Informacja

Konserwowane białka nie są immunogenne

Konserwowane białka nie są immunogenne


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Czytałem, że białka, które zostały wysoce konserwowane, nie są immunogenne.

Dlaczego tak jest? Co jest szczególnego, co sprawia, że ​​jest nieimmunogenny (przeciwciała przeciwko nim są trudne do wytworzenia)?


Immunogenność nie ma nic wspólnego z konserwacją białka. Jak już zauważył Nico, jest to mechanizm zapobiegający autoimmunizacji. Ale dotyczy to tylko białek podobnych do białek ludzkich.

Projektując szczepionkę, starasz się wybrać białka jako kandydatów do szczepionek, które są jak najbardziej konserwowane. To sprawia, że ​​szczepionka jest bardziej uniwersalna (ponieważ konserwowane białka są wspólne dla różnych szczepów bakterii lub wirusa), a także zapobiega jej nieskuteczności w przypadku mutacji białka docelowego. Przykładem może być wirus grypy, w którym trzeba przewidzieć szczepy, które będą w obiegu, aby przygotować szczepionkę. Jeśli byłoby możliwe znalezienie konserwatywnego białka, które jest wspólne dla wszystkich wirusów (i oczywiście nie ma podobieństwa do białek ludzkich), to mielibyśmy uniwersalną szczepionkę przeciw grypie.

Przeciwciała można (i są) projektowane sztucznie, na przykład w przypadku bakterii otoczkowych, takich jak Menningococcus B, gdzie do tej pory nie była dostępna żadna szczepionka. Te szczepionki są albo stosunkowo krótkimi peptydami, albo pojedynczymi białkami z patogenu. Białka do szczepionki są następnie zwykle wytwarzane w sposób biotechnologiczny, oczyszczane i mogą być stosowane jako szczepionka. Takie podejście nazywa się odwróconą wakcynologią.


Immunogenność to

zdolność określonej substancji, takiej jak antygen lub epitop, do wywoływania odpowiedzi immunologicznej w ciele człowieka lub zwierzęcia. Innymi słowy, immunogenność to zdolność do wywoływania odpowiedzi immunologicznej humoralnej i/lub komórkowej.

Jeśli białko jest wysoce konserwatywne między gatunkami, oznacza to, że jego epitopy zostaną rozpoznane jako samego siebie przez większość gatunków, dlatego organizm będzie unikał wytwarzania przeciwko nim przeciwciał, aby zapobiec autoimmunizacji.

Możesz przeczytać o centralnej tolerancji, aby zobaczyć, w jaki sposób limfocyty T i B są renderowane jako niereaktywne wobec siebie.


Przestrzennie konserwowane motywy w domenach białek kontrolnych dopełniacza determinują funkcjonalność regulatorów białek z rodziny aktywacji dopełniacza

Regulacja aktywacji dopełniacza w komórkach gospodarza odbywa się głównie za pośrednictwem regulatorów rodziny białek aktywacji dopełniacza (RCA), które są tworzone przez tandemowo powtarzające się domeny białka kontrolnego dopełniacza (CCP). Adnotacja funkcjonalna tych białek jest jednak trudna, ponieważ sąsiadujące domeny CCP znajdują się w białkach o różnych funkcjach. Tutaj, stosując podejście in silico, identyfikujemy pięć motywów, które są zachowane przestrzennie w określonej kolejności w domenach regulatorowych CCP znanych białek RCA. Donosimy, że obecność tych motywów w specyficznym wzorze jest wystarczająca do adnotacji domen regulatorowych w białkach RCA. Pokazujemy, że włączenie utraconego motywu do czwartego długiego homologicznego powtórzenia (LHR-D) w receptorze 1 dopełniacza odzyskuje swoją aktywność regulacyjną. Dodatkowo wzór motywu pomógł również opisać ludzki polidom jako regulator dopełniacza. Dlatego proponujemy, aby zidentyfikowane tutaj motywy były wyznacznikami funkcjonalności w białkach RCA.


2. Materiały i metody

W tej części najpierw omówiono przygotowanie danych, a następnie omówiono plan proponowanych prac. Dla korzyści czytelników, w dodatkowym pliku podano krótkie omówienie szczepionek opartych na epitopach, epitopów dla komórek T i komórek B oraz ich narzędzi przewidywania, właściwości fizykochemicznych epitopów i dokowania epitopów dla komórek T. Ponadto narzędzia przewidywania dla epitopów komórek T i B przedstawiono w tabelach uzupełniających S1 i S2.

2.1. Przygotowywanie danych

W celu zmapowania białek SARS-CoV-2 użyliśmy referencyjnego genomu SARS-CoV-2 ( <"type":"entrez-nukleotyd","attrs":<"text":"NC_045512.2", "term_id":"1798174254","term_text":"NC_045512.2"> NC_045512.2) 2 i 44583 dostępne sekwencje białkowe z National Center for Biotechnology (NCBI). Aby wygenerować sekwencję białkową, wzięliśmy sekwencję referencyjną genomu SARS-CoV-2 i rozważyliśmy koncepcje ramki odczytu. Ramka odczytu dzieli sekwencję nukleotydów sekwencji odniesienia na zestaw kolejnych, nienakładających się trypletów. Istnieją trzy możliwe ramki odczytu: Ramka 1, która rozpoczyna się od pierwszego nukleotydu sekwencji referencyjnej i tworzy trójki, Ramka 2, która zaczyna się od drugiego nukleotydu i tworzy trójki oraz Ramka 3, która zaczyna się od trzeciego nukleotydu i tworzy trójki. Dla każdej ramki te tryplety są następnie poddawane translacji do odpowiednich białek w oparciu o tabelę kodonów 3 . Ostatecznie uzyskaliśmy 25 takich unikalnych białek, które najlepiej pasowały do ​​Ramki 2. Ponadto najnowsze sekwencje genomowe indyjskiego wirusa SARS-CoV-2 zostały zebrane z Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) 4 w formacie fasta. Zawiera 566 kompletnych i prawie kompletnych genomów z sekwencją ID. Średnia długość 566 genomów wynosi 29 831਋p. Te 566 sekwencji SARS-CoV-2 dopasowuje się przy użyciu technik przyrównywania wielokrotnego sekwencjonowania (MSA) w celu wyodrębnienia konserwatywnych regionów. Ponadto ekstrahuje się kodowane białko związane z każdym konserwowanym regionem. Do zestrojenia sekwencji wykorzystuje się zakład High Performance Computing (HPC) firmy NITTTR w Kalkucie. Klaster HPC ma węzeł główny z podwójnym procesorem Intel Xeon Gold 6130 posiadającym 32 rdzenie, 2,10 GHz, 22 MB pamięci podręcznej L3 i 128 GB pamięci RAM DDR4 oraz 2 węzły obliczeniowe GPU i 4 CPU z podwójnym procesorem Intel Xeon Gold 6152 posiadającym 44 rdzenie, 2,1 GHz, 30 MB pamięci podręcznej L3 i 192 GB pamięci RAM DDR4 każdy, podczas gdy węzły GPU mają procesor graficzny NVIDIA Tesla V100 z 16 GB pamięci każdy. MSA przeprowadzono przy użyciu 2 węzłów obliczeniowych GPU i 4 CPU.

2.2. Potok przepływu pracy

Schemat przepływu pracy pokazano na rys. 1 . Na początek skupiliśmy się na znalezieniu konserwatywnych regionów w 566 indyjskiej sekwencji genomu SARS-CoV-2, na które nie mają wpływu mutacje genetyczne. Z tego samego powodu początkowo skonstruowaliśmy podejście Consensus Multiple Sequence Alignment (CMSA), w którym zastosowaliśmy cztery różne techniki dopasowania: ClustalW, MUSCLE, ClustalO i MAFFT w celu dopasowania sekwencji 566 SARS-CoV-2. Następnie, po znalezieniu konserwatywnych regionów z każdego wyrównanego wyniku technik dopasowania identyfikuje się konsensusowe konserwowane regiony (CCnR). ClustalW początkowo przeprowadza dopasowanie parami wszystkich sekwencji przy użyciu metody k-tuple. Następnie MSA jest tworzony poprzez stopniowe dopasowywanie najściślej spokrewnionych sekwencji w oparciu o metodę drzewa przewodniego Neighbor-Joining. W technice MUSCLE stosuje się dwie miary odległości: k-mer dla par niezrównanych i metodę Kimura dla par uszeregowanych sekwencji. Początkowo projekt MSA jest tworzony w MUSCLE przy użyciu metody k-mer. Następnie konstruowane jest progresywne wyrównanie w oparciu o drzewo przewodnie utworzone metodą UPGMA. To początkowe drzewo jest następnie ponownie szacowane przy użyciu metody odległości Kimura, po czym metoda UPGMA jest ponownie używana do utworzenia nowego drzewa przewodniego, tworząc w ten sposób drugi MSA. Nowe MSA są ostatecznie tworzone przez ponowne dopasowanie dwóch sekwencji utworzonych wcześniej. ClustalO używa metody k-tuple do tworzenia wyrównania parami. Następnie mBed służy do grupowania sekwencji, po których następuje algorytm grupowania k-średnich. Następnie budowane jest drzewo przewodnie przy użyciu metody grup nieważonych par ze średnią arytmetyczną (UPGMA). Wreszcie, MSA jest konstruowany przy użyciu pakietu HHalign. MAFFT używa dwóch różnych metod heurystycznych, progresywnej (FFT-NS-2) i iteracyjnego udoskonalania (FFT-NS-i). Głównym celem MAFFT jest połączenie lokalnych i globalnych algorytmów dla MSA. Początkowo FFT-NS-2 służy do obliczania odległości wszystkich par w celu utworzenia tymczasowego MSA, z którego obliczane są odległości uszczegółowione. Następnie wykonuje się FFT-NS-i w celu uzyskania ostatecznego MSA. Następnie, w celu zidentyfikowania konserwowanych regionów, te dopasowane sekwencje stosuje się do obliczenia entropii (E).

