Informacja

15.2: Tworzenie i przesiewanie biblioteki cDNA - Biologia

15.2: Tworzenie i przesiewanie biblioteki cDNA - Biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pierwszym krokiem w tworzeniu biblioteki cDNA jest izolacja komórkowego mRNA. Ten ekstrakt mRNA powinien reprezentować wszystkie transkrypty w komórkach w czasie izolacji lub komórki transkryptom. Termin ten jest używany przez analogię do genomu. Jednak genom to cała informacja genetyczna organizmu. W przeciwieństwie do tego transkryptom (zwykle eukariotyczny) odzwierciedla wszystkie geny wyrażane w danym typie komórek w danym momencie. Odwrotnie transkrybowane cDNA z ekstraktu mRNA są również określane jako transkryptom… i podobnie biblioteka cDNA. Biblioteka cDNA to probówka pełna komórek bakteryjnych, które zostały pobrane (tj przemieniony z) plazmidy rekombinowane z cDNA. Biblioteki cDNA wykonane z mRNA pobranych z różnych typów komórek lub tych samych komórek hodowanych w różnych warunkach są w efekcie różnymi transkryptomami. Każdy z nich odzwierciedla mRNA transkrybowane w komórkach w momencie ich ekstrakcji. Kiedy komórki w bibliotece cDNA są rozłożone na płytce Petriego z agarem odżywczym, każda komórka rośnie w kolonię komórek; każda komórka w kolonii jest klonem komórki wyjściowej. Biblioteki cDNA można wykorzystać do izolacji i sekwencjonowania DNA kodującego polipeptyd, który badasz.

Przypomnijmy, że dojrzałe mRNA w komórkach eukariotycznych zostało poddane splicingowi. Oznacza to, że cDNA z komórek eukariotycznych nie zawierają intronów. Introny, jak również sekwencje wzmacniaczy i innych elementów regulatorowych wi otaczających gen muszą być badane w bibliotekach genomowych, co zostanie omówione później. Tutaj przyjrzymy się, jak stworzyć bibliotekę cDNA.

A. Budowa cDNA

mRNA to tylko kilka procent komórki eukariotycznej; większość to rRNA. Ale ta niewielka ilość mRNA może być oddzielona od innych komórkowych RNA dzięki ich ogonom 3' poli(A). Po prostu przepuść całkowity ekstrakt RNA przez kolumna oligo-d(T) (zilustrowane poniżej).

Nitki tymidyny (T) mogą wiązać się H z ogonami poli(A) mRNA, przywiązując je do kolumny. Wszystkie RNA bez ogona poli(A) 3’ przepłyną przez kolumnę jako odpady. Drugi bufor jest przepuszczany przez kolumnę, aby zdestabilizować wiązania A-T H, aby umożliwić elucja frakcji mRNA. Po dodaniu wolnego oligo d(T) do wymytego mRNA, tworzy on wiązania H z ogonami poli(A) mRNA, służąc jako starter do syntezy kopii cDNA poli(A) mRNA pierwotnie w komórki. Wreszcie cztery deoksynukleotydowe prekursory DNA i odwrotna transkryptaza (pierwotnie wyizolowane z komórek zakażonych retrowirusem kurczaka) dodaje się w celu rozpoczęcia odwrotnej transkrypcji. Syntezę nici cDNA komplementarnej do mRNA pokazano poniżej.

Po podgrzaniu w celu oddzielenia cDNA od mRNA, cDNA jest replikowany w celu wytworzenia dwuniciowego lub (ds)cDNA, jak zilustrowano poniżej.

Synteza drugiej nici cDNA jest również katalizowana przez odwrotną transkryptazę! Enzym rozpoznaje zarówno DNA, jak i matryce RNA i ma taką samą aktywność polimeryzacyjną DNA od 5 do 3, jak polimerazy DNA. Po syntezie drugiej nici cDNA, nukleaza S1 (a jednoniciowa endonukleaza pierwotnie wyizolowany z grzyba wschodnioazjatyckiego!) w celu otwarcia pętli struktury (ds) cDNA i przycięcia reszty jednoniciowego DNA. Pozostaje (ds) cDNA.

B. Klonowanie cDNA do wektorów plazmidowych

Aby zrozumieć klonowanie cDNA i inne aspekty tworzenia rekombinowanego DNA, musimy porozmawiać nieco więcej o zestawie narzędzi do rekombinacji DNA. Oprócz odwrotna transkryptaza i nukleaza S1, inne niezbędne enzymy w „zestawie” obejmują endonukleazy restrykcyjne (Enzymy restrykcyjne) oraz Ligaza DNA. Naturalną funkcją enzymów restrykcyjnych w bakteriach jest rozpoznawanie określonych sekwencji miejsc restrykcyjnych w fagowym DNA (najczęściej palindromiczny sekwencje DNA), hydrolizują je, a tym samym unikają infekcji.

