Informacja

Rozmiary plików w Proteomics Experiments

Rozmiary plików w Proteomics Experiments


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Zastanawiałem się, jakie rozmiary plików ma typowy eksperyment proteomiczny w każdej fazie (identyfikacja i kwantyfikacja).|

Ponadto, w jaki sposób typ kwantyfikacji (względny, bezwzględny) wpływa na rozmiar plików wyjściowych.


Może się to znacznie różnić w zależności od długości przebiegu, samej próbki, rodzaju metody, a może nawet producenta instrumentu.

Istnieją również różne podejścia do przeprowadzania względnej i bezwzględnej kwantyfikacji, ale nie spodziewałbym się, że te czynniki będą miały największy wpływ na rozmiar pliku. Pewne parametry metody, takie jak ustawienia profilu/centroidu i długość przebiegu, są prawdopodobnie najważniejszymi czynnikami.

Mam pliki proteomiczne dla próbek ilościowych oznaczonych TMT z 2 godzinnym czasem trwania, które zostały zebrane w tryb centroid dla ms2 i ms3. Te mają 800-900 MB. Mniejszy ładunek próbki przy użyciu tej samej metody ma plik o rozmiarze 600 MB.

Mam też pliki z tą samą konfiguracją, ale zebrane w całości w tryb profilu które są 3-4 GB.


Może powinieneś trochę bardziej zdefiniować „typowy eksperyment proteomiczny”. Ogólnie rzecz biorąc, @Nathan ma rację w swoim komentarzu na temat trybu centroid / profilu.

Z mojego punktu widzenia typowym eksperymentem byłaby akwizycja zależna od danych (DDA, czyli „proteomika shotgun”), przy użyciu 90-minutowego gradientu na popularnym instrumencie ThermoFisher Orbitrap. Prowadziłoby to zazwyczaj do rozmiarów plików około 400-500 MB.

Wzmocnienie standardów peptydów lub białek w celu przeprowadzenia bezwzględnej oceny ilościowej nie spowoduje, że pliki będą znacznie większe.


HADDOCK podstawowy samouczek dotyczący dokowania białko-białko

Ten samouczek zademonstruje zastosowanie HADDOCK do przewidywania struktury kompleksu białko-białko na podstawie danych perturbacji przesunięcia chemicznego NMR (CSP). Mianowicie zadokujemy dwa białka E. coli biorące udział w transporcie glukozy: enzym specyficzny dla glukozy IIA (E2A) oraz białko fosfonośne zawierające histydynę (HPr). Struktury w postaci wolnej wyznaczono za pomocą krystalografii rentgenowskiej (E2A) (PDB ID 1F3G) oraz spektroskopii NMR (HPr) (PDB ID 1HDN). Strukturę natywnego kompleksu określono również za pomocą NMR (PDB ID 1GGR). Te eksperymenty NMR dostarczyły nam również szeregu danych na temat samej interakcji (zaburzenia przesunięcia chemicznego, międzycząsteczkowe NOE, resztkowe sprzężenia dipolarne i dane symulowanej anizotropii dyfuzji), które będą przydatne do dokowania. W tym samouczku wykorzystamy tylko reszty interfejsu zidentyfikowane na podstawie danych zaburzeń przesunięcia chemicznego NMR, jak opisano w Wang i inni, EMBO J (2000).

W tym samouczku wykorzystamy serwer sieciowy HADDOCK2.2. Opis naszego serwera WWW można znaleźć w następujących publikacjach:

GCP van Zundert, J.P.G.L.M. Rodrigues, M. Trellet, C. Schmitz, P.L. Kastritis, E. Karaca, A.S.J. Melquiond, M. van Dijk, S.J. de Vries i A.M.J.J. Bonvina. Serwer sieciowy HADDOCK2.2: Przyjazne dla użytkownika integracyjne modelowanie kompleksów biomolekularnych. J. Mol. Biol., 428, 720-725 (2015).

SJ de Vries, M. van Dijk i A.M.J.J. Bonvina. Serwer sieciowy HADDOCK do dokowania biomolekularnego opartego na danych. Protokoły natury, 5, 883-897 (2010). Pobierz otwartą wersję tutaj.

W całym samouczku kolorowy tekst będzie używany do odwoływania się do pytań lub instrukcji i/lub poleceń PyMOL.


Jak obliczyć wielkość próby w badaniach na zwierzętach?

Obliczanie wielkości próby jest jednym z ważnych elementów projektowania wszelkich badań, w tym badań na zwierzętach. Jeśli badacz wybierze mniejszą liczbę zwierząt, może to prowadzić do pominięcia jakiejkolwiek znaczącej różnicy, nawet jeśli występuje ona w populacji, a jeśli większa liczba wybranych zwierząt może prowadzić do niepotrzebnego marnowania zasobów i może prowadzić do problemów etycznych. W niniejszym artykule na podstawie dokonanego przez nas przeglądu literatury zaproponowaliśmy kilka metod obliczania wielkości próby do badań na zwierzętach.