gdzie Sx y wskazuje częstotliwość każdej pozostałości x występujące na pozycji tak a 5 reprezentuje cztery możliwe reszty jako nukleotyd plus przerwę. Aby zidentyfikować konserwowane regiony (CnR) dla każdej techniki uliniowienia, uważa się, że minimalna długość segmentu wynosi 15, a maksymalna średnia entropia wynosi 0,2. Ponadto, maksymalna entropia na pozycję jest przyjmowana jako 0,2 bez przerw po znalezieniu sekwencji konsensusowej dla 566 sekwencji genomowych. Wszystkie te wartości są przyjmowane po zapoznaniu się z literaturą. Następnie CCnR są identyfikowane biorąc pod uwagę CnR wszystkich technik dopasowania. Następnie przeprowadza się proces udokładniania dla CCnR w oparciu o kryteria, że ​​ich długość jest większa lub równa 60 nt i że w powiązanej sekwencji białkowej nie występuje kodon stop. Co więcej, Nucleotide BLAST jest również używany do weryfikacji specyficzności CCnR jako pokrycia zapytania. Następnie z tych CCnR identyfikuje się epitopy komórek T i komórek B. Aby przewidzieć epitopy komórek T i komórek B oraz znaleźć odpowiadające im wyniki immunogenne, każdy CCnR poddaje się odpowiednio IEDB 5 i ABCPred 6. Zgodnie z zaleceniami IEDB, do przewidywania epitopów komórek T MHC-I i MHC-II wybiera się odpowiednio NetMHCpan 7 i Consensus Approach 8 [40], podczas gdy w przypadku epitopów komórek B przewidywanie jest przeprowadzane przez ABCPred, który wykorzystuje Recurrent Neural Sieć. Następnie, stosując przewidywane epitopy, oblicza się wyniki antygenowe za pomocą VaxiJen2.09. Dla każdego CCnR identyfikuje się wiele epitopów komórek T i komórek B wraz z odpowiadającymi im punktami immunogennymi i antygenowymi. Następnie, dla każdego CCnR uważa się, że najwyższe wyniki immunogenne i antygenowe wybierają odpowiednie epitopy. Ponadto te wyniki są wykorzystywane do uszeregowania CCnR w oparciu o średnią geometryczną, jak podano w równaniu. (2). Zastosowanie średniej geometrycznej ma na celu uniknięcie skośności wyników immunogennych i antygenowych uzyskanych dla epitopów komórek T i komórek B, tak aby można było przeprowadzić właściwe uszeregowanie konserwatywnych regionów konsensusu. Ponadto, w celu walidacji zidentyfikowanych epitopów, konformacyjne niekowalencyjne struktury 2D zidentyfikowanych epitopów są badane przy użyciu LigPlot+ [41]. Ponadto serwer BepiPred2.0 10 [42] jest używany do weryfikacji przewidywanych epitopów komórek B. Ponadto właściwości fizykochemiczne epitopów wraz z wykresem Ramachandrana są raportowane przez PyMOL [43] i jego obszerne biblioteki Autodock Vina (do dokowania) [44] i PyMOD 3 [45] natomiast do obliczania Z-score używany jest serwer online ProSA 11 [46].

gdzie, RCCnR reprezentuje rangę konsensusu konserwatywnego regionu (CCnR) w oparciu o średnią geometryczną wyników immunogennych i antygenowych epitopów limfocytów T i limfocytów B, ISi i jakoi to skalowane wyniki immunogenne i antygenowe odpowiednio dla epitopów MHC-I, MHC-II i komórek B.


Wyniki

Strategia projektowania

W celu zidentyfikowania konserwatywnych reszt w naturalnie występujących enzymach PHBH przeszukano bazę danych DDBJ znaleziono 92 sekwencje PHBH, w tym 36 sekwencji z α-proteobakterii, 15 z β-proteobakterii, 31 z γ-proteobakterii, 8 z promieniowców, 1 z acidobakterie i 1 z a Bakcyl napięcie. Najdłuższa sekwencja zawierała 410 reszt, a najkrótsza zawierała 389 reszt. Większość enzymów α-proteobakterii PHBH zawierała 389-393 reszt, podczas gdy enzymy β-proteobakterii na ogół składały się z 407 lub 410 reszt, a większość enzymów γ-proteobakterii zawierała 394 lub 395 reszt (rysunek uzupełniający S1). Skonstruowano nieukorzenione drzewo filogenetyczne (rysunek uzupełniający S2), ukazujące cztery klady, wyraźnie wskazujące, że po ewolucyjnym rozgałęzieniu proteobakterii i innych bakterii, separacja PHBH pochodziła z α-, β- i/lub γ-proteobakterii. Kilka sekwencji pochodzących z β- lub γ-proteobakterii również sugerowało przypadek dawnego horyzontalnego transferu genów.

Gdy sekwencje PHBH zostały wyrównane, stwierdzono, że 49 miejsc zawiera tylko 1 rodzaj aminokwasu (grupa A), podczas gdy 43 miejsca zawiera 2 rodzaje aminokwasów (grupa B) (tabela uzupełniająca SI i rys. uzupełniająca S3). Dopasowanie tych sekwencji wskazywało na 11 regionów o wysokim stopniu konserwatywności, tj. I7–L17, R44–E49, G157–G160, Y181–G187, E198–Y201, G207–R214, R220–Q224, P275–D305, L333 –W337, F342–T347 i A382–G387, chociaż niektóre stanowiska w grupach A i B zaobserwowano w regionach o niskim poziomie ochrony. Reszty z grup A i B stanowiły około 20% sekwencji pełnej długości, z 18% miejsc zlokalizowanych w domenie wiążącej FAD, 24% w domenie wiążącej substrat i 29% w domenie interfejsu ( Tabela uzupełniająca SI) (Entsch i van Berkel, 1995).

Aby skonstruować pojedynczą bazę danych mutantów przez podstawienie naturalnie występującymi aminokwasami, wszystkie 49 miejsc w grupie A i 4 miejsca z grupy B wybrano jako cele. Cztery reszty (G9, L199, S212 i L299) z grupy B zostały wybrane na podstawie informacji krystalograficznych. G9 znajduje się w motywie GxGxxG konserwowanym w oksygenazach zawierających flawinę. L199 znajduje się blisko podłoża, P-hydroksybenzoesan, a jego łańcuch boczny zaobserwowano w pobliżu końca 3'C cząsteczki substratu. S212 również znajduje się w pobliżu podłoża, a jego łańcuch boczny łączy się z karboksylowanym łańcuchem P-hydroksybenzoesan ( Moran i in., 1999). Ostatnia reszta w grupie B, L299, znajduje się w pobliżu pętli P293, a jej łańcuch boczny tworzy wiązania wodorowe z R44, A45, G46, Y100 i Q102. W odniesieniu do naturalnie występujących podstawień, 1 G9A, 1 L199V, 1 S212T i 12 L299M zaobserwowano w dopasowaniu 92 sekwencji PHBH. Ostatecznie zidentyfikowano następujące konserwowane reszty: 12 Gly, 3 Ala, 1 Val, 5 Leu, 1 Ile, 2 Ser, 1 Gln, 3 Pro, 2 Phe, 5 Tyr, 3 Trp, 4 Asp, 2 Glu, 2 His , bez reszt Lys i 5 Arg (tabela uzupełniająca SII).

Aby zbadać korelację między lokalizacją każdej konserwowanej reszty a wpływem podstawienia na strukturę i funkcję PHBH, odległość między 53 konserwatywnymi resztami została określona przez analizę skupień. Rzeczywiście, odległość między dowolnymi dwiema resztami w sekwencji pierwszorzędowej cząsteczki białka niekoniecznie koreluje z odległością trzeciorzędową w strukturze białka 3D (rysunek uzupełniający S4). Analiza ta dała dendrogram obejmujący 3 grupy taksonów 1, 2 i 3 oraz 5 innych reszt, które połączono tworząc grupę 4 (rysunek uzupełniający S5).

