Informacja

14.3: Receptory 7-TM (sprzężone z białkiem G) - Biologia

14.3: Receptory 7-TM (sprzężone z białkiem G) - Biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Receptory 7-transbłonowe lub receptory sprzężone z białkiem G są, jak można się spodziewać, rodziną białek, które przechodzą przez błonę komórkową 7 razy. Koniec aminowy jest zewnątrzkomórkowy, a koniec karboksylowy jest wewnątrzkomórkowy. Rysunek (PageIndex{2}) pokazuje regiony transbłonowe rozłożone dla przejrzystości, ale domeny transbłonowe w rzeczywistości tworzą razem bardziej cylindryczny kształt.

Białka 7-TM są wykorzystywane jako receptory neuroprzekaźników, takich jak epinefryna (receptor β-adrenergiczny), acetylocholina (receptor muskarynowy) i serotonina, a także hormony, takie jak glukagon czy hormon tyreotropowy, a nawet niemolekularne ligandy, takie jak światło ! Rodopsyny to klasa receptorów 7-TM, które są aktywowane, gdy absorbują foton (rysunek (PageIndex{5})). Aktywacja tej rodziny receptorów, czy to przez foton, czy przez bardziej konwencjonalne wiązanie liganda, indukuje zmianę konformacyjną w domenie cytoplazmatycznej, która zmienia oddziaływanie między receptorem a kompleksem białkowym znanym jako heterotrimeryczne białko G.

Heterotrimeryczne białko G składa się z podjednostek a, b i g, z których podjednostka a może wiązać GTP lub GDP i może hydrolizować GTP do GDP. Gdy receptor 7-TM jest nieaktywny, kompleks białka G jest zwykle blisko związany z błoną przez mirystoilację lub palmitoilację podjednostki a oraz farnezylację lub geranylogeranylację podjednostki g. Po aktywacji receptora 7-TM łączy się on z heterotrimerycznym białkiem G, co powoduje, że Ga odpuszcza GDP i wiąże się z GTP. To następnie oddziela Ga od pozostałych dwóch podjednostek. Następnie może łączyć się z enzymem i aktywować go, aby rozszerzyć kaskadę sygnalizacyjną. Jedna z dwóch klasycznych ścieżek rozpoczyna się aktywacją Ga cyklazy adenylanowej (adenylilowej). Cyklaza adenylanowa (AC) przekształca ATP w cAMP. Ponieważ ATP jest obfite, a AC jest stosunkowo szybkim enzymem, pierwsze wzmocnienie sygnału następuje wraz z wygenerowaniem „drugiego przekaźnika” cząsteczki cAMP. Każda cząsteczka cAMP może następnie aktywować inne enzymy, z których głównym jest kinaza białkowa A. PKA może następnie fosforylować różne substraty, aby zmienić aktywność komórkową poprzez ekspresję genów, motory molekularne lub zmiany metaboliczne.

Innym klasycznym szlakiem dla receptorów 7-TM jest aktywacja fosflipazy Cb, również przez Ga. PLCb faktycznie wytwarza dwie cząsteczki drugiego przekaźnika: hydrolizuje fosfatydyloinozytol do diacyloglicerolu (DAG) i trifosforanu inozytolu (IP3). IP3 przede wszystkim indukuje uwalnianie Ca2+ z retikulum endoplazmatycznego. DAG może aktywować kinazę białkową C. PKC jest również aktywowany przez Ca2+ i zarówno Ca2+ a DAG może aktywować PKC synergistycznie. Kinaza białkowa C jest ważną kinazą centralną, która, jak wykazano, fosforyluje i kontroluje aktywność wielu innych enzymów, od elementów cytoszkieletu po czynniki transkrypcyjne.

Ciekawa odmiana klasycznych szlaków 7-TM zaczyna się od receptorów rodopsyny w komórkach pręcikowych. Receptory te wiążą fotony w celu aktywacji i angażują heterotrimeryczne białko G. Ga-GTP wiąże się następnie z podjednostką g fosfodiesterazy (PDE), aktywując ją i katalizując konwersję cGMP do GMP. Wraz ze spadkiem cGMP kanały jonowe zamykają się, polaryzując błonę i zmieniając sygnał z pręcika do mózgu (poprzez łączące się neurony).

Posłańcy muszą mieć dwie właściwości. Muszą być wystarczająco małe, aby skutecznie się rozpraszały, a komórka musi być w stanie je szybko wygenerować. Ca2+ i cAMP należą do tej kategorii. Co więcej, oba mogą być dość szybko usunięte z obiegu: ten pierwszy przez Ca2+ pompy w ER i Golgiego, a ten ostatni przez aktywność fosfodiesterazy. Kiedy odkryto szlak białka G, zastosowanie wtórnych przekaźników lipidowych było zaskakujące. Fosfolipidy błonowe były wówczas w dużej mierze ignorowane jako proste statyczne składniki błon. Obecnie jest jasne, że niektóre fosfolipidy są aktywne biochemicznie, z kilkoma enzymami, które je modyfikują, w tym fosfolipazy, kinazy fosfolipidowe i fosfatazy fosfolipidowe. Niektóre z tych enzymów pełnią różnorodne funkcje, ponieważ ich substrat produktu może być ważną cząsteczką przekaźnikową. Na przykład PI3K (kinaza 3-fosfatydyloinozytolu) jest centralną kinazą sygnalizacyjną, ponieważ jej produkt, PIP3 (trifosforan fosfatydyloinozytolu (3,4,5)) jest aktywatorem Akt/PKB i innych enzymów, które mogą aktywować kilka ścieżek sygnalizacyjnych.

Aktywacja musi w końcu się zakończyć i dzieje się tak, gdy Ga hydrolizuje związany z nią GTP. W ten sposób Ga działa jako swego rodzaju zegar kaskady sygnalizacyjnej. Jest to ważne, ponieważ aby sygnalizacja była skuteczna, musi być ściśle kontrolowana. Bardzo wcześnie w tym kursie wskazano, że Ca2+ jest utrzymywany w bardzo niskim stężeniu w cytoplazmie komórki, ponieważ chcemy Ca2+-czułe mechanizmy, aby móc szybko reagować na dopływ wapnia, ale równie dobrze chcemy móc szybko wyłączyć sygnał w razie potrzeby, a jest to oczywiście znacznie łatwiejsze dzięki sekwestracji niewielkiej ilości Ca2+ niż dużo. Podobnie, jeśli wymagana jest przedłużona aktywność komórki biorcy, jest ona osiągana przez ciągłą aktywację receptora, a nie przez długotrwały efekt pojedynczej aktywacji. Gwarantuje to, że jeśli efekt komórkowy musi zostać nagle i szybko odcięty, można go osiągnąć bez znaczącego okresu opóźnienia między ustaniem wydzielania hormonów a ustaniem sygnalizacji wewnątrzkomórkowej.

Receptor jest również częścią innego mechanizmu odcinającego: aby zapobiec nadmiernej stymulacji, receptory są odczulane przez krótki czas po aktywacji. Kinaza receptora sprzężonego z białkiem G (GRK) fosforyluje receptor 7-TM. Fosforylacja tworzy miejsca rozpoznawania arestyn. Arestyny ​​pełnią różne funkcje, z których najprostszą jest działanie jako kompetycyjny inhibitor wiązania białka G przez receptor. Jest to stosunkowo krótkotrwałe odczulanie.

W celu dłuższego odczulania arestyna wiąże się z AP2 i klatryną, tworząc zarodki w pęcherzyku endocytowym pokrytym klatryną. Powoduje to usunięcie receptora z powierzchni komórki, odczulając komórkę na znacznie dłuższy czas niż zwykła konkurencja między arestyną a białkiem G.