Enzymy restrykcyjne które sprawiają, że nożyczki przecinają dwa pasma liści podwójnej helisy tępe końce. Enzymy restrykcyjne, które wykonują rozłożone cięcie na każdej nici w ich miejscu restrykcyjnym, pozostawiają za sobą uzupełniający („lepkie”) końce (poniżej).

Jeśli zmieszasz dwa dwuniciowe fragmenty DNA z tymi samymi lepkimi końcami z różnych źródeł (np. różnych gatunków), utworzą one wiązania H na swoich komplementarnych końcach, ułatwiając rekombinację plazmidowego DNA z (ds)cDNA, który mają te same uzupełniające się „lepkie końce”. Używając języka technologii rekombinacji DNA, przyjrzyjmy się, w jaki sposób można zrekombinować wektory plazmidowe i cDNA.

1. Przygotowanie rekombinowanych wektorów plazmidowych zawierających inserty cDNA

Wektoryprzewoźnik DNA zaprojektowane do rekombinacji z obcym DNA będącym przedmiotem zainteresowania. Kiedy zrekombinowany wektor ze swoim obcym Wstawka DNA dostanie się do komórki gospodarza, może replikować wiele swoich kopii, co w rzeczywistości wystarcza do łatwej izolacji i badania. cDNA są zazwyczaj wstawiane do wektorów plazmidowych, które są zwykle kupowane „z półki”. Oni mogą być skaleczenie z enzymem restrykcyjnym w odpowiednim miejscu, pozostawiając te lepkie końce. Z drugiej strony, nie byłoby wystarczające trawienie (ds)cDNA endonukleazami restrykcyjnymi, ponieważ celem nie jest klonowanie fragmentów cDNA, ale całych cząsteczek cDNA. Dlatego konieczne będzie dołączenie wyrazy łączące na obu końcach (ds)cDNA. Plazmidowe DNA i konstrukty cDNA-łącznika można następnie trawić tym samym enzymem restrykcyjnym w celu wytworzenia zgodnych „lepkich końców”. Poniżej przedstawiono etapy przygotowania wektora i (ds)cDNA do rekombinacji.

Aby przygotować się do rekombinacji, wektor plazmidowy trawi się ograniczenie enzym by otworzyć krąg DNA. Mieć kompatybilny lepkie końce, dwuniciowe cDNA do wstawienia są mieszane z wyrazy łączące oraz Ligaza DNA umieścić linker DNA na obu końcach (ds) cDNA. Ligaza DNA jest kolejnym narzędziem w zestawie narzędzi do rekombinacji DNA. Łączniki są krótkimi, syntetycznymi dwuniciowymi oligomerami DNA zawierającymi miejsca restrykcyjne rozpoznawane i cięte przez ten sam enzym restrykcyjny co plazmid. Po przyłączeniu łączników do końców plazmidowego DNA trawi się je odpowiednim enzymem restrykcyjnym. To pozostawia zarówno (ds)cDNA, jak i wektory plazmidowe z komplementarnymi lepkimi końcami.

2. Rekombinacja plazmidów i insertów cDNA oraz transformacja komórek gospodarza

Następnym krokiem jest zmieszanie wyciętych plazmidów ze strawionymi łącznikami-cDNA w odpowiednich proporcjach, tak aby większość końców cDNA (łącznika) przyłączyła się (utworzyła wiązania Hbond) z większością lepkich końców plazmidu. Dodawanie Ligaza DNA z mieszaniną plazmid/linker-cDNA tworzy wiązania fosfodiestrowe między plazmidem a wstawką cDNA, uzupełniając okrąg rekombinowanego DNA, jak pokazano poniżej.

We wczesnych eksperymentach klonowania, ważną kwestią było wytworzenie plazmidów z tylko jedną kopią danej wstawki cDNA, a nie z wieloma ponownie zligowanymi plazmidami bez wstawek lub z wieloma plazmidami z wieloma wstawkami. Stosując lepiej zaprojektowane kombinacje wektorów i łączników, kwestia ta stała się mniej istotna.

3. Transformacja komórek gospodarza za pomocą rekombinowanych plazmidów

Zrekombinowane cząsteczki DNA są teraz gotowe do „klonowania”. Są dodawane do E. coli (czasem innych komórek gospodarza) wykonane przepuszczalne aby można je było łatwo przemieniony. Przypomnijmy, że transformacja zdefiniowana przez Griffitha jest pobieraniem przez bakterie obcego DNA, co prowadzi do zmiany genetycznej. ten zasada transformacji w klonowaniu jest rekombinowany plazmid! Etap transformacji pokazano poniżej.

Probówka pełna transformowanych komórek to Biblioteka cDNA.