Fig. 2 ilustruje lokalizacje 53 konserwatywnych reszt z grup 1, 2, 3 i 4 w trzeciorzędowych i pierwszorzędowych strukturach monomeru PHBH. Czternaście konserwatywnych reszt w grupie 1 skupiło się wokół FAD, 14 konserwatywnych reszt w grupie 2 wydawało się skupiać wokół miejsca wiązania substratu, a 20 konserwatywnych reszt w grupie 3 było zlokalizowanych głównie wokół pętli P293. Należy jednak zauważyć, że nie zaobserwowano korelacji konserwatywnego rozkładu reszt między domeną wiążącą FAD a grupą 1 ani między domeną wiążącą substrat a grupą 2, np. 18 konserwatywnych reszt w domenie wiążącej FAD składało się z 9 reszt z grupy 1, 7 reszt z grupy 3 i 2 reszt z grupy 4 (tabela uzupełniająca SII).

Lokalizacja 53 konserwatywnych reszt lub 19 przypuszczalnie funkcjonalnych reszt w pierwszorzędowej i trzeciorzędowej strukturze PHBH. Konserwowane pozostałości (a) w podpodatkach a, b i c grupy 1 są pokazane odpowiednio w kolorze żółtym, ciemnożółtym i brązowym (b) w podtaksonach a, b i c grupy 2 w kolorze czerwonym, różowym i jasnoróżowym (C) w podtaksonach a, b, c i d grupy 3 odpowiednio w kolorze jasnoniebieskim, ciemnoniebieskim i fioletowym oraz (D) w grupie 4 w kolorze miętowym. (mi) Przypuszczalne reszty funkcjonalne w grupach 5, 6 i 7 pokazano odpowiednio w kolorze żółtym, jasnoniebieskim i fioletowym. (F) Reszty Cys i Met są w kolorze ochry. Cząsteczka PHBH jest pokazana na podstawie struktury 1pbe. Logo sekwencji wygenerowano przy użyciu 92 sekwencji aminokwasowych PHBH wyekstrahowanych z DDBJ.

Lokalizacja 53 konserwatywnych reszt lub 19 przypuszczalnie funkcjonalnych reszt w pierwszorzędowej i trzeciorzędowej strukturze PHBH. Konserwowane pozostałości (a) w podpodatkach a, b i c grupy 1 są pokazane odpowiednio w kolorze żółtym, ciemnożółtym i brązowym (b) w podtaksonach a, b i c grupy 2 w kolorze czerwonym, różowym i jasnoróżowym (C) w podtaksonach a, b, c i d grupy 3 odpowiednio w kolorze jasnoniebieskim, ciemnoniebieskim i fioletowym oraz (D) w grupie 4 w kolorze miętowym. (mi) Przypuszczalne reszty funkcjonalne w grupach 5, 6 i 7 pokazano odpowiednio w kolorze żółtym, jasnoniebieskim i fioletowym. (F) Reszty Cys i Met są w kolorze ochry. Cząsteczka PHBH jest pokazana na podstawie struktury 1pbe. Logo sekwencji wygenerowano przy użyciu 92 sekwencji aminokwasowych PHBH wyekstrahowanych z DDBJ.

W celu porównania skutków podstawień w konserwowanych i niekonserwatywnych resztach, niekonserwatywne reszty, co do których wywnioskowano, że są bezpośrednio lub pośrednio związane ze strukturą i/lub funkcją PHBH, zostały wybrane do analizy na podstawie wcześniejszych badań: Badania o strukturze krystalicznej PHBH silnie sugerowały, że S13, E32, R33, R42, R44, A45, G46, V47, Q102, D286, L299 i N300 tworzą wiązania wodorowe z cząsteczką FAD ( Schreuder i in., 1988 Schreuder i in., 1989). Spośród tych reszt pięć nie zostało wcześniej zidentyfikowanych jako reszty konserwowane: S13, E32, R33, R42 i V47 (grupa 5) (rysunek uzupełniający S3). Ponieważ twierdzi się, że Q34, T35 i Y38, które znajdują się w strukturze helisy, mogą oddziaływać bezpośrednio lub pośrednio z cząsteczką FAD ( Eppink i in., 1999a), wybrano dziewięć reszt, tj. A34, S35, A36, D37, Y38, V39, Q40, G41 i I43 (grupa 6) (rysunek uzupełniający S3). Badania wykazały, że F161, H162, Q167, P267 i R269 mogą być zaangażowane w interakcję między FAD i NADPH ( van Berkel i in., 1988 Moran i in., 1996 Eppink i in., 1998a Eppink i in., 1999b) reszty te wybrano jako grupę 7 (rysunek uzupełniający S3). Fig. 2 przedstawia pierwszorzędowe i trzeciorzędowe lokalizacje tych niekonserwatywnych reszt, jak również reszt konserwowanych.

Budowa jednej bazy danych mutantów

Skonstruowano bazę danych pojedynczego mutanta, przeprowadzając kompleksową substytucję każdej konserwowanej i niekonserwatywnej reszty w P.fluorescens NBRC14160 PHBH z 1 z 19 innych naturalnie występujących aminokwasów. Baza danych zawierała 619 aktywnych pojedynczych mutantów, w tym 365 aktywnych pojedynczych mutantów w konserwowanych resztach z grup 1, 2, 3 i 4 oraz 254 aktywnych pojedynczych mutantów w niekonserwatywnych resztach z grup 5, 6 i 7. Główna aktywność, podaktywność dla NADPH i rejestrowano specyficzność reakcji NADPH każdego mutanta (tabela uzupełniająca SIII). Fig. 3 ilustruje rozkład głównej aktywności i specyficzności reakcji NADPH w bazie danych mutantów (ryc. uzupełniający S6).

Rozkład głównej aktywności i specyficzności reakcji NADPH wśród otrzymanych pojedynczych mutantów. (a) Mutanty przy resztach w grupie 1 są w kolorze żółtym (b) w grupie 2 na czerwono (C) w grupie 3 na niebiesko (D) w grupie 4 w kolorze miętowym (mi) w grupach 5, 6 i 7 odpowiednio w kolorze żółtym, jasnoniebieskim i fioletowym oraz (F) w resztach Cys i Met w kolorze ochry. Na wykresach pudełkowych kodowanie kolorami dla (g) oraz (h) są takie same.

Rozkład głównej aktywności i specyficzności reakcji NADPH wśród otrzymanych pojedynczych mutantów. (a) Mutanty przy resztach w grupie 1 są w kolorze żółtym (b) w grupie 2 na czerwono (C) w grupie 3 na niebiesko (D) w grupie 4 w kolorze miętowym (mi) w grupach 5, 6 i 7 odpowiednio w kolorze żółtym, jasnoniebieskim i fioletowym oraz (F) w resztach Cys i Met w kolorze ochry. Na wykresach pudełkowych kodowanie kolorami dla (g) oraz (h) są takie same.

Podstawienie 14 konserwatywnych reszt w grupie 1 dało 79 pojedynczych mutantów o mierzalnej aktywności głównej, tj. aktywne pojedyncze mutanty. Jednak zaobserwowano również 187 pojedynczych mutantów, które ulegały stabilnej ekspresji, ale nie wykazywały głównej aktywności. Podobnie uzyskano 76 aktywnych pojedynczych mutantów przy 14 konserwowanych resztach w grupie 2, 132 aktywnych pojedynczych mutantów przy 20 konserwowanych resztach w grupie 3 i 78 aktywnych pojedynczych mutantów przy 5 konserwowanych resztach w grupie 4.

Dokładnie przeanalizowano korelację między lokalizacją każdej konserwowanej reszty a liczbą uzyskanych pojedynczych aktywnych mutantów. Nie uzyskano aktywnych mutantów dla podstawień w G14 i G160 w grupie 1 E198, R220 i R246 w grupie 2 oraz Q102, G187, N300 i F342 w grupie 3. Tylko jeden aktywny pojedynczy mutant uzyskano w grupie G9, G11 i D286 w grupie 1 Y201, H214 i G187 w grupie 2 i G295 w grupie 3. Mniej niż 10 mutantów uzyskano przy 12/14 konserwatywnych reszt w grupie 1, 10/14 konserwatywnych reszt w grupie 2 i 14/20 konserwatywnych reszt w grupie 3. Jednak cztery z pięciu konserwatywnych reszt w grupie 4 wytworzyło ponad 10 mutantów (rysunek uzupełniający S7). Nie uzyskano aktywnych mutantów dla 9 z 53 konserwatywnych reszt, ale 365 aktywnych mutantów uzyskano dla pozostałych 44 reszt. Liczba aktywnych pojedynczych mutantów w stosunku do przewidywanej liczby wynosiła odpowiednio 30, 29 i 35% w grupach 1, 2 i 3, jednak wydajność w grupie 4 wynosiła 82% (tabela uzupełniająca SIV). Większość konserwatywnych reszt w grupie 4 znajduje się w regionie zewnętrznym i jest nieprzyłączona do innych konserwatywnych reszt, co sugeruje, że podstawienia w niektórych resztach grupy 4 mogą mieć niewielki wpływ na aktywność enzymatyczną.