Arestyny ​​pełnią inną potencjalną funkcję. Mogą działać jako białka rusztowania, które przenoszą zupełnie inny kompleks sygnalizacyjny do receptora 7-TM. Rysunek (PageIndex{8}) przedstawia przykład, w którym receptor 7-TM jest używany do aktywacji czynnika transkrypcyjnego Jun.

B-arrestin doprowadza AJK-1, MKKY i JNK-1 do aktywacji JNK-1, który może następnie fosforylować Jun. Umożliwia to translokację fosfo-Jun do jądra i późniejszą dimeryzację, przekształcając go w aktywny czynnik transkrypcyjny.

Jakie są działania komórkowe, które może wywołać aktywacja receptora 7-TM? Ca2+ dynamika zostanie omówiona w osobnej sekcji. IP3 Wykazano, że wywołuje skurcz mięśni gładkich i szkieletowych, polimeryzację aktyny i zmiany kształtu komórek, uwalnianie wapnia z zapasów wewnątrzkomórkowych, otwieranie kanałów potasowych i depolaryzację błony. cAMP odgrywa rolę w kontrolowaniu rozkładu glikogenu i glukoneogenezy, metabolizmie triacyglicerolu, wydzielaniu estrogenów przez komórki jajnika, wydzielaniu glukokortykoidów i zwiększonej przepuszczalności komórek nerki dla wody.


Strukturalne spostrzeżenia na temat różnic między pochodnymi laktyzolu w mechanizmach hamowania ludzkiego receptora słodkiego smaku

Laktizol, inhibitor ludzkiego receptora słodkiego smaku, ma szkielet z kwasu 2-fenoksypropionowego i wykazano, że oddziałuje z domeną transbłonową podjednostki T1R3 (T1R3-TMD) receptora. Potwierdzono, że inny inhibitor, 2,4-DP, który ma ten sam szkielet cząsteczkowy co laktyzol, ma około 10-krotnie silniejsze działanie hamujące niż laktyzol, jednak podstawa strukturalna ich mechanizmów hamujących receptor pozostaje do wyjaśnienia. Ostatnio doniesiono o strukturach krystalicznych TMD metabotropowych receptorów glutaminianu, które wraz z receptorami T1R zalicza się do receptorów sprzężonych z białkiem G klasy C, co umożliwiło stworzenie dokładnego modelu strukturalnego T1R3-TMD. W tym badaniu szczegółowy mechanizm strukturalny leżący u podstaw hamowania słodkiego smaku został scharakteryzowany przez porównanie działania laktyzolu na T1R3-TMD z działaniem 2,4-DP. Najpierw przeprowadziliśmy serię eksperymentów z wykorzystaniem hodowanych komórek wyrażających receptor słodkiego smaku z mutacjami i zbadaliśmy interakcje z tymi inhibitorami. Na podstawie wyników przeprowadziliśmy następnie symulacje dokowania, a następnie zastosowaliśmy minimalizację energii opartą na dynamice molekularnej. Nasze analizy jasno wykazały, że (S)-izomery zarówno laktyzolu, jak i 2,4-DP oddziaływały z tymi samymi siedmioma resztami w T1R3-TMD i że moc hamująca tych inhibitorów wynikała głównie z oddziaływań stabilizujących, w których pośredniczą ich grupy karboksylowe w wymiarze pionowym kieszeni liganda T1R3-TMD. Ponadto 2,4-DP uczestniczy w oddziaływaniu hydrofobowym, w którym pośredniczy jego grupa o-Cl, i to oddziaływanie może być głównie odpowiedzialne za wyższą siłę hamowania 2,4-DP.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją sprzeczne interesy.

Figury

Ryc. 1. Laktyzol i 2,4-DP jako słodkie…

Rys. 1. Laktizol i 2,4-DP jako inhibitory słodkiego smaku.

(A) Wzory strukturalne (±)-laktyzolu i…

Rys 2. Symulacje MD i ich presymulacje…

Rys 2. Symulacje MD i ich presymulacje dla laktyzolu i 2,4-DP.

Rys 3. Porównanie wyników…

Rys 3. Porównanie wyników minimalizacji MD dla ( S )-laktyzol i (…

Rys. 4. Aktywność hamująca słodki smak…

Ryc. 4. Aktywność hamująca słodki smak ( S )-, ( r )-laktyzol i (…


Abstrakcyjny

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) mają kluczowe znaczenie dla wielu podstawowych komórkowych szlaków sygnałowych. Przekazują sygnały z zewnątrz do wnętrza komórek w procesach fizjologicznych, od wzroku po odpowiedź immunologiczną. Niezwykle trudne jest przyjrzenie się im indywidualnie przy użyciu konwencjonalnych technik eksperymentalnych. Ostatnio pseudoatomistyczny model molekularny okazał się cennym narzędziem dostępu do informacji o GPCR, a dokładniej o ich interakcjach ze środowiskiem w ich natywnej błonie komórkowej oraz konsekwencjach dla ich organizacji supramolekularnej. Podejście to wykorzystuje model gruboziarnisty (CG) Martini do opisu receptorów, lipidów i rozpuszczalnika w symulacjach dynamiki molekularnej (MD) i wystarczająco szczegółowo, aby umożliwić zachowanie chemicznej specyficzności różnych cząsteczek. Eliminacja niepotrzebnych stopni swobody umożliwiła wielkoskalowe symulacje supramolekularnej organizacji GPCR za pośrednictwem lipidów. Tutaj, po wprowadzeniu metody Martini CGMD, dokonujemy przeglądu tych badań przeprowadzonych na różnych członkach rodziny GPCR, w tym rodopsynie (receptorze wzrokowym), receptorach opioidowych, receptorach adrenergicznych, receptorach adenozyny, receptorze dopaminowym i receptorze sfingozyno-1-fosforanowym. Badania te ujawniły interesujący zestaw nowych zasad biofizycznych. Spostrzeżenia sięgają od ujawnienia zlokalizowanych i niejednorodnych deformacji dwuwarstwy błonowej na powierzchni białka, specyficznych interakcji cząsteczek lipidów z poszczególnymi GPCR, po wpływ macierzy błonowej na globalną samoorganizację GPCR. Przegląd kończy się przeglądem wniosków wyciągniętych ze stosowania metody CGMD, biofizyczno-chemicznych ustaleń dotyczących wzajemnego oddziaływania lipidów i białek.


Lefkowitz, RJ Nadrodzina receptorów heptahelikalnych. Natura Komórka Biol. 2, E133–E136 (2000).Perspektywa historyczna opisująca początki dziedziny sygnalizacji receptora 7TM w latach 70. i 80. XX wieku.

Dixon, R.A. i in. Klonowanie genu i cDNA dla receptora β-adrenergicznego ssaka i homologia z rodopsyną. Natura 321, 75–79 (1986).Ten artykuł opisuje klonowanie receptora β2-adrenergicznego, jego analogię i homologię 7TM z rodopsyną i spekuluje na temat istnienia dużej rodziny takich receptorów.

Dohlman, HG, Thorner, J., Caron, MG i Lefkowitz, RJ Modelowe systemy do badania receptorów siedmiotransbłonowych. Annu. Ks. Biochem. 60, 653–688 (1991).

Lee, D.K., George, S.R. i O'Dowd, B.F. Novel geny receptora sprzężonego z białkiem G wyrażane w mózgu: ciągłe odkrywanie ważnych celów terapeutycznych. Opinia eksperta. Tam. Cele 6, 1–18 (2002).