Po tych wszystkich zabiegach nie wszystkie cząsteczki plazmidu w mieszaninie są rekombinowane; niektóre komórki w mieszance nie wchłonęły nawet plazmidu. Więc kiedy zrekombinowane komórki są umieszczane na agarze, w jaki sposób można stwierdzić, które z rosnących kolonii pochodzą z komórek, które pobrały zrekombinowany plazmid? Oboje szczep gospodarza z E coli i wektory plazmidowe stosowane w dzisiejszych czasach były dalej modyfikowane w celu rozwiązania tego problemu. Jeden taki wektor plazmidowy niesie gen oporności na antybiotyki. W takim przypadku komórki wrażliwe na ampicylinę zostałyby stransformowane rekombinowanymi plazmidami zawierającymi gen odporności. Gdy te komórki zostaną umieszczone na pożywce zawierającej ampicylina (forma penicyliny), rosną, jak pokazano poniżej.

Nietransformowane komórki (komórki, które nie wchłonęły plazmidu) nie mają genu oporności na ampicylinę, a zatem nie rosną na pożywce ampicyliny. Ale wciąż jest pytanie. Jak możesz stwierdzić, czy komórki, które wyrosły, zostały stransformowane przez zrekombinowany plazmid zawierający wstawkę cDNA? Możliwe, że niektóre transformanty zawierają tylko nierekombinowane plazmidy, które wciąż mają gen oporności na ampicylinę!

Aby odpowiedzieć na to pytanie, plazmidy zostały dalej zmodyfikowane z gen oporności na streptomycynę. Ale ten gen oporności na antybiotyki został również zaprojektowany tak, aby zawierał miejsca dla enzymów restrykcyjnych w środku genu. Tak więc wstawienie cDNA do tego plazmidu rozerwałoby i dezaktywowało gen. Oto jak ta druga część inżynierii genetycznej umożliwiła wzrost tylko komórek transformowanych rekombinowanym plazmidem zawierającym wstawkę cDNA. możemy powiedzieć transformanty zawierające zrekombinowane plazmidy oprócz tych zawierających nierekombinowane plazmidy techniką replika poszycia pokazano (zilustrowano poniżej).

Po wyrośnięciu kolonii na płytce z agarem z ampicyliną, nałóż filtr na płytkę. Filtr pobierze kilka komórek z każdej kolonii, stając się w efekcie repliką (odbiciem lustrzanym) kolonii na płytce. Umieść filtr repliki na nowej płytce agarowej zawierającej streptomycynę; nowe kolonie rosnące na filtrze muszą być odporne na streptomycynę i zawierać wyłącznie plazmidy nierekombinowane. Kolonie zawierające zrekombinowane plazmidy, te, które nie rosły w streptomycynie można łatwo zidentyfikować na oryginalnej płytce agarowej z ampicyliną. W praktyce wysoce wydajne procedury rekombinacji i transformacji typowo ujawniają komórki bardzo oporne na streptomycynę (tj. kolonie) po wysianiu replik. W tym przypadku komórki oporne na ampicylinę stanowią dobrą bibliotekę cDNA, gotową do przeszukiwania.

4. Identyfikacja kolonii zawierających plazmidy z interesującymi wstawkami

Następnym krokiem jest: ekran kolonie z biblioteki cDNA dla tych zawierających specyficzne cDNA, którego szukasz. Zwykle rozpoczyna się przygotowywanie wielu filtrów replik, takich jak ten powyżej. Pamiętaj, że te filtry są replikami komórek bakteryjnych zawierających zrekombinowane plazmidy, które rosną na ampicylinie, ale nie na streptomycynie. Liczbę filtrów replik, które muszą być przeszukiwane, można obliczyć na podstawie założeń i wzorów do oszacowania, ile kolonii należy przeszukać, aby reprezentować cały transkryptom (tj. liczbę różnych mRNA w pierwotnym komórkowym źródle mRNA). Po wykonaniu wymaganej liczby filtrów repliki są one poddawane: liza in situ do rozbijania ścian komórkowych i błon komórkowych. W rezultacie zawartość komórki zostaje uwolniona, a DNA ulega denaturacji (tj. staje się jednoniciowy). Następnie DNA przywiera do filtra w miejscu (na miejscu, gdzie były kolonie). Wynik liza in situ to filtr z niewyraźnymi śladami pierwotnej kolonii (poniżej).

Następnie molekularny sonda służy do identyfikacji DNA zawierającego interesującą sekwencję. Sonda jest często syntetyczny oligonukleotyd którego sekwencja została wywnioskowana ze znanych sekwencji aminokwasowych. Te oligonukleotydy są radioaktywne i umieszczane w torbie z filtrem (filtrami). DNA z komórek, które zawierały zrekombinowane plazmidy z cDNA będącym przedmiotem zainteresowania, zwiąże sondę komplementarną. Wyniki na miejscu liza i hybrydyzacja sondy radioaktywnej do filtra repliki pokazano poniżej.