Ile zwierząt powinienem wykorzystać do mojego badania? To jedno z najbardziej mylących pytań, przed jakimi staje badacz. Zbyt mała wielkość próbki może nie mieć rzeczywistego efektu w eksperymencie, a zbyt duża wielkość próbki doprowadzi do niepotrzebnego marnowania zasobów i zwierząt.[1] Kwestia wielkości próby została odpowiednio podkreślona w przypadku prób klinicznych i badań klinicznych, ale w przypadku badań na zwierzętach w opublikowanej literaturze nie została zbytnio zbadana. Bardzo ważne jest, aby uczyć młodych badaczy i doktorantów o znaczeniu i metodach obliczania wielkości próby. Aby wyjaśnić tę kwestię wielkości próby w badaniach na zwierzętach, postanowiliśmy przeszukać różne dostępne artykuły dotyczące wielkości próby w badaniach na zwierzętach. Przeszukaliśmy PubMed przy użyciu różnych terminów MeSH, takich jak “rozmiar próbki,” “obliczanie rozmiaru próbki,” �nia zwierząt” itp. oraz ich kombinacji. Przeszukaliśmy również różne artykuły za pośrednictwem Google i Google Scholar. Przeszukaliśmy również różne strony internetowe związane z badaniami na zwierzętach (http://www.3rs-reduction.co.uk/html/6__power_and_sample_size.html, http://www.acuc.berkeley.edu/, http://www. bu.edu/orccommittees/iacuc/policies-and-guidelines/sample-size-calculations/, http://www.ucd.ie/researchethics/etc.). Pierwszy autor zapoznał się z całą dostępną literaturą, a zrozumienie koncepcji następuje w porozumieniu z drugim autorem. W tym miejscu wyjaśniamy pokrótce metodę obliczania wielkości próby w badaniach na zwierzętach na podstawie przeprowadzonego przez nas przeglądu literatury.

Zasadniczo istnieją dwie metody obliczania wielkości próby w badaniach na zwierzętach. Najbardziej ulubioną i najbardziej naukową metodą jest obliczenie wielkości próby za pomocą analizy potęgowej.[2] Należy dołożyć wszelkich starań, aby obliczyć wielkość próby tą metodą. Metoda ta jest podobna do metody stosowanej do obliczania wielkości próby dla prób klinicznych i badań klinicznych. Proste obliczenia można przeprowadzić ręcznie za pomocą pewnego wzoru [Załącznik 1], ale w przypadku złożonych obliczeń można użyć oprogramowania statystycznego lub skorzystać z pomocy statystyka. Aby obliczyć wielkość próby za pomocą analizy potęgowej, badacz musi posiadać wiedzę i informacje na temat tych pojęć:

Wielkość efektu: Jest to różnica między średnią z dwóch grup (dane ilościowe) lub proporcjami zdarzeń w dwóch grupach (dane jakościowe). Badacz powinien zdecydować przed rozpoczęciem badania, jaka minimalna różnica między dwiema grupami może być uznana za klinicznie istotną. Pomysł o klinicznie istotnej różnicy między grupami najlepiej zaczerpnąć z wcześniej opublikowanych badań[2,3,4,5]

Odchylenie standardowe: Odchylenie standardowe mierzy zmienność w próbce. Informacja o odchyleniu standardowym jest potrzebna tylko w przypadku zmiennych ilościowych. Informacje o odchyleniu standardowym danej zmiennej można zaczerpnąć z wcześniej opublikowanych badań. Jeśli takie badanie nie jest dostępne, autor powinien najpierw przeprowadzić badanie pilotażowe, a odchylenie standardowe można obliczyć na podstawie badania pilotażowego[2,3,4,5]

Błąd typu 1: jest mierzony poziomem istotności, który zwykle jest ustalany na poziomie 5% (P = 0,05). Jest to wartość dowolna i można ją zmniejszać lub zwiększać w zależności od pytania badawczego[2,3,4,5]

Siła: Siła badania to prawdopodobieństwo znalezienia efektu, który badanie ma znaleźć. Może to być od 80% do nawet 99% w zależności od pytania badawczego, ale zwykle jest ono utrzymywane na poziomie 80%[2,3,4,5]

Kierunek efektu (jednostronny lub dwustronny): Gdy badacz chce zbadać efekt jakiejś interwencji, rzeczywisty efekt obserwowany w próbce może być w tym samym kierunku, w jakim myślał badacz, lub może być przeciwny do tego. Jeśli badacz uważa, że ​​efekt może być w obu kierunkach, powinien zastosować test z dwoma ogonami, a jeśli ma silne powody, by sądzić, że efekt leży w jednym kierunku, może użyć testu z jednym ogonem. W badaniach na zwierzętach zwykle stosuje się testy z dwoma ogonami [2]

Testy statystyczne: Aby obliczyć wielkość próby, ważne jest, aby mieć pojęcie o teście statystycznym, który ma być zastosowany do danych. W przypadku prostych testów statystycznych, takich jak test t-Studenta lub test chi-kwadrat, można przeprowadzić ręczne obliczenia na podstawie wzoru [Załącznik], ale w przypadku złożonych testów, takich jak ANOVA lub testy nieparametryczne, potrzebna jest pomoc statystyka lub użycie oprogramowania. 2,4]

Spodziewane ścieranie lub śmierć zwierząt: Ostateczną wielkość próbki należy dostosować do oczekiwanego ścierania. Załóżmy, że naukowiec spodziewa się 10% ścierania, a następnie wielkość próby obliczoną za pomocą wzoru lub oprogramowania należy podzielić przez 0,9, aby uzyskać rzeczywistą wielkość próby. Załóżmy, że wielkość próbki obliczona przez oprogramowanie wynosi 10 zwierząt na grupę, a badacz spodziewa się 10% ścierania, to jego ostateczna wielkość próbki wyniesie 11 zwierząt na grupę (10/0,9 = 11,11). Podobnie dla 20% ścieralności wielkość próby należy podzielić przez 0,8.[5] Można to wyjaśnić w postaci ustrukturyzowanej formuły, tj.