Palczewski, K. i in. Struktura krystaliczna rodopsyny: receptor sprzężony z białkiem G. Nauki ścisłe 289, 739–745 (2000).Opisuje strukturę krystaliczną jedynego dotychczas rozwiązanego receptora 7TM.

Rodbell, M., Birnbaumer, L., Pohl, SL & Krans, HM Układ cyklazy adenylowej wrażliwy na glukagon w błonach plazmatycznych wątroby szczura. V. Obowiązkowa rola guanylonukleotydów w działaniu glukagonu. J. Biol. Chem. 246, 1877–1882 (1971).

Gilman, białka AG G: przetworniki sygnałów generowanych przez receptor. Annu. Ks. Biochem. 56, 615–649 (1987).

Ballesteros, JA i in. Aktywacja receptora β2-adrenergicznego obejmuje przerwanie śluzy jonowej między cytoplazmatycznymi końcami segmentów transbłonowych 3 i 6. J. Biol. Chem. 276, 29171–29177 (2001).

Farahbakhsh, ZT, Ridge, KD, Khorana, HG & Hubbell, WL Mapowanie zależnych od światła zmian strukturalnych w pętli cytoplazmatycznej łączącej helisy C i D w rodopsynie: ukierunkowane badanie znakowania spinów. Biochemia 34, 8812–8819 (1995).

De Vries, L. i in. Regulator rodziny sygnałowej białka G. Annu. ks. Pharmacol. Toksykol. 40, 235–271 (2000).

Ross, EM i Wilkie, białka aktywujące GTPazę TM dla heterotrimerycznych białek G: regulatory sygnalizacji białka G (RGS) i białka podobne do RGS. Annu. Ks. Biochem. 69, 795–827 (2000).

Klein, S., Reuveni, H. i Levitzki, A. Transdukcja sygnału przez niedysocjacyjne heterotrimeryczne białko G drożdży. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 97, 3219–3123 (2000).

Ferguson, SS Ewoluujące koncepcje w endocytozie receptora sprzężonego z białkiem G: rola w odczulaniu i sygnalizacji receptora. Pharmacol. Obrót silnika. 53, 1–24 (2001).

Pitcher, JA, Freedman, NJ i Lefkowitz, RJG sprzężone z białkiem kinazy receptorowe. Annu. Ks. Biochem. 67, 653–692 (1998).Obszerny przegląd biochemii i regulacji kinaz receptorowych sprzężonych z białkiem G.

Daaka, Y., Luttrell, LM i Lefkowitz, RJ Przełączanie sprzężenia receptora β2-adrenergicznego z różnymi białkami G przez kinazę białkową A. Natura 390, 88–91 (1997).Opisuje nowy mechanizm, za pomocą którego specyficzność sprzęgania białek G receptorów 7TM może być regulowana przez fosforylację receptora za pośrednictwem kinazy białkowej A.

Zamah, AM, Delahunty, M., Luttrell, LM i Lefkowitz, RJ PKA, w której pośredniczy fosforylacja receptora β2-adrenergicznego reguluje jego sprzężenie z Gs i Gi: Demonstracja w odtworzonym układzie. J. Biol. Chem. (w prasie).

Lawler, O. A., Miggin, SM i Kinsella, BT Fosforylacja seryny 357 mysiego receptora prostacykliny za pośrednictwem kinazy białkowej A reguluje jego sprzężenie z sygnałami efektorowymi Gs, Gi i Gq. J. Biol. Chem. 276, 33596–33607 (2001).

Krupnick, JG i Benovic, JL Rola kinaz receptorowych i arestyn w regulacji receptora sprzężonego z białkiem G. Annu. ks. Pharmacol. Toksykol. 38, 289–319 (1998).Obszerny przegląd tego uniwersalnego systemu regulacji receptorów.

Zhang, J. i in. Molekularne mechanizmy sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G: rola kinaz receptorowych sprzężonych z białkiem G i arestyn w odczulaniu i resensytyzacji receptorów. Kanały receptorów 5, 193–199 (1997).

Winstel, R. i in. Przenikanie kinazy białkowej: ukierunkowanie na błonę kinazy receptora β-adrenergicznego przez kinazę białkową C. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 93, 2105–2109 (1996).

Cong, M. i in. Regulacja ukierunkowania na błonę kinazy receptorowej sprzężonej z białkiem G 2 przez kinazę białkową A i jej białko kotwiczące AKAP79. J. Biol. Chem. 276, 15192–15199 (2001).

Krueger, KM, Daaka, Y., Pitcher, JA i Lefkowitz, RJ Rola sekwestracji w resensytyzacji receptora sprzężonego z białkiem G. Regulacja defosforylacji receptora β2-adrenergicznego poprzez zakwaszenie pęcherzyków. J. Biol. Chem. 272, 5–8 (1997).

Dzban, JA i in. Fosfataza receptora sprzężonego z białkiem G: fosfataza białkowa typu 2A o wyraźnej dystrybucji subkomórkowej i specyficzności substratowej. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 92, 8343–8347 (1995).

Tsao, P. i von Zastrow, M. Regulacja w dół receptorów sprzężonych z białkiem G. Aktualn. Opinia. Neurobiol. 10, 365–369 (2000).

Collins, S., Caron, MG i Lefkowitz, RJ Regulacja reaktywności receptora adrenergicznego poprzez modulację ekspresji genu receptora. Annu. Ks. Fizjol. 53, 497–508 (1991).

Lyubarsky, A.L. i in. RGS9-1 jest wymagany do normalnej inaktywacji fototransdukcji czopków myszy. Mol. Vis. 7, 71–78 (2001).

Oliveira-Dos-Santos, A.J. i in. Regulacja aktywacji komórek T, lęku i męskiej agresji przez RGS2. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 97, 12272–12277 (2000).

Howard, A.D. i in. Receptory sprzężone z sierocymi białkami G i odkrycie naturalnych ligandów. Trendy Pharmacol. Nauka. 22, 132–140 (2001).

Kobilka, B.K. i in. Gen bezintronowy kodujący potencjalnego członka rodziny receptorów sprzężonych z białkami regulatorowymi nukleotydów guaninowych. Natura 329, 75–79 (1987).

Fargin, A. i in. Klon genomowy G-21, który przypomina sekwencję receptora β-adrenergicznego, koduje receptor 5-HT1A. Natura 335, 358–360 (1988).

Hsu, S.Y. i in. Aktywacja receptorów sierocych przez hormon relaksynę. Nauki ścisłe 295, 671–674 (2002).

Lembo, P.M. i in. Produkty genu proenkefaliny A aktywują nową rodzinę GPCR specyficznych dla neuronów czuciowych. Neurologia przyrody. 5, 201–209 (2002).

Chuang, DM i Costa, E. Dowody na internalizację miejsca rozpoznawania receptorów β-adrenergicznych podczas wrażliwości receptora indukowanej przez (-)-izoproterenol. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 76, 3024–3028 (1979).

Chuang, DM i Costa, E. β-adrenergiczne receptory erytrocytów żab. Następstwa biochemiczne po stymulacji izoproterenolem. Neurochem. Res. 4, 777–793 (1979).

Daaka, Y. i in. Istotna rola endocytozy receptora sprzężonego z białkiem G w aktywacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenami. J. Biol. Chem. 273, 685–688 (1998).

Claing, A., Laporte, SA, Caron, MG i Lefkowitz, RJ Endocytoza receptorów sprzężonych z białkiem G: role kinaz receptorowych sprzężonych z białkiem G i białek β-arrestinowych. Wałówka. Neurobiol. 66, 61–79 (2002).Przegląda złożone mechanizmy zaangażowane w endocytozę receptora 7TM.