Filtry są płukane w celu usunięcia niezwiązanej radioaktywnej sondy oligomerowej, a następnie umieszczane na kliszy rentgenowskiej. Po pewnym czasie naświetlania film jest wywoływany. W wyniku narażenia na promieniowanie radioaktywne na kliszy utworzą się czarne plamy, tworząc autoradiograf filtra. Czarne plamki na autoradiogramie odpowiadają koloniom na filtrze, które zawierają zrekombinowany plazmid z docelową sekwencją cDNA (poniżej).

Po zidentyfikowaniu pozytywnego klonu na błonie, odpowiednia zrekombinowana kolonia znajduje się na oryginalnej płytce. Kolonia ta hoduje się w płynnej hodowli i izoluje się plazmidowy DNA. W tym momencie sklonowany plazmidowy DNA można zsekwencjonować, a sekwencję aminokwasową kodowaną przez jego cDNA można wywnioskować ze słownika kodu genetycznego w celu sprawdzenia, czy cDNA wstawić w rzeczywistości koduje białko będące przedmiotem zainteresowania. Po zweryfikowaniu jako interesującej sekwencji, sklonowany plazmid cDNA może być radioaktywny lub fluorescencyjny i użyty do

  • sonda do genów, z których pochodzą.
  • zidentyfikować i oszacować ilościowo mRNA, a nawet zlokalizować transkrypty w komórkach.
  • ilościowo zmierzyć ilości określonych mRNA.

Wyizolowane cDNA plazmidu mogą nawet ulegać ekspresji w odpowiednich komórkach w celu wytworzenia kodowanego białka. Obecnie diabetycy nie otrzymują już świńskiej insuliny, ale otrzymują syntetyczną ludzką insulinę wytworzoną z wyrażonych ludzkich cDNA. Ponadto, podczas gdy wprowadzenie reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR, patrz poniżej) zastąpiły niektóre zastosowania cDNA, nadal odgrywają rolę w badaniach na poziomie genomu i transkryptomu.


Biblioteki genomowe

Przyszłość bibliotek genomowych

Konstrukcja biblioteki genomowej pozostaje ważną techniką w biologii molekularnej. Zasoby te mają kluczowe znaczenie dla analizy funkcji genów i wykrywania powiązanych genów z różnych źródeł. Biblioteki genomowe są obecnie wykorzystywane do znajdowania nowych produktów naturalnych, takich jak środki przeciwdrobnoustrojowe. Są również wykorzystywane do odkrywania i optymalizacji nowych ścieżek biochemicznych, takich jak te potrzebne do produkcji biopaliw i innych złożonych chemikaliów. Ponadto biblioteki genomowe pozostają niezbędnym narzędziem do gromadzenia ogromnej ilości informacji o sekwencjach wytwarzanych z NGS.

Wraz z pojawieniem się biologii syntetycznej możliwe jest manipulowanie fragmentami zawierającymi miliony par zasad, co pozwala na inżynierię całych ścieżek i genomów. Aktualną atrakcją tej technologii jest montaż całego genomu bakteryjnego (Laboratorium Mykoplazmy)) z podzbioru genów rodzicielskich, które zostały zsyntetyzowane w laboratorium. Niemniej jednak dostępne narzędzia są wciąż w powijakach, a technologia jest droga i czasochłonna. Przyszłość bibliotek genomowych może leżeć w metodach łatwego konstruowania sztucznych chromosomów zawierających dowolne pożądane elementy genetyczne przy użyciu łatwo dostępnych „cegiełek”. Takie metody mogą prowadzić do całkowicie syntetycznych, wstępnie zaprogramowanych genomów i są już opracowywane.


Biblioteka cDNA reprezentuje zbiór tylko genów, które są kodowane w białkach przez organizm. Komplementarny DNA lub cDNA jest tworzony poprzez odwrotną transkrypcję informacyjnego RNA, a biblioteka cDNA jest generowana przy użyciu technologii klonowania DNA.

Synteza DNA z matrycy RNA, poprzez odwrotną transkrypcję, wytwarza komplementarny DNA (cDNA). Alternatywnie, pierwsza nić cDNA może być wykonana jako dwuniciowa przy użyciu polimerazy DNA I i ligazy DNA. Te produkty reakcji można stosować do bezpośredniego klonowania bez amplifikacji.


Uwagi dotyczące biblioteki cDNA | Biblioteki DNA

W tym artykule omówimy bibliotekę cDNA:- 1. Znaczenie biblioteki cDNA 2. Zasada działania biblioteki cDNA 3. Wektory użyte w konstrukcji 4. Procedura w konstrukcji 5. Zalety 6. Wady 7. Zastosowania.

Znaczenie biblioteki cDNA:

Biblioteka cDNA jest zdefiniowana jako zbiór fragmentów cDNA, z których każdy został sklonowany do oddzielnej cząsteczki wektora.