Kompleksowe podstawienie każdej niekonserwatywnej reszty w grupach 5, 6 i 7 dało bazę aktywnych pojedynczych mutantów: 39 przy 5 resztach w grupie 5, 169 przy 9 resztach w grupie 6 i 46 przy 5 resztach w grupie 7 (ryc. 3 oraz tabela uzupełniająca SIII). Tylko jeden aktywny pojedynczy mutant został wyprodukowany w S13, E32 i R42 w grupie 5, trzy zostały wyprodukowane w H162 i F267, a dwa zostały wyprodukowane w R269 w grupie 7. Jednak wszystkie 19 aktywnych pojedynczych mutantów zostało wyprodukowanych w 1 reszcie, V47, w grupa 5 przy 8 resztach, Q34, T35S, P36A, D37, V39, L40Q, G41 i I43, w grupie 6 i przy 2 resztach, F161 i Q167, w grupie 7.

W oparciu o ich tolerancję na podstawienie, konserwowane reszty podzielono na trzy klasy: pierwsza klasa składała się z mutacji, które inaktywowały lub destabilizowały produkty, druga klasa była raczej ograniczona pod względem tolerancji na podstawienie, a ostatnia klasa była tolerancyjna na wszystkie podstawienia. Podobnie niekonserwatywne reszty podzielono na dwie grupy, tj. bipolaryzację. Trendy te wyraźnie różniły się od poprzedniej bazy danych pojedynczych mutantów przy 12 Cys/Met, która wykazywała rozkład normalny (ryc. 3). Te reszty Cys/Met są słabo konserwowane, ale nie są połączone ze strukturą i funkcją, wszystkie 19 podstawień przy 12 Cys/Met dały aktywne produkty (Suemori i Iwakura, 2007).

Grupa 1 nie dała aktywnych mutantów o wyższej aktywności niż enzym typu dzikiego. Podobnie, tylko 1, 2, 4, 0, 2 i 0 mutanty wykazywały większą aktywność główną niż typ dziki odpowiednio w grupach 2, 3, 4, 5, 6 i 7. Analizowano rozkład głównej aktywności mutantów w każdej konserwowanej reszcie (dodatkowa Fig. 8). Konserwowane reszty obejmowały 12 Gly, 3 Ala, 1 Val, 5 Leu, 1 Ile, 2 Ser, 1 Gln, 3 Pro, 2 Phe, 3 Tyr, 3 Trp, 4 Asp, 2 Glu, 2 His, 0 Lys i 5 Arg ( Tabela uzupełniająca II ). Gly, który zaobserwowano w 12 z 53 konserwatywnych reszt enzymu typu dzikiego, nie pozwalał na substytucję, z wyjątkiem G94 w grupie 4, substytucja Gly innymi małymi aminokwasami była częściej tolerowana. Z wyjątkiem Y181, W234 i W337 (grupa 4), aminokwasy aromatyczne wykazywały tendencję do nietolerancji podstawienia. Aminokwasy hydrofobowe i stosunkowo małe były bardziej tolerancyjne na substytucję, niezależnie od lokalizacji w enzymie PHBH. Nie zaobserwowano trendów w podstawieniu aminokwasów polarnych.

Spośród 365 aktywnych mutantów 53 konserwatywnych reszt 64 wykazywało wyższą specyficzność reakcji NADPH niż enzym typu dzikiego: 11 mutantów każdy w L199 i L210 w grupie 2 18, 5, 1 i 4 w R44, G46, L48 i L299 , odpowiednio w grupie 3 po 3 w G94 i D108 i 11 w Y181 w grupie 4. W przeciwieństwie do tego, z 254 aktywnych mutantów 19 niekonserwatywnych reszt, tylko 2 wykazywały wyższą specyficzność reakcji NADPH niż enzym typu dzikiego . Niektóre mutanty w L199, L210, R44 i Y181 wykazywały znacznie wyższą specyficzność reakcji NADPH, takie jak Y181S (0,7%), Y181T (0,8%) i L199Y (0,8%). W tabeli I wymieniono parametry kinetyczne Y181S i Y181T, dla których KD oraz kD wartości były niższe niż te dla typu dzikiego. W bazie danych 12 mutantów Cys/Met, która obejmowała 65 aktywnych pojedynczych mutantów o wyższej specyficzności reakcji NADPH niż enzym typu dzikiego, najwyższa specyficzność reakcji NADPH wynosiła 2,1% w porównaniu z 4,7% dla enzymu typu dzikiego ( Suemori i Iwakura, 2007). To odkrycie sugerowało, że mutacje konserwatywnych reszt dały mutanty o nieoczekiwanie wyższej specyficzności reakcji NADPH niż enzym typu dzikiego, tak że nawet podstawienie konserwatywnych reszt zakłóciłoby główną aktywność lub stabilność.

Charakterystyka pojedynczych lub podwójnych mutantów związanych z Y181

. A45G . Y181R/L268G . Y181S . Y181T . Typ dziki . A45V .
KD (mM) z P-Hydroksybenzoesan 0.7 3.5 4.1 3.9 9.5 1800
KD (mM) z 2,4-dihydroksybenzoesanem 2200 1000 800 800 22 800
KD (mM) z protokatechuatem 14 65 93 82 230 NS
kKot (s -1 ) 0.06 1.1 1.6 2.1 5.7 <0,007
. A45G . Y181R/L268G . Y181S . Y181T . Typ dziki . A45V .
KD (mM) z P-Hydroksybenzoesan 0.7 3.5 4.1 3.9 9.5 1800
KD (mM) z 2,4-dihydroksybenzoesanem 2200 1000 800 800 22 800
KD (mM) z protokatechuatem 14 65 93 82 230 NS
kKot (s -1 ) 0.06 1.1 1.6 2.1 5.7 <0,007

Aktywność mierzono przy pH 6,5 i 4°C.

Charakterystyka pojedynczych lub podwójnych mutantów związanych z Y181

. A45G . Y181R/L268G . Y181S . Y181T . Typ dziki . A45V .
KD (mM) z P-Hydroksybenzoesan 0.7 3.5 4.1 3.9 9.5 1800
KD (mM) z 2,4-dihydroksybenzoesanem 2200 1000 800 800 22 800
KD (mM) z protokatechuatem 14 65 93 82 230 NS
kKot (s -1 ) 0.06 1.1 1.6 2.1 5.7 <0,007
. A45G . Y181R/L268G . Y181S . Y181T . Typ dziki . A45V .
KD (mM) z P-Hydroksybenzoesan 0.7 3.5 4.1 3.9 9.5 1800
KD (mM) z 2,4-dihydroksybenzoesanem 2200 1000 800 800 22 800
KD (mM) z protokatechuatem 14 65 93 82 230 NS
kKot (s -1 ) 0.06 1.1 1.6 2.1 5.7 <0,007

Aktywność mierzono przy pH 6,5 i 4°C.

Budowa bazy danych podwójnych mutantów

Y181S wykazał najwyższą swoistość reakcji NADPH, dlatego pojedyncze mutacje Y181X połączono z mutacją L268G, którą wybrano metodą racjonalnego projektowania. W wyniku podstawienia uzyskano 19 aktywnych podwójnych mutantów Y181X/L268G (tabela uzupełniająca SIII). Fig. 4 przedstawia główną aktywność i specyficzność reakcji NADPH pojedynczych mutantów Y181X i podwójnych mutantów Y181X/L268G. Na przykład zmiana specyficzności reakcji NADPH Y181S na Y181S/L268G spowodowała zmianę od 0,7 do 0,5%, zmiany wahały się od 0,8% dla Y181T do 0,5% dla Y181T/L268G. Jednak swoistość reakcji NADPH Y181R/L268G różniła się zasadniczo od Y181R (0,5 wobec 4,1% dla pojedynczego mutanta Y181R). W tabeli I wymieniono parametry kinetyczne podwójnego mutanta Y181R/L268G, które wykazywały niższe KD oraz kD wartości niż enzym typu dzikiego.

Porównanie głównych aktywności i swoistości reakcji NADPH pojedynczych mutantów Y181X i podwójnych mutantów Y181X/L268G. Pojedyncze mutanty Y181X i podwójne mutanty Y181X/L268G pokazano odpowiednio jako kółka i kwadraty. Wśród pojedynczych mutantów Y181X lub podwójnych mutantów Y181X/L268G, X = G, A, V, L i I są na szaro X = S, T, N i Q są na jasnozielone X = C i M na żółto X = P, F, Y i W są na fioletowo X = D, E, H i K na pomarańczowo, a X = R na czerwono. Enzym typu dzikiego jest przedstawiony na czarno na kwadracie.

Porównanie głównych aktywności i swoistości reakcji NADPH pojedynczych mutantów Y181X i podwójnych mutantów Y181X/L268G. Pojedyncze mutanty Y181X i podwójne mutanty Y181X/L268G pokazano odpowiednio jako kółka i kwadraty. Wśród pojedynczych mutantów Y181X lub podwójnych mutantów Y181X/L268G, X = G, A, V, L i I są na szaro X = S, T, N i Q są na jasnozielone X = C i M na żółto X = P, F, Y i W są na fioletowo X = D, E, H i K na pomarańczowo, a X = R na czerwono. Enzym typu dzikiego jest przedstawiony na czarno na kwadracie.