Claing, A. i in. Liczne szlaki endocytarne receptorów sprzężonych z białkiem G określone przez czułość GIT1. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 97, 1119–1124 (2000).

Smart, EJ i in. Caveoliny, domeny uporządkowane w płynie i transdukcja sygnału. Mol. Komórka. Biol. 19, 7289–7304 (1999).

Lohse, M.J. i in. β-Arrestin: białko, które reguluje funkcję receptora β-adrenergicznego. Nauki ścisłe 248, 1547–1550 (1990).

Goodman, O.B., Jr i in. β-Arrestin działa jako adapter klatrynowy w endocytozie receptora β2-adrenergicznego. Natura 383, 447–450 (1996).

Laporte, SA i in. Kompleks receptor β-adrenergiczny/β-arrestyna rekrutuje adapter klatrynowy AP-2 podczas endocytozy. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 96, 3712–3717 (1999).

Gajdarowa, I. i in. Funkcja arestyny ​​w endocytozie receptora sprzężonego z białkiem G wymaga wiązania fosfoinozytydu. EMBO J. 18, 871–881 (1999).

Scott, MG, Benmerah, A., Muntaner, O. i Marullo, S. Rekrutacja receptorów sprzężonych z aktywowanym białkiem G do wcześniej istniejących dołów pokrytych klatryną w żywych komórkach. J. Biol. Chem. 277, 3552–3559 (2002).

Santini, F., Gaidarov, I. & Keen, JHG sprzężony z białkiem receptor / modulacja arestyny3 maszynerii endocytowej. J. Cell Biol. 156, 665–676 (2002).

Oakley, R.H. i in. Różnicowe powinowactwa arestyny ​​wzrokowej, β-arrestyny1 i β-arrestyny2 do GPCR wyznaczają dwie główne klasy receptorów. J. Biol. Chem. 275, 17201–17210 (2000).

Luttrell, L.M. i in. Zależne od β-arrestyny ​​tworzenie kompleksów receptora β2-adrenergicznego z kinazą białkową Src. Nauki ścisłe 283, 655–661 (1999).

Ahn, S. i in. Zależna od Src fosforylacja tyrozyny dynaminy jest wymagana do internalizacji receptora β2-adrenergicznego i sygnalizacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenami. J. Biol. Chem. 274, 1185–1188 (1999).

Ahn, S. i in. Zależna od c-Src fosforylacja tyrozyny reguluje samoorganizację dynaminy i endocytozę za pośrednictwem receptora. J. Biol. Chem. 277, 26642–26651 (2002).

Shenoy, SK, McDonald, PH, Kohout, TA i Lefkowitz, RJ Regulacja losu receptora przez ubikwitynację aktywowanego receptora β2-adrenergicznego i β-arrestyny. Nauki ścisłe 294, 1307–1313 (2001).

Pickart, CM Mechanizmy leżące ubikwitynacji. Annu. Ks. Biochem. 70, 503–533 (2001).

McDonald, P.H. i in. Identyfikacja NSF jako białka wiążącego β-arrestynę1. Implikacje dla regulacji receptora β2-adrenergicznego. J. Biol. Chem. 274, 10677–10680 (1999).

Claing, A. i in. Aktywacja czynnika 6 ADP-rybozylacji za pośrednictwem β-arrestyny ​​i endocytoza receptora β2-adrenergicznego. J. Biol. Chem. 276, 42509–42513 (2001).

Premont, R.T. i in. Regulacja receptora β2-adrenergicznego przez GIT1, białko aktywujące GTPazę czynnika rybozylacji ADP sprzężonego z kinazą receptorową sprzężoną z białkiem G. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 95, 14082–14087 (1998).

Cong, M. i in. Wiązanie receptora β2 adrenergicznego z nczynnik wrażliwy na etylomaleimid reguluje recykling receptora. J. Biol. Chem. 276, 45145–45152 (2001).

Seachrist, J.L. i in. Połączenie Rab5 z receptorem angiotensyny II typu 1A promuje wiązanie Rab5 GTP i fuzję pęcherzyków. J. Biol. Chem. 277, 679–685 (2002).

Kohout, T.A. i in. β-Arrestin 1 i 2 w różny sposób regulują sygnalizację i transport receptorów heptahelikalnych. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 98, 1601–1606 (2001).

Marchese, A. i Benovic, JL Agonist Promowana ubikwitynacja receptora CXCR4 sprzężonego z białkiem G pośredniczy w sortowaniu lizosomalnym. J. Biol. Chem. 276, 45509–45512 (2001).

Dodge, K. & Scott, J.D. AKAP79 i ewolucja modelu AKAP. FEBS Lett. 476, 58–61 (2000).

Fraser, I.D. i in. Złożenie kompleksu białka kotwiczącego kinazę A – receptora β(2)-adrenergicznego ułatwia fosforylację receptora i sygnalizację. Aktualn. Biol. 10, 409–412 (2000).

Shih, M. i in. Dynamiczne kompleksy receptorów β-adrenergicznych z kinazami białkowymi i fosfatazami oraz rola grawiny. J. Biol. Chem. 274, 1588–1595 (1999).

Diviani, D., Soderling, J. & Scott, JD AKAP-Lbc zakotwicza kinazę białkową A i jądra selektywne tworzenie włókien stresowych za pośrednictwem Rho. J. Biol. Chem. 276, 44247–44257 (2001).

Tsunoda, S. i in. Wielowartościowe białko domeny PDZ tworzy kompleksy sygnałowe w kaskadzie sprzężonej z białkiem G. Natura 388, 243–249 (1997).

Brakeman, P.R. i in. Homer: białko, które selektywnie wiąże metabotropowe receptory glutaminianu. Natura 386, 284–288 (1997).

Cao, W. i in. Do aktywacji kinazy MAP wymagane jest bezpośrednie wiązanie aktywowanego c-Src z receptorem β3-adrenergicznym. J. Biol. Chem. 275, 38131–38134 (2000).

Marrero, M.B. i in. Bezpośrednia stymulacja szlaku Jak/STAT przez receptor angiotensyny II AT1. Natura 375, 247–250 (1995).

Hall, R. i in. Receptor β2-adrenergiczny oddziałuje z czynnikiem regulacyjnym wymieniacza Na+/H+, aby kontrolować wymianę Na+/H+. Natura 392, 626–630 (1998).

Hall, R.A. i in. Motyw C-końcowy występujący w receptorze β2-adrenergicznym, receptorze P2Y1 i przezbłonowym regulatorze przewodnictwa mukowiscydozy determinuje wiązanie z rodziną czynników regulatorowych wymieniacza Na+/H+ białek PDZ. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 95, 8496–8501 (1998).

Hu, L.A. i in. Powiązanie receptora β1-adrenergicznego z PSD-95. Hamowanie internalizacji receptora i ułatwianie interakcji receptora β1-adrenergicznego z nreceptory -metylo-d-asparaginianowe. J. Biol. Chem. 275, 38659–38666 (2000).

Sheng, M. & Sala, C. Domeny PDZ i organizacja kompleksów supramolekularnych. Annu. Ks. Neurosci. 24, 1–29 (2001).Autorytatywny przegląd mechanizmu interakcji białko-białko, który reguluje kilka interakcji GPCR.

Luttrell, L.M. i in. Zależne od β-arrestyny ​​tworzenie kompleksów kinazy białkowej receptora β2-adrenergicznego Src. Nauki ścisłe 283, 655–661 (1999).

Imamura, T. i in. Rekrutacja kinazy z rodziny Src Yes, w której pośredniczy β-arrestyna, pośredniczy w stymulowanym przez endotelinie-1 transporcie glukozy. J. Biol. Chem. 276, 43663–43667 (2001).

