie jest dobrze poznane. O-GlcNA seryna/treonina O-GlcNAcylacja czynników epigenetycznych, takich jak HCF1 i TET2 jest dobrze poznana [166, 167]. Jednakże, czy histony są modyfikowane przez O-GlcNAc in vivo w komórkach ssaków, pozostaje przedmiotem dyskusji [168, 169]. Występowanie rybozylacji ADP histonów jest powszechne we wszystkich histonach rdzeniowych i histonie H1. Pomimo jego powszechnej obecności, konsekwencje biologiczne są dość rozbieżne w przypadku różnych zmodyfikowanych lizyn, począwszy od naprawy DNA, replikacji i transkrypcji [170]. N-formylacja lizyn histonów stanowi niekanoniczną modyfikację wtórną wynikającą z oksydacyjnego uszkodzenia DNA [171]. Ponieważ modyfikacja zachodzi również na resztach lizyny, może zakłócać metylację lub acetylację tej samej reszty i przyczyniać się do patofizjologii stresu oksydacyjnego i nitrozowego. Podobnie niekowalencyjna izomeryzacja proliny histonu H3 wpływa na metylację lizyny H3K36 w celu zwiększenia transkrypcji [172]. Wreszcie, deiminacja lub cytrulinacja reszt argininy przez PADI4 antagonizuje metylację argininy poprzez przekształcenie argininy lub metyloargininy w niekonwencjonalny aminokwas cytrulinę [173, 174]. Hipercytrulinacja może sprzyjać dekondensacji chromatyny [175]. Co ciekawe, cytrulinowany histon H3 może również funkcjonować jako nowy marker prognostyczny związany z nasileniem odpowiedzi zapalnej u pacjentów z zaawansowanym nowotworem [176].

Ogólnie rzecz biorąc, niektóre z tych niedawno zidentyfikowanych modyfikacji histonów mogą wpływać na konwencjonalne modyfikacje, takie jak metylacja, acetylacja, ubikwitynacja i fosforylacja poprzez konkurowanie z tymi samymi miejscami na histonach o modyfikację lub poprzez przesłuch poprzez nadanie zmiany konformacyjnej, zmieniając w ten sposób dalsze przekazywanie sygnałów i regulacja ekspresji genów. Rzadkość tych modyfikacji w genomie może wskazywać na funkcje dostrajania konwencjonalnych modyfikacji w odpowiedzi na różne okoliczności, takie jak uszkodzenie DNA i stres oksydacyjny. W przyszłych badaniach należy dokładniej scharakteryzować przesłuch i konsekwencje biologiczne tych rzadkich modyfikacji.

Techniki mapowania i charakteryzowania modyfikacji oraz ich dystrybucji genomu

Identyfikację modyfikacji histonów w znacznym stopniu ułatwił rozwój technik spektrometrii masowej [154, 177, 178, 179, 180]. Strategie bottom-up, middle-down i top-down mają swoje zalety i wyzwania [181, 182]. Spektrometria mas typu bottom-up zazwyczaj analizuje małe peptydy wytworzone w wyniku trypsynizacji, co może zapewnić najwyższą dokładność identyfikacji modyfikacji. Spektrometria mas typu top-down próbuje zidentyfikować cały zestaw modyfikacji, zaczynając od nienaruszonego białka. Spektrometria mas ze średniej półki analizuje większe peptydy generowane z rzadszych enzymów tnących histony, takich jak Glu-C. Podejście Middle-down pozwala na stosunkowo wysoką czułość w porównaniu z metodą top-down, jednocześnie pozwalając na identyfikację dopełnienia modyfikacji na całym ogonie histonów, gdzie znajduje się większość modyfikacji histonów. Identyfikując, które modyfikacje występują na tym samym histonie, można ujawnić potencjalne efekty synergistyczne lub antagonistyczne różnych modyfikacji [182].

Sukcesy w identyfikacji licznych modyfikacji histonów sprawiają, że wyzwaniem jest zidentyfikowanie funkcji tych modyfikacji. W organizmach przetwarzalnych genetycznie, takich jak drożdże i muszki owocowe, wytworzono organizmy, w których wszystkie kopie genów histonów zostały zastąpione mutacją miejsca modyfikacji na niemodyfikowalną resztę [183,184,185]. Do oceny funkcji modyfikatora histonów można zastosować knockdown za pośrednictwem shRNA lub knockout CRISPR/Cas9 modyfikatorów histonów. Pukanie w mutacje katalitycznego miejsca enzymu może być wykorzystane do określenia, czy efekty obserwowane po utracie modyfikatora wynikają z utraty modyfikacji histonowej, czy też z rozerwania wielkocząsteczkowych, wielofunkcyjnych kompleksów, w których niektóre z tych enzymów są znaleziony.