Zawartość

Szlak Imd wykazuje szereg podobieństw do ssaczej sygnalizacji TNFR, chociaż wiele wewnątrzkomórkowych białek regulatorowych sygnalizacji Imd wykazuje również homologię z różnymi kaskadami sygnalizacji ludzkich receptorów Toll-podobnych. [6]

Podobieństwo do sygnalizacji TNFR Edytuj

Następujące geny są analogiczne lub homologiczne między muszka owocowa (pogrubione) i sygnalizacja ludzkiego TNFR1: [7] [8]

  • Imd: ludzki ortolog = RIP1
  • Tak1: ludzki ortolog = Tak1
  • TAB2: ludzki ortolog = TAB2
  • Dredd: ludzki ortolog = kaspaza-8
  • FADD: ludzki ortolog = FADD
  • Klucz/Ikkγ: ortolog ludzki = NEMO [8]
  • Ird5: ludzki ortolog = IKK2
  • Smakować: ludzkie ortologi = p65/p50 i IκB
  • Iap2: ludzki ortolog = cIAP2
  • UEV1a: ludzki ortolog = UEV1a
  • schylać się: ludzki ortolog = UBC13

Podczas gdy dokładna epistaza elementów sygnalizacyjnych szlaku Imd jest stale badana, mechanistyczna kolejność wielu kluczowych elementów szlaku jest dobrze ustalona. W poniższych sekcjach omówiono sygnalizację Imd, którą można znaleźć w Muszka owocowa, gdzie jest wyjątkowo dobrze scharakteryzowany. [6] Sygnalizacja Imd jest aktywowana przez serię kroków od rozpoznania substancji bakteryjnej (np. peptydoglikanu) na przekazywanie tego sygnału prowadzące do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB Relish. [7] Aktywowany Relish tworzy następnie dimery, które przemieszczają się do jądra i wiążą się z DNA, prowadząc do transkrypcji peptydów przeciwdrobnoustrojowych i innych efektorów.

Białka rozpoznające peptydoglikany (PGRP) Edytuj

Wykrywanie sygnałów bakteryjnych odbywa się za pomocą białka LC peptydoglikanu (PGRP-LC), białka transbłonowego z domeną wewnątrzkomórkową. Wiązanie bakteryjnego peptydoglikanu prowadzi do dimeryzacji PGRP-LC, która generuje konformację niezbędną do wiązania i aktywacji białka Imd. Jednak alternatywne izoformy PGRP-LC mogą być również wyrażane z różnymi funkcjami: PGRP-LCx rozpoznaje polimeryczny peptydoglikan, podczas gdy PGRP-LCa nie wiąże się bezpośrednio z peptydoglikanem, ale działa obok PGRP-LCx, wiążąc monomeryczne fragmenty peptydoglikanu (zwane cytotoksyną tchawiczą lub „TCT” ). Inny PGRP (PGRP-LE) również działa wewnątrzkomórkowo, wiążąc TCT, który przeszedł przez błonę komórkową lub pochodzi z infekcji wewnątrzkomórkowej. PGRP-LA promuje aktywację sygnalizacji Imd w komórkach nabłonka, ale mechanizm jest wciąż nieznany. [6] [7]

Inne PGRP mogą hamować aktywację sygnalizacji Imd przez wiązanie sygnałów bakteryjnych lub hamowanie białek sygnalizacyjnych gospodarza: PGRP-LF jest transbłonowym PGRP, który nie ma domeny wewnątrzkomórkowej i nie wiąże peptydoglikanu. Zamiast tego PGRP-LF tworzy dimery z PGRP-LC zapobiegając dimeryzacji PGRP-LC iw konsekwencji aktywacji sygnalizacji Imd. Szereg wydzielanych PGRP wykazuje aktywność amidazy, która reguluje w dół szlak Imd poprzez trawienie peptydoglikanu na krótkie, nieimmunogenne fragmenty. Należą do nich PGRP-LB, PGRP-SC1A, PGRP-SC1B i PGRP-SC2. Dodatkowo PGRP-LB jest głównym regulatorem w jelitach. [9]

Komponenty sygnalizacji wewnątrzkomórkowej Edytuj

Głównym wewnątrzkomórkowym białkiem sygnalizacyjnym jest Imd, białko zawierające domenę śmierci, które wiąże się z FADD i Dredd, tworząc kompleks. Dredd jest aktywowany po ubikwitynacji przez kompleks Iap2 (obejmujący Iap2, UEV1a, bend i eff), co umożliwia Dreddowi rozszczepienie 30-resztowego N-końca Imd, umożliwiając również jego ubikwitynację przez Iap2. [7] Following this, the Tak1/TAB2 complex binds to the activated form of Imd and subsequently activates the IKKγ/Ird5 complex through phosphorylation. This IKKγ complex activates Relish by phosphorylation, leading to cleavage of Relish and thereby producing both N-terminal and C-terminal Relish fragments. The N-terminal Relish fragments dimerize leading to their translocation into the nucleus where these dimers bind to Relish-family NF-κB binding sites. Binding of Relish promotes the transcription of effectors such as antimicrobial peptides. [6] [7]

While Relish is integral for transcription of Imd pathway effectors, there is additional cooperation with other pathways such as Toll and JNK. The TAK1/TAB2 complex is key to propagating intracellular signalling of not only the Imd pathway, but also the JNK pathway. As a result, mutants for JNK signalling have severely reduced expression of Imd pathway antimicrobial peptides. [10]

The Imd-mediated antimicrobial response Edit

Imd signalling regulates a number of effector peptides and proteins that are produced en masse following immune challenge. [11] This includes many of the major antimicrobial peptide genes of Drosophila, particularly: Diptericin, Attacin, Drosocin, Cecropin, and Defensin. [12] The antimicrobial response following Imd activation greatly relies on the production of antimicrobial peptides, as flies lacking these peptides are severely immune-deficient. [13]

The Imd pathway appears to have evolved in the last common ancestor of centipedes and insects. [1] However certain lineages of insects have since lost core components of Imd signalling. The first-discovered and most famous example is the pea aphid Acyrthosiphon pisum. It is thought that plant-feeding aphids have lost Imd signalling as they bear a number of bacterial endosymbionts, including both nutritional symbionts that would be disrupted by aberrant expression of antimicrobial peptides, and defensive symbionts that cover for some of the immune deficiency caused by loss of Imd signalling. [14] It has also been suggested that antimicrobial peptides, the downstream components of Imd signalling, may be detrimental to fitness and lost by insects with exclusively plant-feeding ecologies. [15]

Crosstalk between the Imd and Toll signalling pathways Edit

While the Toll and Imd signalling pathways of Drosophila are commonly depicted as independent for explanatory purposes, the underlying complexity of Imd signalling involves a number of likely mechanisms wherein Imd signalling interacts with other signalling pathways including Toll and JNK. [6] While the paradigm of Toll and Imd as largely independent provides a useful context for the study of immune signalling, the universality of this paradigm as it applies to other insects has been questioned. w Plautia stali stinkbugs, suppression of either Toll or Imd genes simultaneously leads to reduced activity of classic Toll and Imd effectors from both pathways. [16]


Materiały i metody

Similarity searching of non-coding sequence between Fugu and human genomes.

GENSCAN [70] (using a suboptimal exon probability cutoff of 0.1) and tRNA-scan-SE (release 1.1) [71] were used to predict coding exons and tRNA genes within the Fugu draft genome assembly (release 3.0 Rosalind Franklin Centre for Genomics Research Comparative Genomics Group http://fugu.rfcgr.mrc.ac.uk/). These predicted sequences were then masked in the Fugu sequence by supplying them as a “repeat library” to Repeatmasker35. The masked sequence was similarity searched against human genomic sequence from the Ensembl [41] database v18.34.1 in 1-Mb sections using MegaBLAST [40] version 2.2.6 (word size 20 and mismatch penalty –2). Human and Fugu sequences with alignments of 100 bp or over were selected to form the initial CNE sequence dataset.

All CNEs with a significant similarity to an expressed transcript in the EMBL database or protein sequence in Swiss-Prot/TrEMBL were removed from the dataset unless located within a UTR. CNEs with significant similarity to non-coding RNAs were also removed. These were located by comparing the CNEs to the microRNA Registry [72] and the Rfam database (version 5.0) [73] using BLASTn [74]. CNEs were also searched against Rfam using the INFERNAL software. This resulted in the detection of 1 microRNA, four U1 snoRNAs, six U2 snoRNAs, three U5 snoRNAs, one U6atac RNA, three 7S RNAs, one 7Sk RNA, and one 5S RNA. The CNEs were also searched against the UTRdb (http://www.ba.itb.cnr.it/BIG/UTRScan/, which is a collection of functional sequence patterns located in 5′ or 3′ UTR sequences, but no significant hits were found. We used the program QRNA [75] to see whether any of the BLAST matches had a pattern of mutation consistent with RNA secondary structure. However, the known RNAs detected above had the most significant hits from this analysis. QRNA uses the mutational pattern in a pairwise alignment to detect non-coding RNAs, but in general the sequence identity of the CNEs is too high for this to be of use.