Barlic, J. i in. Regulacja aktywacji kinazy tyrozynowej i uwalniania granulek przez β-arrestynę przez CXCR1. Natura Immunol. 1, 227–233 (2000).

DeFea, K.A. i in. Zależna od β-arrestyny ​​endocytoza receptora 2 aktywowanego proteinazą jest wymagana do wewnątrzkomórkowego ukierunkowania aktywowanego ERK1/2. J. Cell Biol. 148, 1267–1281 (2000).Opisuje rolę β-arrestyny ​​w pośredniczeniu w aktywacji ERK przez receptory 7TM.

Luttrell, L.M. i in. Aktywacja i ukierunkowanie pozakomórkowych kinaz regulowanych sygnałem przez rusztowania β-arrestynowe. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 98, 2449–2454 (2001).

McDonald, P.H. i in. β-Arrestin 2: regulowane przez receptor rusztowanie MAPK do aktywacji JNK3. Nauki ścisłe 290, 1574–1577 (2000).

Tohgo, A. i in. Rusztowanie β-arrestyny ​​kaskady ERK zwiększa aktywność cytozolowej ERK, ale hamuje transkrypcję, w której pośredniczy ERK po stymulacji receptora angiotensyny AT1a. J. Biol. Chem. 277, 9429–9436 (2002).

Cerione, R.A. i in. Odtworzenie wrażliwego na hormony układu cyklazy adenylanowej. Czysty receptor β-adrenergiczny i białko regulatorowe nukleotydu guaninowego nadają odpowiedzi hormonalnej oddzielonej jednostce katalitycznej. J. Biol. Chem. 259, 9979–9982 (1984).

Cerione, R.A. i in. Receptor β2-adrenergiczny ssaka: odtworzenie funkcjonalnych interakcji pomiędzy czystym receptorem i czystym białkiem wiążącym nukleotydy stymulujące układu cyklazy adenylanowej. Biochemia 23, 4519–4525 (1984).

Heldin, CH Dimeryzacja receptorów powierzchniowych komórek w transdukcji sygnału. Komórka 80, 213–223 (1995).

Jordan, BA i Devi, LA G-białko sprzężona heterodimeryzacja receptora moduluje funkcję receptora. Natura 399, 697–700 (1999).

Devi, LA Heterodimeryzacja receptorów sprzężonych z białkiem G: farmakologia, sygnalizacja i handel. Trendy Pharmacol. Nauka. 22, 532–537 (2001).

Salahpour, A., Angers, S. i Bouvier, M. Funkcjonalne znaczenie oligomeryzacji receptorów sprzężonych z białkiem G. Trendy Endokrynol. Metab. 11, 163–168 (2000).

Galvez, T. i in. Allosteryczne interakcje między podjednostkami GB1 i GB2 są wymagane dla optymalnej funkcji receptora GABAB. EMBO J. 20, 2152–2159 (2001).

Nelson, G. i in. Receptor smaku aminokwasów. Natura 416, 199–202 (2002).

Nelson, G. i in. Receptory słodkiego smaku ssaków. Komórka 106, 381–390 (2001).

McLatchie, L.M. i in. RAMPs regulują transport i specyficzność ligandów receptora podobnego do receptora kalcytoniny. Natura 393, 333–339 (1998).

Kuwasako, K. i in. Wizualizacja receptora kalcytoniny podobnego do receptora i jego białek modyfikujących aktywność receptora podczas internalizacji i recyklingu. J. Biol. Chem. 275, 29602–29609 (2000).

Hilairet, S. i in. Promowana przez agonistę internalizacja trójskładnikowego kompleksu między receptorem podobnym do receptora kalcytoniny, białkiem modyfikującym aktywność receptora 1 (RAMP1) i β-arrestyną. J. Biol. Chem. 276, 42182–42190 (2001).

Dean, MK i in. Dimeryzacja receptorów sprzężonych z białkiem G. J. Med. Chem. 44, 4595–4614 (2001).

Gilman, A. Proszę sprawdzić EGO przy drzwiach. Mol. Interwencje 1, 14–21 (2001).

Brzostowski, JA i Kimmel, AR Sygnalizacja przy zerowej G: funkcje niezależne od białka G dla receptorów 7-TM. Trendy Biochem. Nauka. 26, 291–297 (2001).Przegląda niezależną od białka G sygnalizację przez receptory 7TM.

Zheng, B. i in. RGS-PX1, GAP dla GαS i sortowanie neksyny w handlu pęcherzykowym. Nauki ścisłe 294, 1939–1942 (2001).

Ma, Y.C. i in. Kinaza tyrozynowa Src jest nowym bezpośrednim efektorem białek G. Komórka 102, 635–646 (2000).

McLaughlin, SK, McKinnon, PJ & Margolskee, RF Gustducin jest białkiem G specyficznym dla komórek smakowych, blisko spokrewnionym z transducynami. Natura 357, 563–569 (1992).

Kwok-Keung Fung, B. & Stryer, L. Fotolizowana rodopsyna katalizuje wymianę GTP na związany GDP w zewnętrznych segmentach pręcika siatkówki. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 77, 2500–2504 (1980).

Meng, J., Glick, JL, Polakis, P. & Casey, PJ Funkcjonalna interakcja między Gαz i Rap1GAP sugeruje nową formę komórkowego przesłuchu. J. Biol. Chem. 274, 36663–36669 (1999).

Katada, T. i in. Hamujący składnik regulatorowy cyklazy adenylanowej wiążący nukleotydy guaninowe. Właściwości i funkcja oczyszczonego białka. J. Biol. Chem. 259, 3568–3577 (1984).

Bokoch, G.M. i in. Oczyszczanie i właściwości hamującego składnika regulatorowego cyklazy adenylanowej wiążącego nukleotydy guaninowe. J. Biol. Chem. 259, 3560–3567 (1984).

Chikumi, H. i in. Silna aktywacja RhoA przez receptory sprzężone z Gαq i Gq. J. Biol. Chem. 277, 27130–27134 (2002).

Booden, MA, Siderovski, DP & amp Der, C.J. Białaczka Związany z Rho czynnik wymiany nukleotydów guaninowych Rho promuje aktywację RhoA sprzężoną z Gαq. Mol. Komórka. Biol. 22, 4053–4061 (2002).

Smrcka, AV, Hepler, JR, Brown, KO & Sternweis, PC Regulacja aktywności fosfolipazy C specyficznej dla polifosfoinozytydu przez oczyszczoną Gq. Nauki ścisłe 251, 804–807 (1991).

Meigs, T.E., Fields, T.A., McKee, D.D. i Casey, P.J. Interakcja Gα12 i Gα13 z domeną cytoplazmatyczną kadheryny zapewnia mechanizm uwalniania β-kateniny. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 98, 519–524 (2001).

Kozasa, T. i in. p115 RhoGEF, białko aktywujące GTPazę dla Gα12 i Gα13. Nauki ścisłe 280, 2109–2111 (1998).

Boyer, JL, Waldo, GL & amp Harden, TK βγ-aktywacja podjednostki fosfolipazy C regulowanej przez białko G. J. Biol. Chem. 267, 25451–25456 (1992).

Obozy, M. i in. Selektywna wobec izoenzymów stymulacja fosfolipazy C-β2 przez podjednostki βγ białka G. Natura 360, 684–686 (1992).

Dzban, JA i in. Rola podjednostek βγ białek G w kierowaniu kinazy receptora β-adrenergicznego do receptorów związanych z błoną. Nauki ścisłe 257, 1264–1267 (1992).