Skorygowana wielkość próby = Wielkość próby/ (1− [% wyniszczenia/100])

Sugerujemy korzystanie z bezpłatnego oprogramowania G Power (Faul, Erdfelder, Lang i Buchner, 2007) do obliczania wielkości próbki. To oprogramowanie jest równie dobre do obliczania wielkości próbki w badaniach klinicznych. To oprogramowanie może być używane do prostych i złożonych obliczeń wielkości próbki.[6] G Power może obliczyć wielkość próby na podstawie wcześniej zaprojektowanej wielkości efektu przy małej, średniej i dużej różnicy między grupami w oparciu o zasady Cohena.[7] Informacje na temat innego dostępnego bezpłatnie oprogramowania i kalkulatorów do obliczania wielkości próbki znajdują się w Załączniku 2. Bardziej złożona wielkość próbki będzie wymagać bardziej zaawansowanego oprogramowania, takiego jak “nQuery advisor” lub “MINITAB.”

Druga metoda kalkulacji to prostacka metoda oparta na prawie malejącego zwrotu. Ta metoda nosi nazwę “resource równania” metoda.[2,8,9] Ta metoda jest używana, gdy nie można założyć wielkości efektu, aby uzyskać wyobrażenie o odchyleniu standardowym, ponieważ nie są dostępne żadne wcześniejsze wyniki lub gdy wiele punkty końcowe są mierzone lub do analizy stosowana jest złożona procedura statystyczna. Metodę tę można również zastosować w niektórych badaniach eksploracyjnych, w których testowanie hipotez nie jest głównym celem, ale badacza interesuje jedynie znalezienie jakiegokolwiek poziomu różnicy między grupami.

Zgodnie z tą metodą mierzona jest wartość 𠇎”, która jest niczym innym jak stopniem swobody analizy wariancji (ANOVA). Wartość E powinna wynosić od 10 do 20. Jeśli E jest mniejsze niż 10, dodanie większej liczby zwierząt zwiększy szansę na uzyskanie bardziej znaczącego wyniku, ale jeśli jest większe niż 20, dodanie większej liczby zwierząt nie zwiększy szansy na uzyskanie znaczącego wyniku wyniki. Chociaż ta metoda opiera się na ANOVA, ma zastosowanie do wszystkich eksperymentów na zwierzętach. Każdą wielkość próbki, która utrzymuje E między 10 a 20, należy uznać za odpowiednią. E można zmierzyć według następującego wzoru:

E = Całkowita liczba zwierząt − Całkowita liczba grup

Załóżmy, że badacz chce zobaczyć działanie leku i stworzył pięć grup (jedna grupa jako kontrolna i cztery grupy z różnymi dawkami tego leku) po 10 szczurów w każdej. W tym przypadku E będzie

E = 50 − 5 = 45, czyli więcej niż 20, stąd wielkość próby w tym eksperymencie jest więcej niż konieczna. Jeśli jednak wielkość próby wynosi pięć na grupę, to E będzie wynosić 20, co jest dopuszczalnym limitem, a zatem może być uważane za odpowiednią wielkość próby.

Ta metoda jest łatwa, ale nie może być uważana za tak solidną jak metoda analizy mocy.

Chcielibyśmy zaproponować badaczom umieszczenie w manuskrypcie, który chcą opublikować, oświadczenia o sposobie obliczania wielkości próby i uzasadnieniu wielkości próby. Zwierzęta w badaniach: Raportowanie in vivo wytyczne dotyczące eksperymentów zalecają zamieszczenie oświadczenia zawierającego uzasadnienie liczebności próby użytej w badaniach oraz szczegóły metody obliczania liczebności próby.[10] Wszystkie składniki obliczania wielkości próby, takie jak wielkość efektu, błąd typu 1 i typu 2, test jednostronny/dwustronny, odchylenie standardowe itp., należy przedstawić w rękopisie przesłanym do publikacji w sposób sugerowany do badań klinicznych.[11] ] Niedobór zasobów (budżetu, siły roboczej), ograniczenia czasowe itp. nie mogą być traktowane jako uzasadnione uzasadnienie decyzji o wielkości próby. Wielu badaczy uważa sześć zwierząt na grupę za odpowiednią wielkość próby, ale po przejrzeniu dostępnej literatury na ten temat doszliśmy do wniosku, że pojęcie sześciu zwierząt na grupę ma niewielkie podstawy naukowe i statystyczne. Jest to krótki opis, a czytelnicy proszeni są o przeczytanie większej ilości dostępnych zasobów w celu lepszego zrozumienia różnych pojęć związanych z obliczaniem wielkości próby w badaniach na zwierzętach.


Poznaj metody i technologie analizy białek

Biologia białek obejmuje zarówno badanie struktury i funkcji białek jako główny przedmiot badań, jak i wykorzystanie przeciwciał, białek i peptydów jako narzędzi do oczyszczania, wykrywania i charakteryzowania systemów biologicznych. Niektóre metody analizy białek, takie jak Western blot i ELISA, są rutynowo stosowane w laboratoriach od wielu lat. Inne, takie jak ilościowa spektrometria masowa białek, to stosunkowo nowe i szybko rozwijające się technologie. Nieustannie opracowywane są nowe narzędzia i produkty, aby rozwijać wszystkie aspekty badań nad biologią białek.

Celem tego centrum edukacyjnego jest połączenie naukowców (zarówno nowych, jak i doświadczonych) z naszymi licznymi zasobami do nauki o metodach i produktach analizy białek.