Zasada działania biblioteki cDNA:

W przypadku bibliotek cDNA wytwarzamy kopie DNA sekwencji RNA (najczęściej mRNA) organizmu i klonujemy je. Nazywa się to biblioteką cDNA, ponieważ cały DNA w tej bibliotece jest komplementarny do mRNA i jest wytwarzany przez odwrotną transkrypcję tego ostatniego.

Wiele eukariotycznego DNA składa się z powtarzających się sekwencji, które nie są transkrybowane do mRNA i sekwencje te nie są reprezentowane w bibliotece cDNA. Należy zauważyć, że prokariota i niższe eukarionty nie zawierają intronów, a przygotowanie cDNA jest generalnie dla tych organizmów niepotrzebne. Stąd biblioteki cDNA są produkowane tylko z wyższych eukariontów.

Wektory użyte w Konstrukcji Biblioteki cDNA:

Zarówno DNA bakteryjny, jak i bakteriofagowy są używane jako wektory w konstrukcji biblioteki cDNA.

Poniższa tabela zawiera szczegółowe informacje i nieśmiałość:

Procedura budowy biblioteki cDNA:

Kroki związane z budową biblioteki cDNA są następujące:

1. Ekstrakcja mRNA z komórki eukariotycznej:

Po pierwsze, mRNA jest otrzymywany i oczyszczany z pozostałych RNA. Istnieje kilka metod oczyszczania RNA, takich jak ekstrakcja trizolu i oczyszczanie na kolumnie. Oczyszczanie kolumny odbywa się przy użyciu oligomerycznych żywic pokrytych jądrem i szyotydem dT, w których zwiąże się tylko mRNA zawierający ogon poli-A.

Pozostałe RNA są wymywane. mRNA jest eluowane przy użyciu buforu eluującego i trochę ciepła w celu oddzielenia nici mRNA od oligo-dT.

2. Konstrukcja cDNA z eks­tracted mRNA (ryc. 6.4):

Istnieją różne strategie konstruowania cDNA. Są one omówione w następujący sposób:

Zasada tej metody polega na tym, że komplementarna nić DNA jest syntetyzowana przy użyciu odwrotnej trans&szykryptazy w celu wytworzenia dupleksu RNA:DNA. Nić RNA jest następnie nacinana i zastępowana przez DNA. W tej metodzie pierwszym etapem jest łączenie chemicznie zsyntetyzowanego startera oligo-dT z ogonem 3′ poliA RNA.

Starter ma zazwyczaj długość 10-15 reszt i rozpoczyna (poprzez dostarczenie wolnego końca 3'8242) syntezę pierwszej nici DNA w obecności odwrotnej trans&szykryptazy i dezoksyrybonukleotydów. Pozostawia to dupleks RNA:DNA.

Następnym krokiem jest zastąpienie nici RNA nicią DNA. Odbywa się to za pomocą enzymu RNazy H, który usuwa RNA z dupleksu RNA:DNA. Tak pozostawiona nić DNA jest następnie uważana za matrycę, a druga nić DNA jest syntetyzowana przez działanie poli&szymerazy II DNA.

(b) Metoda samozasysająca:

Wiązało się to z zastosowaniem startera oligo-dT przyłączającego się na ogonie poliadenylanowym mRNA w celu zainicjowania syntezy pierwszej nici DNA przeciwko mRNA. Utworzony w ten sposób cDNA ma tendencję do przejściowego składania się na siebie, tworząc pętlę spinki do włosów. Powoduje to samoczynne zagruntowanie drugiej nici.

Po zsyntetyzowaniu drugiej nici DNA, pętla ta musi zostać rozszczepiona nukleazą specyficzną dla pojedynczej nici, np. nukleazą SI, aby umożliwić wstawienie do wektora klonowania i szyderstwa. Ta metoda ma poważną wadę. Cięcie nukleazą SI powoduje utratę pewnej ilości sekwencji na końcu 5′ klonu.

(c) Land i in. Strategia:

Po syntezie pierwszej nici, która jest jak zwykle primingowana starterem oligo-dT, cDNA łączy się z ciągiem reszt cytydyny przy użyciu enzymatycznej transferazy terminalnej. Ten sztuczny ogon oligo-dC jest następnie używany jako miejsce przyłączania dla syntetycznego startera oligo-dG, co pozwala na syntezę drugiej nici.

(d) Ogonowanie homopolimeru:

W tym podejściu wykorzystuje się enzymatyczną transferazę terminalną, która może polimeryzować nukleotydy na 3′-hydroksylu obu cząsteczek DNA i RNA. Przeprowadzamy syntezę pierwszej nici DNA zasadniczo jak poprzednio, aby wytworzyć hybrydę RNA:DNA.

Następnie używamy terminalnej transferazy i pojedynczego dezoksyrybonukleotydu, aby dodać ogony tego nukleotydu do końców 3′ zarówno nici RNA, jak i DNA. Wynikiem tego jest to, że nić DNA ma teraz znaną sekwencję na swoim końcu 3′. Zazwyczaj stosuje się dCTP lub dATP.