Funkcjonalne konsekwencje modyfikacji histonów w różnych warunkach lub zaburzeniach mogą być oceniane za pomocą takich technik, jak sekwencjonowanie RNA do oznaczania ilości dojrzałych transkryptów, precyzyjne sekwencjonowanie jądrowe (PRO-seq) [186] lub sekwencjonowanie natywnego wydłużającego się transkryptu (sekwencja NET-seq). ) [187] do ilościowego oznaczania powstających transkryptów. Sekwencjonowanie immunoprecypitacji metylowanego DNA (MeDIP-seq) [188], MethylC-seq [189] i sekwencjonowanie wodorosiarczynowe o zmniejszonej reprezentacji (RRBS-seq) [190] można wykorzystać do pomiaru zmian w metylacji DNA. Test sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC-seq) [191], DNAse-seq [192] i sekwencjonowanie z wykorzystaniem formaldehydu (FAIRE-seq) [193] może być wykorzystany do oceny zmian dostępności chromatyny . Postępy w wykrywaniu pojedynczych cząsteczek modyfikacji potranslacyjnych na nukleosomach pozwalają na wykrycie kombinatorycznych stanów modyfikacji i pozycji genomowych nukleosomów [194].

Opracowanie inhibitorów enzymatycznych może stanowić wyzwanie dla różnych modyfikatorów histonów: po pierwsze, białka w obrębie rodziny enzymów mogą zachować podobieństwa sekwencji i struktury, co może utrudniać uzyskanie określonych inhibitorów drobnocząsteczkowych, po drugie, duża liczba białek związanych z chromatyną brak kieszeni na leki. Wspomniana wcześniej zależna od ligandów degradacja białek, PROTAC [106], HaloPROTAC [195, 196], degradery przy pomocy małych cząsteczek (SMASh) [197] i dTAG [198], zostały wykorzystane do kierowania białek docelowych do proteasomu. zależny od degradacji (Tabela 3), omijając w ten sposób potrzebę enzymatycznego celu terapeutycznego [199]. Zastosowanie tych technologii do degradacji białek związanych z chromatyną znacznie pogłębi nasze zrozumienie roli modyfikacji histonów i chromatyny w normalnych procesach biologicznych, a także pomoże w racjonalnym projektowaniu wydajnych i silnych małych cząsteczek o wartości terapeutycznej.

Od 2D do 4D: rejestrowanie dynamiki nukleosomów

Ze względu na dynamiczną naturę nukleosomów i struktury chromatyny, do zbadania tej przestrzeni potrzebne są różne podejścia. „2D” reprezentuje szerokie spektrum modyfikacji histonów, jak omówiono w tym przeglądzie, działających samodzielnie lub w połączeniu z innymi modyfikacjami w celu uzyskania efektów synergicznych, addytywnych lub antagonistycznych w celu wyrafinowanej regulacji ekspresji genów w odpowiednim czasie. „3D” polega na tym, jak modyfikacje histonów wpływają na organizację chromatyny, struktury wyższego rzędu chromatyny i interakcje dystalnych elementów regulatorowych. Strukturę 3D można uchwycić za pomocą Hi-C, kompleksowego sposobu pomiaru interakcji chromatyny w genomie człowieka [200]. Chociaż modyfikacje histonów i architektura chromatyny są profilowane w oddzielnych testach, naukowcy aktywnie dokonują przewidywań i modelowania organizacji chromatyny, takich jak centra interakcji chromatyny i granice domen powiązanych topologicznie (TAD) przy użyciu znaczników histonowych specyficznych dla typu komórki [201, 202]. Integracja zbiorów danych ChIP-seq i Hi-C dostarcza ważnych informacji o tym, jak organizacja chromatyny może mieć wpływ na regulację genów i jak można przewidzieć architekturę chromatyny przy użyciu danych ChIP-seq [203]. Niemniej jednak eksperymentalna metoda łącząca znaczniki histonowe ChIP-seq i Hi-C byłaby przydatna, aby bezpośrednio odpowiedzieć na te pytania. Obrazowanie w super rozdzielczości przy użyciu trójwymiarowego stochastycznego mikroskopu do rekonstrukcji optycznej (3D-STORM) to kolejne podejście do uchwycenia organizacji 3D chromatyny w różnych stanach epigenetycznych i ujawnienia szczegółów strukturalnych chromatyny [204]. „4D” opiera się na monitorowaniu dynamiki modyfikacji w czasie rzeczywistym. Można to osiągnąć za pomocą strategii ostrej degradacji, takich jak HaloPROTAC lub znakowanie modyfikatorów histonów przez degron indukowany auksyną (AID) [205, 206], wizualizacja w czasie rzeczywistym modyfikacji chromatyny za pomocą konfokalnej i strukturalnej mikroskopii oświetleniowej [207] oraz ligand fluorescencyjny znakowanie do bezpośredniej wizualizacji czynników chromatyny za pomocą znacznika Halo [208, 209] lub znacznika SNAP [210]. Strategie ostrej degradacji mają wyraźną przewagę nad typowym knockdown za pośrednictwem shRNA lub knockoutem modyfikatorów histonów za pośrednictwem CRISPR/Cas9, co trwa od kilku dni do miesięcy, a zjawiska mogą być spowodowane efektami wtórnymi. Strategie ostrej degradacji są znacznie bardziej specyficzne, z mniejszymi efektami poza docelowymi i wychwytują wczesny wpływ na chromatynę w połączeniu z konwencjonalnymi ChIP-seq lub ATAC-seq. Na przykład, 60 minut traktowania auksyną w komórkach ze znakowaniem AID PAF1 skutkowało znacznym zubożeniem endogennego białka PAF1, co potwierdza, że ​​uwalnianie Pol II z promotora, a pauza proksymalna było bezpośrednią konsekwencją utraty PAF1 [206].