Abstrakcyjny

Przedmiotem tego samouczka jest identyfikacja i charakterystyka białek poprzez przeszukiwanie baz danych MS/MS Data. Peptide Mass Fingerprinting jest wykluczony, ponieważ jest omówiony w osobnym samouczku.

Podkreślono praktyczne aspekty przeszukiwania bazy danych, takie jak wybór bazy danych sekwencji, wpływ tolerancji masy oraz sposób identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych. Omówiono związek między czułością a swoistością, podobnie jak wyzwanie związane z wykorzystaniem informacji o dopasowaniu peptydów do wywnioskowania, które białka były obecne w próbce.

Ponieważ te samouczki mają charakter wprowadzający, większość odniesień dotyczy recenzji, a nie podstawowych artykułów naukowych. Zakłada się pewną znajomość spektrometrii masowej i chemii białek. Dołączona jest prezentacja slajdowa, w tym notatki prelegenta oraz zbiór internetowych, praktycznych ćwiczeń, zaprojektowanych w celu wzmocnienia kluczowych punktów. Ten samouczek jest częścią Międzynarodowy program ćwiczeń proteomicznych (IPTP 6).


PROTOKÓŁ ALTERNATYWNY 1

DODATKOWY EKRAN OPTYMALIZUJĄCY STABILNOŚĆ BIAŁKA

Ten wtórny protokół jest idealny do badań przesiewowych szerokiej gamy dodatków po zidentyfikowaniu zoptymalizowanego buforu w protokole podstawowym.

Materiały

Takie same materiały jak w przypadku protokołu podstawowego 1

96-dołkowy blok z głębokimi studniami zawierający 5× wybranego przesiewacza addytywnego (patrz Tabela 2)

Tabela 2

Skład 96-dołkowego ekranu dodatku

DobrzePrzyłączeniowyDobrzePrzyłączeniowy
A1wodaE15 mM EDTA
A2wodaE2100 mM fluorek sodu
A3wodaE3100 mM fluorek potasu
A4wodaE 4100 mM chlorek litu
A5100 mM mocznikE5100 mM chlorek potasu
A6250 mM mocznikE6100 mM chlorek amonu
A7500 mM mocznikE7100 mM jodek sodu
A81 mln mocznikaE8100 mM jodek potasu
A925 mM chlorowodorek guanidynyE9100 mM bromek sodu
A1050 mM chlorowodorek guanidynyE1010 mM chlorek magnezu
A11100 mM chlorowodorek guanidynyE1110 mM chlorek wapnia
A12250 mM chlorowodorek guanidynyE125 mM chlorek manganu
B1500 mM chlorowodorek guanidynyF15 mM chlorek niklu
B21% (v/v) DMSOF25 mM chlorek żelaza (III)
B32% (v/v) DMSOF35 mM chlorek cynku
B42,5% (v/v) GlicerolF45 mM chlorek kobaltu
B55% (v/v) GlicerolF5100 mM mrówczan sodu
B610% (v/v) GlicerolF6100 mM octan sodu
B715% (v/v) GlicerolF7100 mM malonian sodu
B820% (v/v) GlicerolF8100 mM azotan sodu
B92,5% (v/v) D-glukozyF9100 mM rodanku sodu
B105% (v/v) D-glukozyF10100 mM siarczan sodu
B112,5% (v/v) SacharozaF11100 mM siarczan amonu
B125% (v/v) SacharozaF12100 mM chlorek amonu
C12,5% (v/v) PEG400G12 mM AMP + 5 mM MgCl2
C25% (v/v) PEG400G22 mM ADP + 5 mM MgCl2
C32,5% (w/v) PEG1000G32 mM ATP + 5 mM MgCl2
C45% (w/v) PEG1000G42 mM AMPPNP + 5 mM MgCl2
C52,5% (w/v) PEG4000G52 mM cAMP + 5 mM MgCl2
C65% (w/v) PEG4000G62 mM PKB + 5 mM MgCl2
C72,5% (v/v) glikolu etylenowegoG72 mM GTP + 5 mM MgCl2
C85% (v/v) glikol etylenowyG82 mM cGMP + 5 mM MgCl2
C91 mM glukozyd oktylowyG92 mM NAD + 5 mM MgCl2
C102 mM CHAPSG102 mM NADH + 5 mM MgCl2
C1110 mM L-ProlinaG1110 mM betainy
C1250 mM L-GlicynaG121 mM plemnika
D125 mM L-histydynaH11 mM Spermidyna (za każdym razem dodawaj świeżą)
D250 mM L-argininyH210 mM β-merkaptoetanol (za każdym razem dodawać świeży)
D350 mM L-glutaminianH35 mM DTT (za każdym razem dodawaj świeże)
D450 mM L-Arg/50 mM L-GluH42 mM TCEP (za każdym razem dodawaj świeże)
D525 mM L-GlutaminyH5otwarte na dodatki określone przez użytkownika
D650 mM L-lizynaH6otwarte na dodatki określone przez użytkownika
D750 mM L-cysteinyH7otwarte na dodatki określone przez użytkownika
D850 mM taurynaH8otwarte na dodatki określone przez użytkownika
D950 mM imidazol pH 7,6H9otwarte na dodatki określone przez użytkownika
D10100 mM imidazol pH 7,6H10otwarte na dodatki określone przez użytkownika
D11250 mM imidazol pH 7,6H11otwarte na dodatki określone przez użytkownika
D12500 mM imidazol pH 7,6H12otwarte na dodatki określone przez użytkownika

Wymienione stężenia reprezentują końcowe stężenie w teście przesunięcia termicznego.

Zapasy powinny być wykonane w stężeniu 5×.