Komplementarny oligomer (syntetyzowany chemicznie) można teraz sparować i zastosować jako starter do kierowania syntezą i syntezą drugiej nici. Ten oligomer (a także ten stosowany do syntezy pierwszej nici) może dodatkowo zawierać miejsce restrykcyjne, aby pomóc w klonowaniu powstałego dwuniciowego cDNA.

(e) Szybka amplifikacja końców cDNA (RACE):

Czasami jest tak, że chcemy sklonować konkretny cDNA, dla którego mamy już pewne dane dotyczące sekwencji, ale ze szczególnym naciskiem na integralność końców 5′ lub 3′. W tym celu dostępne są techniki RACE (szybka amplifikacja końców cDNA). Metody RACE są podzielone na 3’RACE i 5’RACE, w zależności od tego, który koniec cDNA nas interesuje.

W tym typie RACE syntezę odwrotnej transkryptazy pierwszej nici DNA przeprowadza się przy użyciu zmodyfikowanego startera oligo-dT. Ten podkład zawiera odcinek o unikalnej sekwencji adaptacyjnej, po którym następuje odcinek oligo-dT. Po syntezie pierwszej nici następuje synteza drugiej nici z użyciem startera wewnętrznego względem sekwencji kodującej będącej przedmiotem zainteresowania.

Następnie następuje PCR przy użyciu

(i) Ten sam wewnętrzny starter i ‘

(ii) Sekwencja adaptera (tj. z pominięciem oligo-dT). Chociaż teoretycznie powinno być możliwe zastosowanie prostego startera oligo-dT w całości zamiast adaptora-oligo-dT i kombinacji adaptorów, niska temperatura topnienia startera oligo-dT może zakłócać kolejne rundy PCR.

W tym typie RACE pierwsza nić cDNA jest syntetyzowana z odwrotną transkryptazą i starterem z sekwencji kodującej. Starter Unincor&shiporated jest usuwany, a nici cDNA są ogonowane oligo-dA. Druga nić cDNA jest następnie syntetyzowana ze starterem adaptor-oligo-dT.

Powstałe dwuniciowe cząsteczki mol & shyecule są następnie poddawane reakcji PCR przy użyciu

(i) starter zagnieżdżony w regionie kodującym i

(ii) Sekwencja adaptera. Zagnieżdżony starter jest używany w końcowej reakcji PCR w celu poprawy specyficzności. Sekwencja adap­tor jest używana w reakcji PCR z powodu niskiej temperatury topnienia prostego startera oligo-dT, jak w 3’RACE powyżej. W handlu dostępnych jest wiele zestawów do RACE.

Metody ogonowania RNazy H i homopolimeru ostatecznie generują kolekcje dwuniciowych cząsteczek cDNA z tępymi końcami. Muszą być teraz połączone z cząsteczkami wektora. Można tego dokonać przez ligację z tępymi końcami lub przez dodanie łączników, trawienie enzymem względnym i ligację do wektora.

(b) Włączenie miejsc z ograniczeniami:

Możliwe jest zaadaptowanie metody ogonowania homopolimeru przez zastosowanie starterów, które są modyfikowane w celu włączenia restrykcji. Na diagramie przedstawionym na następnej stronie starter oligo-dT jest zmodyfikowany tak, aby zawierał miejsce restrykcyjne (na figurze miejsce Sail GTCGAC).

Koniec 3′ nowo zsyntetyzowanej pierwszej nici cDNA jest połączony z C’. Starter oligo-dG, ponownie poprzedzony miejscem Sail w krótkim dwuniciowym regionie oligonukleotydu, jest następnie stosowany do syntezy drugiej i drugiej nici.

Należy zauważyć, że ta metoda wymaga użycia oligonukleo&szytydu zawierającego region dwuniciowy. Takie oligonukleotydy wytwarza się przez zsyntetyzowanie i schyzowanie dwóch nici oddzielnie, a następnie umożliwienie ich wzajemnego połączenia.

(c) Ogonowanie homopolimeru cDNA:

Inną opcją jest ponowne użycie terminala transferase. Traktowanie dwuniciowego cDNA z tępymi końcami końcową transferazą i dCTP prowadzi do poli­meryzacji kilku reszt C (zwykle około 20) do 3′ hydroksylu na każdym końcu.

Traktowanie wektora terminalną transferazą i dGTP prowadzi do wbudowania i przemieszczenia kilku reszt G na końcach wektora. (Alternatywnie można zastosować dATP i dTTP.) Wektor i cDNA mogą teraz hybrydyzować, a region o parze zasad jest często tak rozległy, że leczenie ligazą DNA nie jest konieczne.

W rzeczywistości mogą występować raczej luki niż nacięcia na granicach wstawek wektora, ale są one ponownie zaburzane przez procesy fizjologiczne po wprowadzeniu zrekombinowanych cząsteczek do gospodarza.