Tang, WJ i Gilman, AG. Regulacja cyklazy adenylowej specyficznej dla typu przez podjednostki βγ białka G. Nauki ścisłe 254, 1500–1503 (1991).

Stephens, L. i in. Nowa aktywność kinazy fosfoinozytydowej 3 w komórkach pochodzenia szpikowego jest aktywowana przez podjednostki βγ białka G. Komórka 77, 83–93 (1994).

Logothetis, D.E. i in. Podjednostki βγ białek wiążących GTP aktywują muskarynowy kanał K+ w sercu. Natura 325, 321–326 (1987).Pierwsza demonstracja w systemie ssaków radykalnej ówczesnej idei, że dimery βγ białka G mogą bezpośrednio aktywować efektory.

Chen, C.K. i in. Nieprawidłowe fotoodpowiedzi i apoptoza indukowana światłem u pręcików pozbawionych kinazy rodopsyny. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 96, 3718–3722 (1999).

Jaber, M. i in. Istotna rola kinazy receptora β-adrenergicznego 1 w rozwoju i czynności serca. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 93, 12974–12979 (1996).

Rockman, H.A. i in. Ekspresja inhibitora kinazy receptora β-adrenergicznego 1 zapobiega rozwojowi niewydolności mięśnia sercowego u myszy ukierunkowanych na gen. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 95, 7000–7005 (1998).

Peppel, K. i in. Uszkodzenie genu kinazy receptora sprzężonego z białkiem G 3 (GRK3) prowadzi do utraty odczulania receptora węchowego. J. Biol. Chem. 272, 25425–25428 (1997).

Walker, J.K. i in. Zmienione reakcje dróg oddechowych i serca u myszy pozbawionych kinazy receptorowej sprzężonej z białkiem G 3. Jestem. J. Physiol. 276, R1214–R1221 (1999).

Gainetdinov, R.R. i in. Nadwrażliwość muskarynowa i upośledzona desensytyzacja receptora u myszy z niedoborem kinazy receptora sprzężonego z białkiem G. Neuron 24, 1029–1036 (1999).

Fong, A.M. i in. Wadliwa chemotaksja limfocytów u myszy z niedoborem β-arrestyny2 i GRK6. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 99, 7478–7483 (2002).

Conner, D.A. i in. Myszy z nokautem β-Arrestin1 wyglądają normalnie, ale wykazują zmienione odpowiedzi serca na stymulację β-adrenergiczną. Okr. Res. 81, 1021–1026 (1997).

Bohn, L.M. i in. Zwiększona analgezja morfinowa u myszy pozbawionych β-arrestyny ​​2. Nauki ścisłe 286, 2495–2498 (1999).

Bohn, L.M. i in. Odczulanie receptora μ-opioidowego przez β-arrestynę-2 określa tolerancję na morfinę, ale nie uzależnienie. Natura 408, 720–723 (2000).

Dohlman, HG & Thorner, JW Regulacja transdukcji sygnału zainicjowanej przez białko G u drożdży: paradygmaty i zasady. Annu. Ks. Biochem. 70, 703–754 (2001).


Rodzina docelowych receptorów sprzężonych z białkiem G 7 TM †

Ta recenzja pojawi się później jako rozdział w książce Biologia chemiczna — od małych cząsteczek do biologii systemów i projektowania leków (red.: S. Schreiber, T. Kapoor, G. Wess), Wiley-VCH, Weinheim, którego publikację zaplanowano na listopad 2006 r.

Abstrakcyjny

Podejścia biologii chemicznej mają długą historię w badaniu rodziny receptorów sprzężonych z białkami G (GPCR), która stanowi największą i najważniejszą grupę celów terapeutycznych. Analiza ludzkiego genomu ujawniła znaczną liczbę nowych członków o nieznanych funkcjach fizjologicznych, które są obecnie przedmiotem wielu programów odkrywania leków w farmakologii odwrotnej. Ponieważ siedem hydrofobowych segmentów transbłonowych stanowi wspólną cechę strukturalną tych receptorów i ponieważ sygnalizacja przez heterotrimeryczne białka G nie jest wykazywana we wszystkich przypadkach, białka te są również określane jako siedmiotransbłonowe (7TM) lub receptory serpentynowe. Niniejszy przegląd podsumowuje ważne historyczne kamienie milowe badań GPCR, od początku, kiedy farmakologia była głównie opisowa, do ery współczesnej biologii molekularnej, z klonowaniem pierwszego receptora, a teraz dostępnością całego ludzkiego repertuaru GPCR w sekwencji i białku. poziom. Pokazuje, w jaki sposób odkrycie leków kierowane przez GPCR początkowo opierało się na starannych testach kilku specjalnie wytworzonych związków chemicznych, a dziś jest realizowane za pomocą nowoczesnych metod odkrywania leków, w tym projektowania bibliotek kombinatorycznych, biologii strukturalnej, informatyki molekularnej i zaawansowanych technologii badań przesiewowych dla identyfikacja nowych związków, które specyficznie aktywują lub hamują GPCR. Takie związki, w połączeniu z innymi nowymi technologiami, pozwalają nam badać rolę receptorów w fizjologii i medycynie oraz, miejmy nadzieję, zaowocują nowymi terapiami. Przedstawiamy również, jak postępują podstawowe badania nad mechanizmami sygnalizacji i regulacji GPCR, prowadzące do odkrycia nowych białek oddziałujących z GPCR, a tym samym otwierające nowe perspektywy rozwoju leków. Praktyczne przykłady z badań nad ekspresją GPCR, HTS (przesiewowe badania wysokoprzepustowe) i projektowanie bibliotek kombinatorycznych związanych z monoaminą, skoncentrowanych na GPCR, ilustrują trwające badania biologii chemicznej GPCR. Na koniec przedstawiamy przyszły postęp, który może wiązać dzisiejsze odkrycia z opracowywaniem nowych leków.


Receptory sprzężone z białkiem G owadów i transdukcja sygnału

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są siedmiotransbłonowymi białkami (7-TM), które przekazują sygnały zewnątrzkomórkowe do komórkowych odpowiedzi fizjologicznych poprzez aktywację heterotrimerycznych białek wiążących nukleotydy guaninowe (podjednostki αβγ). Ich ogólne właściwości są wyjątkowo dobrze zachowane podczas ewolucji. Pomimo tego ogólnego podobieństwa, za pośrednictwem tej kategorii receptorów pośredniczy wiele różnych sygnałów. Several GPCR-(sub)families have an ancient origin that is situated before the divergence of Protostomian and Deuterostomian animals. Nevertheless, an enormous diversification has occurred since then. The availability of novel sequence information is growing very rapidly as a result of molecular cloning experiments and of metazoan genome (Caenorhabditis elegans, muszka owocowa, Homo sapiens) and EST (expressed sequence tags) sequencing projects. The Drosophila Genome Sequencing Project will certainly have an important impact on insect signal transduction and receptor research. In parallel, convenient expression systems and functional assay procedures will be needed to investigate insect receptor properties and to monitor the effects of natural and artificial ligands. The study of the evolutionary aspects of G protein–coupled receptors and of their signaling pathways will probably reveal insect-specific features. More insight into these features may result in novel methods and practical applications. Łuk. Biochem owadów. Physiol. 48:1–12, 2001. © 2001 Wiley-Liss, Inc.