Uwaga: Przed użyciem należy doprowadzić ekran dodatku 5× do temperatury pokojowej z miejsca przechowywania 4ଌ (

Dodać wystarczającą ilość zoptymalizowanego buforu (w stężeniu 1×, zidentyfikowanym na powyższym ekranie optymalizacji początkowego buforu) do roztworu białkowego w 15 ml probówce stożkowej, aby uzyskać końcową objętość 5 ml, wystarczającą do przeszukania jednej 96-dołkowej płytki testowej. Dodaj 4 µl barwnika SYPRO Orange (stężenie zapasu: 5000×). Końcowe stężenia białka i barwnika w mieszaninie powinny wynosić odpowiednio 5µM i 2×.

Dokładnie wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki i umieścić roztwór w rynnie zbiornika wielokanałowej pipety. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 40 μl roztworu do każdego dołka płytki testowej.

Wirówka w temperaturze pokojowej 5× płyta sitowa dodatku przy 800× g przez 2 min w 25 ଌ.

Ostrożnie odklej samoprzylepną aluminiową folię uszczelniającą. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 10 µl 5× roztworów do przesiewania dodatków z 96-dołkowego bloku z głębokimi dołkami na płytkę testową. Wymieszaj zawartość dołków za pomocą tej samej pipety i końcówek, pipetując kilka razy w górę i w dół.

Zaprojektuj swój 96-dołkowy ekran dodatków tak, aby były co najmniej cztery dołki bez dodatków (tj. woda tylko w dołkach A1� na 96-dołkowej płytce przesiewowej dodatku) w celu oceny przesunięcia termicznego dodatków względem zoptymalizowanego buforu.

Przykryj płytkę testową warstwą optycznie przezroczystego kleju i ostrożnie uszczelnij każdą studzienkę. Ponownie uszczelnij sitko dodatku za pomocą samoprzylepnej folii aluminiowej i przechowuj w temperaturze 4 ଌ.

Odwiruj płytkę testową przy 800 × g przez 2 min w 25°C w celu zebrania roztworów na dnie i usunięcia pęcherzyków z dołków.

Umieść płytkę testową w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym i uruchom program gradientu temperatury dla termicznej denaturacji białka.

Określ przesunięcie termiczne (ΔTm) wszystkich warunków w odniesieniu do kontroli „bez dodatku” w celu identyfikacji dodatków, które sprzyjają stabilizacji białka.


Obserwacja Xylem w Seler

Wszystkie rośliny potrzebują wody, aby przetrwać. Aby odprowadzić wodę z gleby do pędów i liści, rośliny rozwinęły system transportu wody. Ten system nazywa się „ksylem”. Ruch wody przez transport ksylemu możemy obserwować umieszczając łodygi selera w kolorowej wodzie. Kolorowa woda przepływa przez łodygę i w górę do liści, uwidaczniając drogę wody przez ten system.

Co będziesz potrzebował:

  • Pojemnik taki jak słoik lub wazon
  • Seler
  • Barwnik spożywczy
  • Miarka
  • Woda

Wskazówki

  1. Dodaj 1 szklankę wody do pustego pojemnika. Dodaj 2 krople barwnika spożywczego do wody (lub tyle, ile potrzeba do uzyskania pożądanego koloru) i dobrze wymieszaj, aby wymieszać.
  1. Wybierz łodygę selera, która ma przymocowane liście. Odetnij około 1 cal od spodu łodygi.
  1. Umieść łodygę pionowo w pojemniku, upewniając się, że spód łodygi jest zanurzony w wodzie.
  1. Pozostaw seler na noc. Obserwuj, co się dzieje. Wyjmij seler z wody i rozetnij go, aby lepiej przyjrzeć się ścieżce, którą przebyła woda.

Co się dzieje?

Rośliny wykorzystują system zwany ksylemem, który wyciąga wodę z ziemi i transportuje ją przez pęd do liści. Ten proces jest pasywny, co oznacza, że ​​nie wymaga żadnej energii, aby mógł zajść. Dlatego seler był w stanie w ciągu nocy nabrać wody. Seler przeciągnął barwną wodę przez łodygę za pośrednictwem systemu transportu ksylemu. Kolorowa woda przedostała się do liści, plamiąc je.

System transportu ksylemu jest wyraźniej widoczny podczas krojenia selera. Kolorowa woda barwi komórki ksylemu, czyniąc je widocznymi.

Jednym ze zjawisk, które napędza przepływ wody przez roślinę, jest transpiracja. Transpiracja to nazwa nadana procesowi parowania wody z liści rośliny. Jak myślisz, co by się stało, gdybyśmy powtórzyli eksperyment z łodygą selera, której liście zostały odcięte? Wypróbuj i przekonaj się!


Teoria i dyskusja statystyczna

Rozważ porowate podłoże zanurzone w roztworze białka. Powierzchnia porowatego ośrodka ma n por pory w kontakcie z roztworem. Zakłada się, że powierzchnia materiału, z którego wykonany jest ośrodek porowaty, przyciąga cząsteczki białka w roztworze. Porowaty ośrodek z n por pory na jego powierzchni przyczyniają się do powstania dużej ilości r do szybkości zarodkowania niejednorodnego, gdzie r jest podane przez gdzie ΔF* i jest barierą energii swobodnej dla niejednorodnego zarodkowania w porach i, a v jest częstotliwością prób zarodkowania (12). Zakładamy, że w każdym porach niejednorodne zarodkowanie jest po prostu przekroczeniem bariery energii swobodnej o pewnej wysokości ΔF* i to zmienia się w zależności od porów i że częstotliwość prób ν jest taka sama we wszystkich porach. k b oraz T są odpowiednio stałą Boltzmanna i temperaturą bezwzględną. ν ma wymiary czasu odwrotnego. Jest to rząd szybkości, z jaką cząsteczki białka dyfundują z roztworu do rosnącego jądra (12).