Analysis of the distribution of CNEs in the human genome.

In order to test whether CNEs were randomly distributed, a new random location was allocated uniformly for each CNE within its chromosome. This process was repeated 1,000 times for each chromosome, and the average cluster sizes were calculated for the different distances given in Figure 1B. These cluster sizes were then compared to the cluster sizes of the CNEs. χ 2 tests were carried out comparing the number of clusters containing five or fewer CNEs with the number of clusters containing six or more CNEs. ten P-values obtained from the χ 2 test statistics on one degree of freedom are also shown in Figure 1B. They give very strong evidence against the CNEs being randomly distributed.

Identification of genes associated with CNEs.

The closest gene (using the transcription start site as defined in Ensembl) to the start of each CNE was determined from a list of all human genes supported by external evidence (“known” genes) downloaded using EnsMart, available from the Ensembl Web site (release 24.34e.1 http://www.ensembl.org/). The GOstat program was used to find statistically over-represented GOs in this group of genes [44], using the “goa_human” GO gene association database as a comparator. The minimum length of a considered GO path was five. The false discovery rate option was used to adjust for multiple comparisons.

MLAGAN alignments.

More sensitive global alignment of the CNE regions surrounding 25 orthologous genes in human, Fugu, and other vertebrate species was carried out using the MLAGAN alignment tool kit [50]. To locate the orthologous regions in mouse and rat, local similarity searches with BLASTn were carried out using the most outlying CNE associated with each gene. The relevant genomic regions were extracted from Ensembl for human, mouse, and rat. Do Fugu the genomic regions were extracted from the Medical Research Council Rosalind Franklin Centre for Genomics Research Fugu Genomics Project Web site (http://fugu.rfcgr.mrc.ac.uk/) (where there is additional mapping information for scaffolds. All sequences were orientated prior to alignment so that the coding sequence of the gene was in positive orientation in all sequences. The MLAGAN alignment was visualised using the VISTA program [76], enabling the identification of conserved sequences. Because of the larger evolutionary distance between fish and mammals, conservation was measured using a 40-bp window and a cutoff score of 60% identity. Fugu was always used as the baseline sequence.

Similarity searching of human CNEs against other vertebrate and invertebrate genomes.

To look for the presence of CNEs in other available vertebrate genomes, CNEs were similarity searched against Ensembl mouse (v19.32.2), rat (v21.3.2), chicken (v22.1.1), and zebrafish (v21.3.2) genome sequences using BLASTn with default parameters. All invertebrate sequences in the EMBL database were searched in the same way using BLASTn with non-stringent parameters (mismatch penalty –1, gap open penalty 1, word size 9, and soft masking). More sensitive alignment of flanking orthologous sequence around the SOX21 gene (up to the coding sequence of the genes on either side) from Ensembl C. elegans (v21.25), D. melanogaster (v21.3.1), and Anopheles gambiae (v21.2.2) was carried out using MLAGAN as above.

Fish care.

Zebrafish were raised and bred and embryos staged following standard protocols [77,78] stages are described as the approximate number of hours post-fertilisation (hpf) when embryos are raised at 28.5 °C. To prevent pigment formation, some embryos were raised in 0.003% phenylthiocarbamide in embryo medium from tailbud stage.

Functional Assay.

We assayed for enhancer activity in embryos co-injected with candidate enhancer elements or control DNA and a minimal promoter–reporter construct in a method adapted from Muller and colleagues [37] as described below:

For the preparation of DNA and micro-injection, CNEs, rCNEs, and negative controls were PCR-amplified from Fugu genomic DNA (see Figure S1 for PCR primer sequences primers are represented by the first and last 20 bp of each sequence). The reporter construct consisting of EGFP (Clontech, Palo Alto, California, United States) under the control of a minimal promoter from the mouse β-globin gene, was PCR-amplified from a plasmid vector (available upon request). Amplified DNA was purified using the GFX PCR purification kit (#27–9602-01 Amersham Biosciences, Amersham, United Kingdom) or the QIAquick PCR purification kit (#28106 Qiagen, Valencia, California, United States). Element DNA or control DNA (at 150–300 ng/μl), reporter construct DNA (at 25 ng/μl), and phenol red (at 0.1%, used as a tracer) were combined and co-injected into embryos produced from natural matings between the one-cell stage and early cleavage stages, using an Eppendorf (Hamburg, Germany) FemtoJet pressure injection system. Any embryos developing abnormally were discarded before screening.

For screening of embryos and data collection, on the second day of development (approximately 26–33 hpf), injected embryos were anaesthetised in Tricaine [77] and analysed for GFP expression by observation under fluorescence illumination using an Olympus (Tokyo, Japan) IX81 motorised inverted microscope. Images were captured using an FVII CCD monochrome digital camera and analySIS image-processing software.

GFP-expressing cells were classified according to the following tissue categories: forebrain, midbrain, hindbrain, spinal cord, eye, ear, notochord, muscle, blood (circulating)/blood islands, heart/pericardial region (Please note: Some cells classified in this category may be circulating blood cells), epidermis/EVL, or fins. Cells that did not fall into one of these major expression categories (or that were not possible to unequivocally identify from morphology or localisation) were categorised as “other”. The location and tissue category of each GFP-expressing cell for each embryo was recorded schematically using Adobe Photoshop software (Adobe Systems, San Jose, California, United States), by manually drawing colour-coded schematised cells in appropriate positions onto an overlay of a camera lucida drawing of a 31-hpf embryo (from staging series by C. Kimmel, downloaded from “Zebrafish: The Living Laboratory”, courtesy of the Zebrafish CD Exchange Project contact Mark Cooper at E-mail: [email protected] relating to tissue category was also recorded on a spreadsheet.

GFP expression data were collected from between 25 and 55 expressing embryos per element injected. Cumulative overlaid schematised expression data for each element were compressed into a single JPEG file (displayed in Figure 5). Thus, the JPEG image for each element is designed to give an overall impression of the spatial pattern to which the element directs expression. Coupled with the accompanying graphs, the data present an overview of the spatial localisation of GFP expression as well as an idea of the number of cells per tissue in which GFP expression was detected, indicating the strength of the element's enhancing properties or the size of the cell population to which expression is directed.

Anti-GFP immunostaining.

Embryos were fixed in 4% paraformaldehyde and stained with rabbit polyclonal anti-GFP (#TP401 at 1/1,000 dilution AMS Biotechnology, Abingdon Oxon, United Kingdom) using standard protocols [79] and the ABC amplification system (Vectastain Vector Laboratories, Burlingame, California, United States). Stained embryos were cleared in glycerol, flatmounted, and observed/imaged as above.


Artykuł przeglądowy

Adenoviral vectors are a safe and potently immunogenic vaccine delivery platform. Non-replicating Ad vectors possess several attributes which make them attractive vaccines for infectious disease, including their capacity for high titer growth, ease of manipulation, safety, and immunogenicity in clinical studies, as well as their compatibility with clinical manufacturing and thermo-stabilization procedures. In general, Ad vectors are immunogenic vaccines, which elicit robust transgene antigen-specific cellular (namely CD8 + T cells) and/or humoral immune responses. A large number of adenoviruses isolated from humans and non-human primates, which have low seroprevalence in humans, have been vectorized and tested as vaccines in animal models and humans. However, a distinct hierarchy of immunological potency has been identified between diverse Ad vectors, which unfortunately limits the potential use of many vectors which have otherwise desirable manufacturing characteristics. The precise mechanistic factors which underlie the profound disparities in immunogenicity are not clearly defined and are the subject of ongoing, detailed investigation. It has been suggested that a combination of factors contribute to the potent immunogenicity of particular Ad vectors, including the magnitude and duration of vaccine antigen expression following immunization. Furthermore, the excessive induction of Type I interferons by some Ad vectors has been suggested to impair transgene expression levels, dampening subsequent immune responses. Therefore, the induction of balanced, but not excessive stimulation of innate signaling is optimal. Entry factor binding or receptor usage of distinct Ad vectors can also affect their in vivo tropism following administration by different routes. The abundance and accessibility of innate immune cells and/or antigen-presenting cells at the site of injection contributes to early innate immune responses to Ad vaccination, affecting the outcome of the adaptive immune response. Although a significant amount of information exists regarding the tropism determinants of the common human adenovirus type-5 vector, very little is known about the receptor usage and tropism of rare species or non-human Ad vectors. Increased understanding of how different facets of the host response to Ad vectors contribute to their immunological potency will be essential for the development of optimized and customized Ad vaccine platforms for specific diseases.


In vitro Methods for Assessing Immunogenicity Risk

Extensive validation in vitro assays may be cost-prohibitive, thus current practice is to initiate the analysis with advanced in silico tools (127). Następny w silico analysis, HLA binding and T cell assays can be performed or outsourced to commercial research organizations. These assays can be applied (i) at the very early stages of drug development to design de novo therapeutics with low predicted immunogenicity, (ii) at a later stage to de-immunize a clinical asset exhibiting high immunogenicity in First in Human studies, (iii) retrospectively after program termination, to decipher the mechanisms and immunogenicity risk factors underlying the high observed clinical immunogenicity. Clearly, for new (and generic versions of older) biologic drugs to be successful, immunogenicity risk assessment is most cost-effective if performed in the pre-clinical phase of development.