Zalety biblioteki cDNA:

Biblioteka cDNA ma dwie dodatkowe zalety. Po pierwsze jest wzbogacony o fragmenty genów transkrybowanych ak­tywnie. Po drugie, introny nie przerywają sklonowanych sekwencji. Introny stanowiłyby problem, gdy celem jest pro&hydukacja białka eukariotycznego w bakteriach, ponieważ większość bakterii nie ma możliwości usunięcia intronów.

Wady biblioteki cDNA:

Wadą biblioteki cDNA jest to, że zawiera tylko sekwencje obecne w dojrzałym mRNA. Introny i wszelkie inne sekwencje zmienione po transkrypcji nie są sekwencjami obecnymi, takimi jak promotory i wzmacniacze, które nie są transkrybowane do RNA, również nie są obecne w bibliotece cDNA.

Należy również zauważyć, że biblioteka cDNA reprezentuje tylko te sekwencje genów eksprymowanych w tkance, z której wyizolowano RNA. Ponadto, częstość występowania parszytikularnej sekwencji DNA w bibliotece cDNA zależy od obfitości odpowiedniego mRNA w danej tkance. W przeciwieństwie do tego, prawie wszystkie geny są obecne z tą samą częstotliwością w bibliotece genomowego DNA.

Zastosowania biblioteki cDNA:

Poniżej znajdują się zastosowania cDNA Librar&Shyies:

1. Odkrycie nowych genów.

2. Klonowanie pełnej długości cząsteczek cDNA do badania funkcji genów in vitro.

3. Badanie repertuaru mRNA ulegających ekspresji w różnych komórkach lub tkankach.

4. Badanie alternatywnego splicingu w różnych i nieśmiałych komórkach lub tkankach.


Skonstruuj wysokiej jakości biblioteki cDNA o pełnej długości przy użyciu odwrotnej transkryptazy SuperScript i klonowania rekombinacyjnego Gateway (bez konieczności trawienia enzymami restrykcyjnymi) lub użyj standardowego klonowania opartego na enzymach restrykcyjnych.

  • Dowiedz się więcej o Zestaw konstrukcyjny biblioteki cDNA pełnej długości SuperScript, dostępny w handlu zestaw, który zawiera etap oczyszczania 5' CAP-mRNA, aby zapewnić pełną długość biblioteki cDNA.
  • Dowiedz się więcej o Zestaw do budowy biblioteki cDNA CloneMiner II
  • Zamówienie Zestawy konstrukcyjne biblioteki cDNA

Abstrakcyjny

Badanie przesiewowe bibliotek cDNA pod kątem genów kodujących białka, które oddziałują z białkiem przynęty, zwykle przeprowadza się w drożdżach. Jednak przedziały subkomórkowe i modyfikacje białek mogą się różnić w komórkach drożdży i roślin, co skutkuje błędną identyfikacją partnerów białkowych. Wykorzystaliśmy technologię komplementacji dwucząsteczkowej fluorescencji, aby przeszukać roślinną bibliotekę cDNA pod kątem białka przynęty bezpośrednio w roślinach. Jako dowód koncepcji użyliśmy N-końcowego fragmentu żółtego białka fluorescencyjnego – lub znakowanego nVenus Agrobacterium tumefaciens Białka VirE2 i VirD2 oraz domena C-końcowego wydłużenia (CTE) Arabidopsis thaliana odwrotna transkryptaza telomerazy jako przynęty do badań przesiewowych Arabidopsis Biblioteka cDNA kodująca białka znakowane C-końcowym fragmentem żółtego białka fluorescencyjnego. Bibliotekę kolonii reprezentujących ~2 x 105 cDNA umieszczono w 384-dołkowych płytkach. DNA wyizolowano z pul 10 płytek, pojedynczych płytek oraz poszczególnych rzędów i kolumn płytek. Sekwencyjne badanie przesiewowe podzbiorów cDNA w Arabidopsis liść lub tytoń (Nicotiana tabacum) Protoplasty Bright Yellow-2 zidentyfikowały pojedyncze klony cDNA kodujące białka, które oddziałują z jednym lub obydwoma Agrobacterium białka przynęty lub z CTE. Insercje T-DNA w genach reprezentowanych przez niektóre cDNA ujawniły pięć nowych Arabidopsis białka ważne dla Agrobacteriumpośredniczona transformacja roślin. Wykorzystaliśmy również tę bibliotekę cDNA do potwierdzenia białek oddziałujących z VirE2 w storczykach (Phalaenopsis amabilis) kwiaty. Tak więc tę technologię można zastosować do kilku gatunków roślin.


Przydatne linki

To jeden z ponad 2400 kursów na OCW. Przeglądaj materiały do ​​tego kursu na stronach, do których linki znajdują się po lewej stronie.