Nieuporządkowany ośrodek porowaty, w przeciwieństwie do, powiedzmy, zeolitu, będzie miał rozkład rozmiarów porów. Będzie trochę średniej średnicy porów mD i pewne odchylenie standardowe σ D wielkości porów wokół tej średniej. Pojedynczy por charakteryzuje się nie tylko średnicą, ale także kształtem: mogą być dwa pory, jeden długi i cienki, a drugi bardziej kulisty, ale oba mają tę samą średnią średnicę. Tak więc każdy por jest określony nie tylko przez jego średnicę D ale także przez pewien zestaw parametrów kształtu. W zasadzie, gdybyśmy znali rozkład rozmiarów i kształtów porów i mogli obliczyć barierę jako ich funkcję, moglibyśmy obliczyć szybkość równania. 1. Jednak poza pewnymi danymi o rozkładzie średnic nie mamy żadnego z tych parametrów. Dlatego opracowaliśmy prosty model fenomenologiczny zmienności średnicy i kształtu energii swobodnej jądra krytycznego, który po prostu wyraża zmienność średnicy jako szereg Taylora wokół optymalnej wielkości porów, a zmienność kształtu po prostu jako zmienną losową. Średnicę traktujemy również jako zmienną losową. Użycie jednego parametru kształtu jest po prostu dla uproszczenia. Oznaczymy parametr średnicy i kształtu porów i za pomocą Di oraz si, odpowiednio. Parametr kształtu s jest zdefiniowany tak, że kształt porów i wnosi kwotę si do swobodnej energii jądra. Ponadto definiujemy s tak, że to znaczy 〈s 〉 = 0.

Będzie jakaś optymalna średnica, Do, średnica, przy której bariera energii swobodnej jest najniższa. Tę najniższą wartość bariery oznaczamy przez . Rozwijając się wokół tej minimalnej wartości mamy, że bariera swobodnej energii w porach i jest tam, gdzie zachowaliśmy tylko wiodący, kwadratowy termin. Stała sztywności, która daje wzrost bariery swobodnej energii, gdy pory stają się za duże lub za małe, wynosi κ D.

Biorąc Di oraz si z funkcji rozkładu prawdopodobieństwa PD oraz Ps, odpowiednio, średnia lub wartość oczekiwana szybkości zarodkowania niejednorodnego jest dana przez Przyjmujemy, że obie średnice D i kształty s mają rozkłady prawdopodobieństwa Gaussa o szerokościach σ D i s, odpowiednio. Średnia średnica wynosi mD, a z definicji średnia s wynosi zero. Następnie równanie. 3 można łatwo ocenić, a średnia stawki r jest podane przez Prawa strona równania to liczba porów razy średnia szybkość w porach o optymalnym rozmiarze i razy nakładanie się dwóch gaussów: jeden to rozkład średnic porów, a drugi to zmienność szybkości , wykładnik równania. 2.

Równanie na wskaźnik 〈r , równ. 4, zawiera wykładnik : bariery swobodnej energii w porach o optymalnej wielkości i najbardziej prawdopodobnej wartości (s = 0) parametru kształtu. Nie wiemy, jaka jest wartość, a więc nie możemy przewidywać bezwzględnej szybkości zarodkowania, a jedynie tego, jak się ona zmienia. Tak więc, gdy wykreślamy wskaźnik, używamy arbitralnych jednostek dla 〈r 〉 i po prostu badaj jego zmienność za pomocą parametrów, takich jak wielkość zarówno porów, jak i białek. Przyjmiemy, że powierzchnia ciała stałego, z którego składa się ośrodek porowaty, co najmniej słabo przyciąga cząsteczki białka oczywiście, gdyby istniało między nimi odpychanie, cząsteczki białka byłyby wykluczone z porów i ośrodek porowaty byłby niezdolny do działania jako nukleant.

Ponieważ białka badane w eksperymentach miały różne promienie, a więc przypuszczalnie różne optymalne rozmiary porów, wykreśliliśmy na ryc. 1 szybkość zarodkowania jako funkcję optymalnej wielkości porów, Do. Pozostałe parametry są utrzymywane na stałym poziomie. Oczekujemy Do zwiększać się wraz z wielkością białka. Więc x oś na Fig. 1 w przybliżeniu odpowiada wielkości krytycznego jądra, która jest kilka razy większa od średnicy białka. Krzywa ciągła dotyczy ośrodka porowatego o szerokim rozkładzie wielkości porów, σ D = 3 nm, a krzywa przerywana jest dla wąskiego rozkładu, σ D = 0,5 nm. W przypadku szerokiego rozkładu szybkość zarodkowania zmienia się o nieco więcej niż rząd wielkości dla jąder o Do w całym zakresie od 2,5 do 15 nm. Zatem przewidujemy, że porowate podłoże o szerokim rozkładzie rozmiarów porów powoduje szybką nukleację białek o szerokim zakresie rozmiarów. W przeciwieństwie do tego, ośrodek porowaty o wąskim zakresie rozmiarów porów będzie skutecznym zarodnikiem tylko dla jąder o bardzo określonej wielkości.