Abstrakcyjny

Prostaglandins play a critical physiological role in both cardiovascular and immune systems, acting through their interactions with 9 prostanoid G protein-coupled receptors (GPCRs). These receptors are important therapeutic targets for a variety of diseases including arthritis, allergies, type 2 diabetes, and cancer. The DP prostaglandin receptor is of interest because it has unique structural and physiological properties. Most notably, DP does not have the 3–6 ionic lock common to Class A GPCRs. However, the lack of X-ray structures for any of the 9 prostaglandin GPCRs hampers the application of structure-based drug design methods to develop more selective and active medications to specific receptors. We predict here 3D structures for the DP prostaglandin GPCR, based on the GEnSeMBLE complete sampling with hierarchical scoring (CS-HS) methodology. This involves evaluating the energy of 13 trillion packings to finally select the best 20 that are stable enough to be relevant for binding to antagonists, agonists, and modulators. To validate the predicted structures, we predict the binding site for the Merck cyclopentanoindole (CPI) selective antagonist docked to DP. We find that the CPI binds vertically in the 1–2–7 binding pocket, interacting favorably with residues R310 7.40 and K76 2.54 with additional interactions with S313 7.43 , S316 7.46 , S19 1.35 , etc. This binding site differs significantly from that of antagonists to known Class A GPCRs where the ligand binds in the 3–4–5–6 region. We find that the predicted binding site leads to reasonable agreement with experimental Structure–Activity Relationship (SAR). We suggest additional mutation experiments including K76 2.54 , E129 3.49 , L123 3.43 , M270 6.40 , F274 6.44 to further validate the structure, function, and activation mechanism of receptors in the prostaglandin family. Our structures and binding sites are largely consistent and improve upon the predictions by Li et al. ( J. Am. Chem. Soc. 2007 , 129 (35), 10720) that used our earlier MembStruk prediction methodology.


Death Receptor Signaling Pathway

Death receptors are cell surface receptors that transmit apoptotic signals initiated by specific ligands and play a central role in instructive apoptosis. Death receptors belong to the tumor necrosis factor receptor (TNFR) gene superfamily. Eight members of the death receptor family have been characterized so far: TNFR1 (also known as DR1, CD120a, p55 and p60), CD95 (also known as DR2, APO-1 and Fas), DR3 (also known as APO-3, LARD, TRAMP and WSL1), TRAILR1 (also known as DR4 and APO-2), TRAILR2 (also known as DR5, KILLER and TRICK2), DR6, ectodysplasin A receptor (EDAR) and nerve growth factor receptor (NGFR). These death receptors are distinguished by a cytoplasmic region of

80 residues termed the death domain (DD). When these receptors are triggered by corresponding ligands, a number of molecules are recruited to the death domain and subsequently a signaling cascade is activated. Two types of death receptor signaling complex can be distinguished. The first group comprises the death-inducing signaling complexes (DISCs) that result in the activation of caspase-8, which plays the central role in transduction of the apoptotic signal. DISC is formed at the CD95 receptor, TRAILR1 or TRAILR2. The second group comprises the TNFR1, DR3, DR6 and EDAR. These recruit a different set of molecules, which transduce both apoptotic and survival signals.


The Molecular Basis of G Protein𠄼oupled Receptor Activation

G protein–coupled receptors (GPCRs) mediate the majority of cellular responses to external stimuli. Upon activation by a ligand, the receptor binds to a partner heterotrimeric G protein and promotes exchange of GTP for GDP, leading to dissociation of the G protein into α and βγ subunits that mediate downstream signals. GPCRs can also activate distinct signaling pathways through arrestins. Active states of GPCRs form by small rearrangements of the ligand-binding, or orthosteric, site that are amplified into larger conformational changes. Molecular understanding of the allosteric coupling between ligand binding and G protein or arrestin interaction is emerging from structures of several GPCRs crystallized in inactive and active states, spectroscopic data, and computer simulations. The coupling is loose, rather than concerted, and agonist binding does not fully stabilize the receptor in an active conformation. Distinct intermediates whose populations are shifted by ligands of different efficacies underlie the complex pharmacology of GPCRs.


WYNIKI

Β1AR Disrupts Kv11.1/14-3-3ε Association

Figure 1A shows that Kv11.1 coimmunoprecipitated with cotransfected 14-3-3ε, a result that is consistent with the report of Kagan i in. (2002). Interestingly, coexpression of β1ARwt disrupts the interaction, both in basal and Iso stimulated conditions. A detailed electrophysiological analysis of Kv11.1 currents upon Iso β1AR stimulation was performed in CHO cells stably expressing Kv11.1 channels cotransfected or not with the cDNA encoding β1ARwt. Figure 1, B and E, shows families of current traces for control conditions and after 10-min exposure to 1 nM Iso, obtained by applying 5-s pulses, imposed in 20-mV increments between −80 and +60 mV. The holding potential was fixed at −80 mV, and tail currents were recorded upon repolarization to −60 mV. In nontransfected cells (which express low levels of endogenous βAR, unpublished data), Iso accelerated the time course of activation but did not modify the maximum outward current and the time course of deactivation (n = 6 Figure 1B, Table 1). In cells expressing β1ARwt, Iso decreased both the outward and the tail current and accelerated the time course of the initial phase of deactivation, without modifying the time course of activation (n = 6 Figure 1E, Table 1). Panels C, F and D, G show the current-voltage plots of steady-state current at the end of the depolarizing step and the activation curves obtained in the presence and the absence of Iso in nontransfected (C and D) and in β1ARwt-transfected (F and G) cells. In nontransfected cells, Iso did not significantly modify either the steady state current or the slope of the activation curve (Figure 1, C and D), whereas it slightly shifted the midpoint of the activation curve to more negative potentials (Table 1). Such minor Iso-induced changes in channel activity in the absence of transfected β1AR appear to be not receptor-mediated, because it was also observed in the presence of 1 μM propranolol (unpublished data). In cells expressing β1ARwt Iso significantly decreased the current amplitude at −20 and −10 mV (Figure 1F) and the tail current amplitude after pulses between −20 and +60 mV (Figure 1G), without modifying the voltage dependence of activation (n = 6, p > 0.05 Table 1).

Figure 1. β1AR disrupts Kv11.1/14-3-3ε association and Iso inhibits Kv11.1 currents. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of β1ARwt. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed by using specific channel antibodies. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in Materiały i metody. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces obtained by applying 5-s pulses that were imposed in 20-mV increments between −80 mV and +60 mV. Deactivating Kv11.1 tail currents were recorded at −60 mV. Currents were obtained in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected (E) or not (B) with β1ARwt. (C and F) Mean Kv11.1 current-voltage relationship 5-s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated experimental conditions. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in the indicated conditions. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Table 1. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τF, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.

a p < 0.05 vs. data obtained in control conditions.

Β1AR Directly Interacts with 14-3-3ε

A possible explanation for the inhibition of Kv11.1/14-3-3ε interaction in the presence of β1AR may be a direct competition between Kv11.1 and β1AR for 14-3-3ε proteins. In this regard, in the third cytoplasmic loop and the C-terminal region of the β1AR there are PKA phosphorylation sites (Rapacciuolo i in., 2003 RRPSRLV and RPRASGCL, respectively) that exhibit certain homology with the consensus binding site of 14-3-3 proteins (Muslin i in., 1996 Yaffe i in., 1997). Therefore, we explored whether 14-3-3ε proteins bind to β1AR. To this end, HEK-293 cells were transiently transfected with tagged β1AR and 14-3-3ε constructs. Figure 2A shows that upon immunoprecipitation of β1AR, HA-tagged 14-3-3ε could be detected in the receptor complexes and that the presence of Iso promoted a marked increase in β1AR/14-3-3ε coimmunoprecipitation at 5 min of stimulation. These results suggest that activation of β1AR promotes conformational changes and/or triggers signaling pathways that facilitate the recruitment of 14-3-3 proteins to the receptor complex. The basal association of β1AR and 14-3-3ε in cotransfected cells is decreased upon incubation with the β-antagonist betaxolol (unpublished data), consistent with the idea that the reported basal β1AR activity associated with receptor overexpression (Engelhardt i in., 2001) also triggers to certain extent the mechanisms underlying the association. To more clearly visualize the modulation of β1AR/14-3-3 binding by different agents, cells were pretreated with betaxolol to lower such basal recruitment.