MIT OpenCourseWare to bezpłatna i otwarta publikacja materiałów z tysięcy kursów MIT, obejmująca cały program nauczania MIT.

Brak rejestracji lub rejestracji. Swobodnie przeglądaj i korzystaj z materiałów OCW we własnym tempie. Nie ma rejestracji ani dat rozpoczęcia ani zakończenia.

Wiedza jest twoją nagrodą. Korzystaj z OCW, aby kierować własnym uczeniem się przez całe życie lub uczyć innych. Nie oferujemy kredytu ani certyfikacji za korzystanie z OCW.

Stworzony do udostępniania. Pobierz pliki na później. Wyślij do przyjaciół i współpracowników. Modyfikuj, remiksuj i wykorzystuj ponownie (pamiętaj, aby podać OCW jako źródło).

O MIT OpenCourseWare

MIT OpenCourseWare to internetowa publikacja materiałów z ponad 2500 kursów MIT, swobodnie dzieląca się wiedzą z uczniami i nauczycielami na całym świecie. Dowiedz się więcej »

&skopiuj 2001&ndash2018
Instytut Technologii w Massachusetts

Korzystanie z witryny i materiałów MIT OpenCourseWare podlega naszej licencji Creative Commons i innym warunkom użytkowania.


Przydatne linki

To jeden z ponad 2400 kursów na OCW. Przeglądaj materiały do ​​tego kursu na stronach, do których linki znajdują się po lewej stronie.

MIT OpenCourseWare to bezpłatna i otwarta publikacja materiałów z tysięcy kursów MIT, obejmująca cały program nauczania MIT.

Brak rejestracji lub rejestracji. Swobodnie przeglądaj i korzystaj z materiałów OCW we własnym tempie. Nie ma rejestracji ani dat rozpoczęcia ani zakończenia.

Wiedza jest twoją nagrodą. Korzystaj z OCW, aby kierować własnym uczeniem się przez całe życie lub uczyć innych. Nie oferujemy kredytu ani certyfikacji za korzystanie z OCW.

Stworzony do udostępniania. Pobierz pliki na później. Wyślij do przyjaciół i współpracowników. Modyfikuj, remiksuj i wykorzystuj ponownie (pamiętaj, aby podać OCW jako źródło).

O MIT OpenCourseWare

MIT OpenCourseWare to internetowa publikacja materiałów z ponad 2500 kursów MIT, swobodnie dzieląca się wiedzą z uczniami i nauczycielami na całym świecie. Dowiedz się więcej »

&skopiuj 2001&ndash2018
Instytut Technologii w Massachusetts

Korzystanie z witryny i materiałów MIT OpenCourseWare podlega naszej licencji Creative Commons i innym warunkom użytkowania.


Peptydy syntetyczne jako antygeny

Konstrukcja biblioteki rekombinowanego DNA w λgt11

Biblioteki genomowe są wykorzystywane dla organizmów takich jak Drosophila lub drożdże, które mają mały rozmiar genomu i kilka intronów w ich sekwencjach kodujących. W tym przypadku liczba rekombinantów genomowych, które muszą być przeszukiwane w celu wyizolowania interesującego genu, nie jest zbyt duża. W przypadku organizmów, takich jak ssaki, które mają duży genom, konieczne jest wykorzystanie bibliotek cDNA. Konstrukcja bibliotek cDNA i genomowych została szczegółowo opisana (Ausubel i wsp., 1994-1997, O'Reilly i wsp., 1992 Sambrook i wsp., 1989).


Biblioteki shRNA

Biblioteki shRNA umożliwiają odwracalne badanie przesiewowe utraty funkcji w celu wyjaśnienia, które geny są zaangażowane w fenotyp. Każda biblioteka zawiera wiele sekwencji shRNA dla każdego genu docelowego. Prawdziwie dodatnie trafienie (konkretny gen docelowy) w badaniu przesiewowym shRNA powinno wykazywać spójne wyniki z wielu sekwencji shRNA, które go ukierunkowują. Biblioteki shRNA mogą być również opatrzone kodem kreskowym, aby umożliwić łatwą identyfikację shRNA, które niesie dana komórka.

Biblioteki DECIPHER to lentiwirusowe biblioteki shRNA z kodami kreskowymi przeznaczone do badań przesiewowych RNAi. Należy zauważyć, że te biblioteki nie obejmują całego genomu, każda biblioteka jest wzbogacona o mniejszy zestaw biologicznie istotnych genów. System kodów kreskowych DECIPHER ułatwia określenie, które shRNA zostały wzbogacone lub zubożone w populacji komórek. Każdy plazmid zawiera unikalny kod kreskowy 18 pz, który można łatwo zidentyfikować za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Od października 2016 roku biblioteki DECIPHER zostały wycofane.


Obejrzyj wideo: obróbka POSTtranskrypcyjna - #TRANSKRYPCJA #genetyka- KOREPETYCJE z BIOLOGII - 215 (Sierpień 2022).