Średnia szybkość zarodkowania heterogenicznego na miejsce, 〈r 〉 (w jednostkach arbitralnych), jako funkcja optymalnej wielkości porów dla zarodkowania białka, Do. Pory mają średnią średnicę porów mD = 7,5 nm i wykreśliliśmy wyniki dla odchyleń standardowych wielkości porów σ D = 3 nm, krzywa ciągła i 0,5 nm, krzywa przerywana. Współczynnik sztywności dla zmienności bariery o wielkości porów κ D miał być D = 10k b T nm –2 .

W krystalizacji białek i wielu innych obszarach kluczowe jest nie tylko wywoływanie zarodkowania, ale także jego kontrolowanie: tworzenie zbyt wielu jąder może być tak poważnym problemem, jak brak tworzenia się zarodków. Zastanówmy się więc teraz, ile jąder tworzy się na danym kawałku porowatego ośrodka. Zazwyczaj większość porów ma niewłaściwy kształt i rozmiar, a więc ma związane z nimi duże bariery energii swobodnej, zarodki tworzą się tylko w niewielkiej części porów, które są odpowiednie do zarodkowania. Teraz interesują nas warunki, w których zachodzi zarodkowanie, więc wymagamy, aby co najmniej jeden por miał niską barierę zarodkowania. Oznaczamy minimum zbioru wszystkich n por bariery darmowej energii F* i za pomocą F*min. Następnie wymagamy tego F*min być stosunkowo mały, powiedzmy, ≈10kT. Pytanie brzmi zatem, ile porów ma bariery F* i które są tylko trochę większe niż F*min. Pory z barierami F* iF*min będzie bez znaczenia. Oczywistym sposobem określenia efektywnej liczby porów, które przyczyniają się do szybkości zarodkowania, jest zdefiniowanie tej efektywnej liczby n eff być stosunkiem całkowitej szybkości zarodkowania do szybkości w porach z najniższą barierą, stąd łatwo zauważyć, że n eff jest dobrym wskaźnikiem tego, ile jąder powstanie: jeśli wszystkie pory mają prawie taką samą barierę, n effn por, podczas gdy w drugiej granicy bariera w porach o najniższej barierze jest znacznie niższa niż we wszystkich innych porach, n eff ≃ 1.

Łatwo to obliczyć n eff numerycznie z równania. 5, pod warunkiem, że n por nie jest za duży. Zrobiliśmy to dla zestawów n por = 10 9 białek zarodkujących pory, których optymalna średnica porów Do = 10 nm. Rozważamy zestawy mediów porowatych o średnich średnicach mD od 2,5 do 25 nm, w krokach co 0,5 nm, a wyniki wykreślić na rys. 2. Krzyżyki i plusy reprezentują ośrodki porowate o szerokim zakresie wielkości porów, σ D = 3 nm, a kółka reprezentują ośrodki o wąskim zakresie wielkości porów, σ D = 1 nm. Otwarte koła i krzyże reprezentują pory o wąskim rozkładzie kształtów, σ s = 1kT, natomiast pozostałe punkty wskazują na szerszy rozkład, σ s = 2kT. Każdy krzyżyk, plus lub okrąg jest wynikiem wygenerowania 109 porów z losowymi barierami swobodnej energii, a więc odpowiada niezależnej próbce ośrodka porowatego.

Efektywna liczba porów n eff przyczynianie się do szybkości zarodkowania, w funkcji średniej wielkości porów mD. Całkowita liczba porów n por = 10 9 . Optymalna wielkość porów dla białka Do = 10 nm. Otwarte i wypełnione koła służą do wąskiego rozkładu wielkości porów, σ D = 1 nm, a krzyżyki i plusy są dla szerszego rozkładu, σ D = 3 nm. Otwarte koła i krzyżyki są dla wąskich rozkładów parametru kształtu, σ s = 1kT, a wypełnione koła i plusy są dla szerszych rozkładów, σ s = 2kT. Współczynnik sztywności κD = 10k b T nm –2 .

Na ryc. 2 znajduje się wiele interesujących funkcji: (i) n eff jest zawsze znacznie mniej niż n por (ii) nawet dla próbki 10 9 porów występuje znaczący szum statystyczny (iii), gdy średnia wielkość porów i optymalna wielkość porów są daleko od siebie, szczególnie jeśli σ D jest niski, tylko garstka lub być może tylko jeden por przyczynia się w znacznym stopniu do szybkości zarodkowania i (iv) w przypadku mediów porowatych o szerokim rozkładzie rozmiarów porów, w dość dużym zakresie różnic między średnimi średnicami porów a optymalnym rozmiarem porów, dziesiątki lub setki porów mają niskie bariery. Ta ostatnia obserwacja jest szczególnie przydatna, ponieważ idealne jest tworzenie kilku jąder, ani za dużo, ani za mało. Jeśli nukleant może indukować tylko kilka jąder bez dokładnego dostrojenia swojej średniej średnicy porów do dokładnej wartości w stosunku do (nieznanej) optymalnej średnicy porów, wówczas będzie on skutecznym nukleantem dla wielu białek.