Przyszłe kierunki

Włożono wiele wysiłku, aby zrozumieć rolę modyfikacji histonów i maszynerii enzymatycznej zaangażowanej we wdrażanie tych modyfikacji podczas rozwoju i choroby, zwłaszcza raka. Opracowywane są precyzyjne techniki mapowania lokalizacji i funkcji modyfikacji histonów w genomie od populacji komórek do, miejmy nadzieję, kilku lub nawet pojedynczych komórek. Białka, które specyficznie wiążą modyfikacje histonów, tłumaczą informacje w celu regulacji ekspresji genów poprzez rekrutację lub usuwanie innych czynników transkrypcyjnych. Niezbędne jest scharakteryzowanie różnych funkcji PTM i ich modyfikatorów w raku człowieka. Niemniej jednak uchwycenie dynamiki modyfikacji pozostaje trudnym problemem do badania funkcji modyfikacji histonów in vivo.

Opracowanie testów i specyficznych inhibitorów drobnocząsteczkowych (enzymatycznych/nieenzymatycznych) do celowania w PTM związanych z chorobą wymaga rozległej wiedzy opartej na rentgenowskich/Cryo-EM krystalicznych strukturach modyfikatorów i czynników wiążących modyfikacje. Cząsteczki narzędzia lub sondy chemiczne pozwolą dokładniej wyjaśnić biologiczną funkcję in vivo kluczowych elementów chromatyny. „Jakość” (swoistość i siła działania) sond chemicznych oraz przemyślany projekt testów eksperymentalnych w dużej mierze determinują wynik i interpretację wyników. Ponadto identyfikacja substratów niehistonowych ma kluczowe znaczenie dla określenia roli modyfikatorów histonów w celu opracowania bardziej specyficznych inhibitorów ukierunkowanych na pożądany szlak [76, 89].

Interesujące jest to, że modyfikatory histonów często znajdują się w dużych kompleksach wielobiałkowych dla prawidłowego funkcjonowania, takich jak kompleksy MLL/COMPASS, PRC2 i HDAC. Zrozumienie, w jaki sposób kluczowe enzymy działają z innymi podjednostkami (np. regulacja aktywności i stabilności) w tym samym kompleksie, pomoże w projektowaniu małych cząsteczek rozbijających kompleksy białkowe. Inhibitory MLL-meniny i MLL-WDR5 należą do tej klasy, a inne interfejsy między domeną katalityczną a białkami rusztowania mogą być pożądanymi celami do wykorzystania w rozwoju małych cząsteczek ze zdobyciem wiedzy o strukturze. Wraz z innymi podejściami do celowania w modyfikacje histonów, takie jak hamowanie aktywności enzymatycznej i degradacje małych cząsteczek przez PROTAC, białka i modyfikacje związane z chromatyną są uważane za korzystne cele dla leków, a wiele środków zostało zaprojektowanych i zastosowanych na różnych etapach badań klinicznych połączonych z aktualnie dostępnymi chemioterapiami [6].

Zmniejszenie toksycznych skutków ubocznych leków epigenetycznych stanowi wyzwanie podczas testowania tych leków w badaniach klinicznych [211]. Obecnie badane jest syntetyczne podejście do śmierci w celu zmniejszenia toksycznych skutków ubocznych poza celem i zwalczania oporności na terapię poprzez celowanie w wiele genów przy użyciu kombinacji leków. Co więcej, modyfikacje histonów mogą potencjalnie pełnić rolę biomarkerów w diagnostyce nowotworów i predyktorów prognostycznych [26, 212]. Ostatecznym celem jest przeniesienie terapii epigenetycznej do kliniki w celu leczenia nowotworów i dostosowanie skutecznych strategii opartych na typach nowotworów i zmianach epigenomu.


Obejrzyj wideo: Genetyka! Co to jest DNA, Chromosomy, Dziedziczenie, Zmienność - MEGA ciekawa biologia. (Może 2022).


Uwagi:

  1. Nikasa

    Co fajnie

  2. Sacage

    Wyrażenie doskonałe

  3. Edmund

    Genialny pomysł i terminowy

  4. Shanahan

    Wygrał tanio, łatwo przegrał.

  5. Barwolf

    To bzdura!

  6. Fautaxe

    Nie masz racji. Mogę to udowodnić. Napisz w PM.



Napisać wiadomość