In vitro Testy

HLA Binding Assay

The first step in generating a T cell response is recognition of a peptide antigen presented on a HLA class II / MHC class II molecule to a T cell by an APC. Once a potential epitope is identified by w silico analysis, the prediction can be first validated through HLA binding assays, such as the assay described by Steere et al. (131), to assess the ability of a peptide to bind one or more HLA supertype alleles. Supertype alleles refers to families of HLA-DR alleles that share epitope binding motifs. By taking advantage of these supertype families, it is possible to perform binding assays on a relatively small number of alleles while covering 㺕% of the human population worldwide. A standard binding assay is described in Figure 3.

Rysunek 3. HLA binding assays and optimal peptide design. In brief, the peptide of interest is incubated with an allele-specific labeled tracer peptide and a soluble HLA supertype monomer are incubated to equilibrium. The following day the binding reaction is halted and the mixture is transferred to assay plates precoated with a pan anti-HLA-DR antibody and incubated overnight. Following this incubation, the plates are developed and peptide binding is indirectly measured by time resolved fluorescence spectroscopy. By using a fixed concentration of the labeled tracer peptide and a range of concentrations for the test peptide, one can generate a multi-point dose ranging curve that enables the calculation of an IC50 value which provides information not only about the ability of the peptide to bind HLA (yes/no) but also about the relative affinity of the peptide to a given HLA-DR supertype. Once can utilize the IC50 values to divide peptides into categories based on their affinity for a given HLA allele, such as high, moderate, low, and non-binding. As new technology becomes available and accessible, it will be useful to look at the kinetics of the binding reaction as well.

A key factor in generation of meaningful binding assay data is the design of the peptide sequence to be tested, and source of the test peptide. The core binding region of a class II peptide contains nine amino acids that sit within the peptide binding groove of an HLA molecule. This interaction is stabilized by flanking residues on either side of the core binding region and extend outside of the binding groove. When designing peptides for binding assays, it is important to properly center the binding motif within the peptide. Failing to do so can lead to the absence of binding despite the presence of an HLA binding motif. This is often seen in data generated by making use of overlapping peptides (83, 132).

The negative impact of improper centering of the T cell epitope in the peptide sequence (centered, with flanking residues on either side) is shown in Figure 4.

Rysunek 4. Optimizing test peptides for the HLA peptide binding assay. HLA binding data for Infliximab peptides, published by (83) are shown as described in the publication and compared to w silico przewidywania. The peptides were re-synthesized with centered HLA binding motifs and the assays were performed using a seven-point concentration curve in a competition assay. w silico predicted core residues are shown in dark blue and flanking residues predicted to stabilize binding but not to interact with the binding groove are shown in gray. Residue positions in source protein are indicated next to the results for HLA binding assays to four HLA DR alleles (Columns). (Lewo) Shows the results for HLA binding of original (15mer, overlapping by 5) peptides tested in vitro and published data, as compared to w silico przewidywania. The agreement between predicted and published is only 65%. (Dobrze) Shows repeat data with optimized peptides (MOD) with centered HLA-binding motifs, and repeat assays using a more sensitive assay (competition assays, see Figure 2) as compared to w silico przewidywania. Centering the HLA binding motif and using a more sensitive assay improved the agreement between w silico oraz in vitro assays to 84%. Assay performed by BJR, peptides synthesized at Twenty-first Century Peptides, Waltham, MA).

Peptide purity can also affect the outcome of a binding assay. Purity from some manufacturers can be as low as 60% due to the manufacturing process and the purity of the raw materials. Impurities within the peptides can lead to false positives and lead to faulty conclusions. Peptides for binding assays should be at a minimum 85% pure and should be ordered as net peptide. Spurious results can also be attributed to faulty synthesis. For example, non-binding peptides may have been synthesized on the same machine as earlier runs used to synthesize HLA binding peptides. This type of contamination can derail a drug development program, see for example, reference (133).

Ex vivo Testy

PBMC Assays

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from whole blood are the most prevalent source of responder cells for in vitro cell based assays for immunogenicity prediction (19, 29). The PBMCs used in experiments can be freshly isolated from healthy volunteer or diseased individuals or thawed from a cryopreserved bank of material potentially covering an appropriate representation of disease relevant or common well-documented HLA alleles. Due to the high throughput and ease of execution, PBMC assays using whole PBMCs, or CD8+ T cell depleted PBMCs remain the most commonly performed in vitro cell based assay for measuring the potential of immunogenicity (83, 119, 134�).

In addition to typical biological products like protein, antibodies etc., product co-impurities including such as host cell proteins components, protein aggregates, synthesized peptide fragments, and others can also be evaluated in these assays. Multiple rounds of stimulation can be performed by replacing cell supernatants with fresh media spiked with the desired stimulant during extended culturing in order to expand populations of antigen specific T cells for further characterization (29, 119, 137). Schultz et al. recently reported success with a variation of the PBMC cell based assay that allows the enrichment of the number of CD4+ T cells prior to co-culture with irradiated syngeneic PBMCs in an effort to increase throughput and sensitivity (138).

The biological outcomes for T cell activation can be measured in these in vitro assays (both PBMC based and DC-T cell (see below) using a number of readouts. T-cell proliferation as assessed by thymidine incorporation and CFSE dye dilution are used frequently (7, 139, 140). Activation induced cytokine secretion may be measured using a focused (IL-2, IL-4, IFN-γ) or large multiplexed cytokine immunoassay panels and ELISPOT and are used as markers for T-cell activation and immunogenicity potential (136, 141, 142). Flow cytometry based detection of T cell responders allows a further characterization of the response in terms of intracellular cytokines, regulation of cell surface markers of activation, signal transduction events, and proliferation of specific T cell types (143, 144).

DC-T Cell Assays

In vitro co-cultures of monocyte derived dendritic cells (moDCs) and autologous CD4+ T cells are being increasingly used to evaluate immunogenicity potential of drug candidates and product CQAs. The DC-T cell or DC-PBMC methods pare the system down to the basic components of cell mediated immunity: CD4+ T cells interacting with an APC at relevant cell ratios, enhancing sensitivity as the total number of potential responder cells in the experimental system is much greater than the whole PBMC method. However, this method is time consuming and requires isolation and differentiation of monocytes into dendritic cells followed by an antigen loading/pulsing step which may be reagent, operator and material dependent.

Monocytes may be isolated from PBMC starting material using plastic adherence or isolation steps using magnetic bead separation methods. Differentiation and maturation of moDCs using cytokines or other factors is then performed (7, 57, 144�), concurrently with the addition of the desired biotherapeutic, peptide fragments, or aggregates. The matured, pulsed moDCs are then typically combined in a co-culture with autologous, purified CD4+ T cells to allow for antigen presentation and T cell activation depending on immunogenicity potential. The responses are measured as is performed for PBMC assays as described above. An advanced variation of the moDC-T cell system is the Modular Immune In vitro Construct (MIMIC ® ) model which is capable of reproducibly generating both antigen-specific innate and adaptive immune responses against biologic such as proteins, peptides, mAbs as well as novel modalities including nucleic acids (147, 148) has also been described for these purposes.

Flow Cytometry Analysis of T Cell Phenotype

Flow cytometry has become a valuable tool in the assessment of immunogenicity that allows for the characterization of an immune response down to the single cell level (149). As the instruments become more sophisticated by adding more laser and filter combinations as well as advances in staining and detection methods, a wealth of information can be obtained from a sample of patient's blood.

T cell epitopes have the capacity to be either immunogenic or tolerogenic. While it may be difficult to measure the expansion of Tregs in cell culture, the presence of Treg epitopes can be confirmed by co-incubation with effector T cells in the presence of immunogenic peptides. In this 𠇋ystander assay,” activated Tregs inhibit the antigen-specific T effector response to the immunogenic peptides (150).

A standard bystander assay makes use of the immunologic memory toward antigens such as tetanus toxin, to which the majority of the population has had previous exposure through vaccination or natural exposure. PBMCs are cultured for 10 days in the presence of inactivated tetanus toxoid and the Tregitope at varying concentrations. Cells are stained for analysis by flow cytometry (Teff cells are defined as CD3𫳔�ʿoxP3low, Treg cells are defined as CD3𫳔�lowCD25ʿoxP3hi) and proliferation can then be measured by CFSE dilution. In the presence of Tregitope, we have observed a reduced proliferation of effector T cells to tetanus toxoid compared to the tetanus toxoid alone (151).

Proteomika

MAPPS Assays

In the early 1990s an additional method called MAPPs was first described (152). This assay has proved valuable in identifying processed peptides presented on the surface of antigen presenting cells by relevant HLA. Additionally this approach attempts to understand the variability in antigen processing contributed by enzyme cleavages in healthy and diseased subjects and sequencing of the peptide associated with HLA can provide confirmation/validation to the sequences identified by algorithms.