Cechy (ii) oraz (iii) są powiązane. Oczywiście pory o średnicach zbliżonych do D 0 dominują kurs, a gdy różnica |DomD| jest duża w porównaniu z szerokością rozkładu wielkości porów, σ D, to pory te pochodzą z ogona rozkładu rozmiarów porów. Zatem tylko garstka porów ma znaczący udział w szybkości, jak widać na ryc. 2. Tak więc szybkość, równ. 1, jest sumą tylko kilku terminów, z których każdy jest wykładnikiem zmiennej losowej, a zatem istnieje znaczna zmienność między jedną próbką porów a drugą. W przeciwieństwie do tego, gdy wiele porów przyczynia się do szybkości, n eff ≫ 1, centralne twierdzenie graniczne statystyki mówi nam, że zmienność między próbkami będzie niewielka. Tutaj widzimy, że krzywa punktów jest gładka tylko wtedy, gdy n eff jest wielki. Gładka krzywa implikuje, że gdyby obliczenia zostały powtórzone z innym zestawem zmiennych losowych dla barier energii swobodnej w porach, to uzyskano by prawie identyczny zestaw wyników, natomiast gdy punkty danych śledzą poszarpaną krzywą, to powtarzając obliczenie dałoby znacząco inne n eff i szybkość zarodkowania. W takim przypadku wystąpią znaczne różnice pomiędzy nominalnie identycznymi próbkami ośrodka porowatego. Statystykę tej zmienności omówiono bardziej szczegółowo w innym miejscu (13).


16.4: Jak białka błonowe są przechowywane w błonach

  • Nadesłane przez Geralda Bergtroma
  • Profesor Emeritus (Biosciences) na Uniwersytecie Wisconsin-Milwaukee

Domena hydrofobowa integralnych białek błonowych składa się z jednego lub więcej regionów alfahelikalnych, które oddziałują z hydrofobowym wnętrzem błon. Hydrophilic domains tend to have more tertiary structure with hydrophilic surfaces, and so face the aqueous cytosol and cell exterior. Two trans-membrane proteins are cartooned below.

The protein on the left crosses the membrane once, while the one on the right crosses the membrane three times. How a transmembrane protein inserts into the membrane during synthesis dictates the locations of its N- and C-terminus. Transmembrane proteins can in fact cross a membrane more than once, which also determines the location of its N- and C-termini. N-terminal end of a plasma membrane polypeptide always ends up exposed to the outside of the cell. The alpha helical domains that anchor proteins in membranes are mostly non-polar and hydrophobic themselves. As an example, consider the amino acids in the alpha-helical domain of the red blood cell protein glycophorin A, a membrane protein that prevents red blood cells from aggregating, or clumping in the circulation. One glycophorin A polypeptide with its hydrophobic trans-membrane alpha helix is cartooned below. Glycophorin A monomers pair to form dimers in the plasma membrane.

Proteins that span membranes multiple times may include amino acids with charged, polar side chains, provided that these side chains interact between helices so that they are shielded from the fatty acid environment in the membrane. Because of these hydrophilic interactions, such proteins can create pory dla transport of polar molecules and ions we will see some of these proteins later. Integral membrane proteins that do not span the membrane also have a hydrophobic helical domain that anchors them in the membrane, while their hydrophilic domains typically interact with intracellular or extracellular molecules to e.g., hold cells in place give cells and tissues their structure, etc.

The very presence of the hydrophobic alpha-helical domains in trans-membrane proteins makes them difficult if not impossible to isolate from membranes in a biologically active form. By contrast, the peripheral polypeptide cytochrome c readily dissociates from the cristal membrane, making it easy to purify. For many years, an inability to purify other cristal membrane electron carriers in biologically active form limited our understanding of the structure and function of the mitochondrial electron transport system.

Hydrophobic alpha-helical domains are in fact, a piętno of membrane-spanning proteins. It is even possible to determine the primary structure of a polypeptide encoded by a gene before the protein itself has been isolated. For example, knowing the DNA sequence of a gene, we can infer the amino acid sequence of the protein encoded by the gene. A hydrophobicity analysis of the inferred amino acid sequence can tell us if a protein is likely to be a membrane protein. Let&rsquos look at a hydropathy (hydrophobicity) plot (below).

To see how an hydropathy plot can predict whether a protein is a membrane protein, check out the link below.


To jeden z ponad 2400 kursów na OCW. Przeglądaj materiały do ​​tego kursu na stronach, do których linki znajdują się po lewej stronie.

MIT OpenCourseWare to bezpłatna i otwarta publikacja materiałów z tysięcy kursów MIT, obejmująca cały program nauczania MIT.

Brak rejestracji lub rejestracji. Swobodnie przeglądaj i korzystaj z materiałów OCW we własnym tempie. Nie ma rejestracji ani dat rozpoczęcia ani zakończenia.

Wiedza jest twoją nagrodą. Korzystaj z OCW, aby kierować własnym uczeniem się przez całe życie lub uczyć innych. Nie oferujemy kredytu ani certyfikacji za korzystanie z OCW.

Stworzony do udostępniania. Pobierz pliki na później. Wyślij do przyjaciół i współpracowników. Modyfikuj, remiksuj i wykorzystuj ponownie (pamiętaj, aby jako źródło podać OCW).


Obejrzyj wideo: Fluorescent Proteins as Proteomic Probes - Cristae et al - Summary (Czerwiec 2022).


Uwagi:

  1. Estmund

    Myślę że się mylisz. Jestem pewien. Wyślij mi e -mail na PM, porozmawiamy.

  2. Turn

    Wierzę, że popełniasz błąd. Omów to. Wyślij mi e -maila na PM.

  3. Kolinkar

    Moim zdaniem popełniane są błędy. Musimy omówić.

  4. Jussi

    Myślę że się mylisz. Wejdź, omówimy to. Napisz do mnie na PW, poradzimy sobie.

  5. Nevada

    Moim zdaniem nie masz racji. Napisz do mnie na PW, porozmawiamy.

  6. Palmer

    Uchi-drogi

  7. Tiladene

    To zabawne informacje



Napisać wiadomość