Recent advancements in LC/MS sensitivity and proteomics analysis have enabled HLA bound mapping assays to be utilized pre-clinically to map potential antigenic sequence contained within a biological therapeutic. Studies have shown that not all potential HLA binding peptides are processed and presented by APC due to a combination of partial unfolding HLA binding and cathepsin trimming. Additionally, editing functions of HLA DM and HLA DO further enhance selectivity of the peptides selected for presentation (153).

In these assays (presented as a schematic in Figure 5) antigen presenting cells are generated in vitro and incubated with the therapeutic protein of interest for 24 h followed by a cytokine/mitogen induced maturation step to upregulate HLA expression. After cell lysis HLA receptor peptide complexes are isolated by immune precipitation followed by an acid elution step to dissociate the peptide from the HLA complex and sequenced by LC/MS. Subtraction of endogenous peptides and mapping of the peptides to the therapeutic can be done using proteomics protein database algorithms. These assays are likely to point toward antigenic peptides that can be targeted for deimmunizing protein engineering. Furthermore, whole blood from relevant diseased state can provide insights into altered presentation as well as tolerance for recombinant replacement therapeutics.

Rysunek 5. MAPPs assay design. Overview of MAPPS assay. Monocytes are isolated from whole PBMCs and differentiated into Dendritic Cells (DCs) in the presence of IL-4 and GMCSF (A). Immature DCs are matured by incubating cells with LPS and antigen (B). Mature DCs (C), are lysed (D). releasing peptide-loaded HLA molecules from the plasma membrane which are collected by immunoprecipitation (MI). Next peptides are eluted from the HLA molecules (F) and analyzed by Mass Spec (G). Peptides are identified by screening them against a database of known antigens (H).

A case study showing the use of algorithms, innate and adaptive phase outputs as well as MAPPs was applied to anti-IL-21 receptor ATR-107 (144). w silico analysis of the primary sequence predicted two overlapping CD4 T cell epitopes in the heavy chain Complementary Determining Region (CDR) 2, and one single epitope in the light chain CDR2. The MAPPs confirmed the epitope in LC CDR2 as a dominant peptide presented by DCs. ATR-107 induced DC activation as attested by an increased expression of cell surface activation markers and cytokine production, and specific proliferation of autologous CD4 T cells in co-culture conditions. As illustrated in Figure 5, the validation of w silico predictions using MAPPS can be reassuring for developers.

However, elution of a peptide in a MAPPs assays does not confirm whether the peptide drives T-cell dependent immune response (13). T cell responses may differ depending on the phenotype of the T cells that are responding to the sequence. Using MAPPs without additional tools that explore the phenotype of T cells that respond to the eluted peptides, may over predict immunogenicity.

The importance of individual epitopes driving immunogenicity was also reinforced in a recent demonstration by Cassotta et al. who conducted a MAPPS analysis of natalizumab immunogenicity, a humanized antibody directed against alpha4 integrins (82). Taking advantage of a combination of w silico and in cellular in vitro assays, in particular a MAPPs assay performed with B cells isolated from patient peripheral blood, the authors established that two multiple sclerosis patients treated with Natalizumab who developed neutralizing ADA mounted a T cell response against a CD4 T cell epitope located in the V region of the light chain.


Materiały i metody

Generation of the pCAG Prdm1β Vector and pCAG CAT 1b8 Transgenic Line

The coding sequence of the murine truncated form of Prdm1 (Prdm1β) ( Gyory et al. 2003) cloned by rapid amplification of cDNA-ends by polymerase chain reaction (RACE PCR) (Vincent SD, unpublished data) linked to an IRES green fluorescent protein (GFP) was cloned into the conditional pCAG CAT vector (kindly provided by Y. Saga, National Institute of Genetics, Japan) ( Watanabe et al. 2006). Efficient conditional expression of the Prdm1β protein was checked by co-transfection in C2C12 cells with a plasmid expressing Cre followed by green fluorescent protein (GFP) expression and western blot analysis. Linearized vector was microinjected by the Centre d'Ingénierie Génétique Murine platform (Institut Pasteur, France) to generate transgenic mouse lines. Three independent lines were established, only one of which showed bright GFP expression after Cre recombination. This line, Tg(pCAG CAT 1b8), was employed in this study, using the Myf5 Cre/+ line.

Mouse Strains and Genotyping

ten Blimp1-mEGFP, Mrf4 − (Myf6 tm1Eno ), Myf5 Cre , Myf5 lox , Myf5 nlacZ , Myod1 − , Pax3 Cre , Prdm1 BEH , Prdm1 CA , Shh − , Smo − alleles have been described elsewhere ( Rudnicki et al. 1992 Zhang et al. 1995 Tajbakhsh, Bober, et al. 1996 Tallquist et al. 2000 Zhang et al. 2001 Shapiro-Shelef et al. 2003 Kassar-Duchossoy et al. 2004 Engleka et al. 2005 Ohinata et al. 2005 Vincent et al. 2005). ten Myog − (Myogenin) allele was obtained from the Myog flox allele ( Knapp et al. 2006) by crossing with the PGKCre transgenic line ( Lallemand et al. 1998). Mouse care and procedures were in accordance with institutional and national guidelines. Embryonic day (E) 0.5 was counted from the appearance of a vaginal plug.

Whole-Mount In Situ Hybridization and Immunolocalization

Whole-mount in situ hybridization was performed according to standard protocols ( Nagy et al. 2003). Prdm1 ( Vincent et al. 2003) and Myog ( Sassoon et al. 1989) probes have been previously described. Jeden z Sox6 probes was produced from a plasmid template kindly given by N. Hagiwara (University of California, Davis): The template was linearized with NotI and the probe was transcribed using SP6 RNA polymerase (Promega). Drugi Sox6 probe was transcribed using SP6 RNA polymerase from a template generated by PCR (GCA GCC ACA CGG AGT TGA TG and CAT TTA GGT GAC ACT ATA GTG ATG GTG TGG TCG TTG CC primers). Both probes gave similar results.

Embryos were dissected at E10.5 and then fixed for 2 h in 4% paraformaldehyde at 4 °C. After three rinses, embryos were transferred to 15% sucrose/phosphate buffered saline and embedded in 7% gelatin and 15% sucrose. Embryos were sectioned on a Leica cryostat, to give 20-μm thick slices (or 50-μm thick slices for Sox6 oraz Myog whole-mount in situ hybridized embryos). As primary antibodies, a chick polyclonal for GFP (Invitrogen), rabbit polyclonal antibodies Myogenin (Santa Cruz), and Mrf4 (Invitrogen), mouse monoclonal antibodies MF20 (all MyHC) (DSHB), Pax3 (DSHB), and Ki67 (BD Biosciences), and a rat monoclonal antibody for Prdm1 (6D3 Santa Cruz) were used. As secondary antibodies, conjugated Alexa 488/546 against the different species (Invitrogen) were used. Immunolocalization was performed as described and analyzed with a Zeiss ApoTome system.

Quantitative Reverse Transcription–PCR Analysis

Total RNA was prepared from E10.5 and E11.5 embryos. Briefly, individual embryos were staged by counting the somite number and lysed in TRIzol (Invitrogen). After genotyping, total RNA was prepared according to the manufacturer’s protocol (Applied Biosystem). RNA was purified on PureLink RNA mini kit columns (Invitrogen). RNA was then quantified using a nanodrop spectrophotometer. Five hundred nanograms of RNA were retro-transcribed with random hexamers and Superscript II (Invitrogen). Quantitative PCR was performed using the Power SYBR Green PCR Master Mix on a StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystem), with RNA extracted from embryos with the same number of somites. Three mutant and two control embryos with the same somite number were analyzed as triplicates. Primer sequences have been published elsewhere ( Niro et al. 2009). Results were standardized to GAPDH oraz Myog transkrypcje. Data were analyzed using the Mann–Whitney non parametric test (http://www.anastats.fr/).


Are innate immune signaling pathways in plants and animals conserved?

Although adaptive immunity is unique to vertebrates, the innate immune response seems to have ancient origins. Common features of innate immunity in vertebrates, invertebrate animals and plants include defined receptors for microbe-associated molecules, conserved mitogen-associated protein kinase signaling cascades and the production of antimicrobial peptides. It is commonly reported that these similarities in innate immunity represent a process of divergent evolution from an ancient unicellular eukaryote that pre-dated the divergence of the plant and animal kingdoms. However, at present, data suggest that the seemingly analogous regulatory modules used in plant and animal innate immunity are a consequence of convergent evolution and reflect inherent constraints on how an innate immune system can be constructed.



Uwagi:

  1. Harun Al Rachid

    Bravo, doskonały pomysł i jest należycie

  2. Arajar

    Twoje pytanie, jak docenić?

  3. Nikogis

    Między nami, moim zdaniem, jest to oczywiste. Radzę spróbować google.com

  4. Jerrett

    Uważam, że nie masz racji. Zapewniam. Proponuję omówić. Napisz do mnie na PW.

  5. Farrell

    Myślę że się mylisz. Jestem pewien. Proponuję omówić to. Napisz do mnie



Napisać wiadomość