Figure 2. β1AR stimulation increases β1AR/14-3-3ε association in HEK-293 cells and guinea pig heart. (A) HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε and pretreated with betaxolol for 1 h were challenged with Iso, and the association between β1AR and 14-3-3 proteins was investigated by immunoprecipitation and Western blot analysis as detailed in Materiały i metody. Data indicate the amount of coprecipitated 14-3-3ε proteins, normalized by receptor immunoprecipitation and referred to association in basal (i.e., nonstimulated) conditions, and are mean ± SEM of four independent experiments. Representative gels are shown left. (B) Endogenous β1AR/14-3-3ε complexes are present in guinea pig heart extracts. After incubation of dissociated heart tissue with Iso 10 μM for the indicated periods of time, β1AR were partially purified from solubilized heart membrane extracts by affinity chromatography using alprenolol-Sepharose columns. After elution, fractions were assayed for the presence of receptor and 14-3-3ε proteins by Western blot using specific antibodies as detailed in Materiały i metody. In the case of the β1AR, two bands are apparent in some fractions likely due to different glycosylation patterns. Gels are representative of two independent experiments.

To validate this association in a more physiological setting, we searched for the occurrence of these molecular complexes in endogenous conditions. After exposure of guinea pig heart samples to Iso for different periods of time, β1AR were partially purified by affinity chromatography using the antagonist alprenolol. On elution of bound receptors and their associated proteins, fractions were analyzed for the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins by using specific antibodies. Figure 2B indicates that 14-3-3ε proteins coeluted with purified endogenous receptors and that such coelution is increased upon agonist stimulation. This result confirms that β1AR and 14-3-3ε proteins associate ”in situ“ in the heart in an agonist-dependent way.

Consistent with the idea that stimulation of the cAMP/PKA pathway is involved in triggering β1AR/14-3-3ε binding, their coimmunoprecipitation is rapidly promoted by incubating cells with forskolin, a well-known AC activator (Figure 3A). Conversely, both basal and agonist-induced association is blocked in the presence of the PKA inhibitor H-89 (Figure 3B), but not by protein kinase C or mitogen-activated protein kinase/ERK kinase (MEK) inhibitors (Ro-31-8220 and PD98059, respectively). Overall, these data clearly establish that PKA activity is directly or indirectly required for triggering the presence of β1AR and 14-3-3ε proteins in the same molecular complex.

Figure 3. The association between β1AR and 14-3-3 proteins is direct and dependent on PKA activity. HEK-293 cells transiently transfected with Flag β1AR and HA-14-3-3ε were stimulated with forskolin (A) or Iso in the absence or presence of the indicated protein kinase inhibitors (B). The receptors were then immunoprecipitated and the presence of 14-3-3ε proteins analyzed and quantitated as in Figure 1. Gels representative of three independent experiments are shown. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, A and B. (C) Phosphorylation of β1AR cytoplasmic domain by PKA. The indicated GST fusion protein, encompassing the third intracellular loop of the β1AR, or GST as a control was incubated with PKA as detailed in Material and Methods, resolved by electrophoresis and analyzed by Coomassie blue staining or autoradiography ( 32 P). (D) The β1AR GST fusion protein (or GST as a control) was incubated in the absence or presence of PKA as in C. After washing, the GST proteins were incubated for 3 h in the presence of purified GST 14-3-3ε, and association to the latter protein was analyzed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies or a nonrelated IgG as a control. The immunoprecipitates were resolved by electrophoresis and blotted with 14-3-3ε or anti-GST antibodies to detect β1AR fusion protein, migration of which (including a GST-3il-β1AR proteolytic fragment) is shown with asterisks. Results are representative of two independent experiments.

To test if PKA phosphorylated β1AR would directly recruit 14-3-3 proteins, we next performed in vitro assays with purified 14-3-3ε and a β1AR cytoplasmic domain fusion protein. As shown in Figure 3C, a GST-fusion protein encompassing the third intracellular loop of the β1AR (GST-3il-β1AR) was readily phosphorylated in the presence of purified PKA. The GST-β1AR construct were subsequently incubated with purified GST-14-3-3ε, followed by immunoprecipitation with specific 14-3-3ε antibodies (or control nonrelated antibodies). Figure 3D shows a robust, specific interaction of 14-3-3ε with GST-3il-β1AR in a PKA phosphorylation–dependent way.

Mutation of PKA Phosphorylation Sites Renders β1AR Unable To Associate to 14-3-3ε and To Compete Its Interaction with Kv11.1

Overall, these results demonstrated a direct interaction between 14-3-3ε and PKA-phosphorylated β1AR. To further explore this point, we generated different β1AR mutants (β1ARS312A, β1ARS412A, and the double mutant β1ARS312,412A) in which serine residues 312 and 412 were substituted for alanines, a modification reported to prevent their phosphorylation by PKA upon receptor stimulation (Rapacciuolo i in., 2003). All these receptor constructs showed a similar pattern of adenylyl cyclase stimulation upon expression of comparable levels in HEK-293 cells and challenge with Iso (see Supplementary Figure S1). Despite such efficient activation of the cAMP signaling pathway, the ability of these mutants to associate to cotransfected 14-3-3ε isoforms, both in basal and agonist-stimulated conditions is completely lost in the double mutant β1ARS312,412A (Figure 4A) or markedly decreased for the individual mutants (Figure 4B), in comparison with β1ARwt. These results clearly indicate that PKA phosphorylation of the β1AR at these residues is required for the association of 14-3-3 proteins. In contrast, mutation of S312 to aspartate, which would mimic receptor phosphorylation, leads to an increased β1AR/14-3-3ε interaction even in basal conditions (Figure 4C).

Figure 4. Mutation of residues critical for PKA-mediated phosphorylation render β1AR unable to associate to 14-3-3ε proteins. HEK-293 cells were transiently transfected with HA-tagged 14-3-3ε and different Flag-tagged β1AR constructs. Cells were stimulated with Iso (10 μM) for the time indicated, and the association between the different receptors and 14-3-3ε proteins assessed as in previous figures. Gels are representative of 3–4 independent experiments. The fold-stimulation of β1AR/14-3-3ε association in each experimental setting with respect to the wild-type receptor in basal conditions, normalized by the amount of β1AR present in the immunoprecipitates, is shown in Supplementary Figure 3, C–E.

Β1ARwt and Mutants Unable To Interact with 14-3-3ε Display a Different Pattern of Modulation of Kv11.1

Our data suggested that β1AR stimulation would sequentially lead to PKA activation, receptor phosphorylation, and recruitment of 14-3-3ε proteins to the complex, which would displace these molecules from their binding sites in Kv11.1 channels. To explore this hypothesis, we tested whether the presence of β1AR mutants, differing in their ability to recruit 14-3-3ε, had different effects on the interaction between Kv11.1 and 14-3-3ε.

In contrast to the disruption of binding observed with β1ARwt, the Kv11.1/14-3-3ε association is preserved upon expression of similar levels of β1ARS312,412A (Figure 5A). In this case the presence of Iso leads to an enhanced association, in agreement with the expected increase in PKA-phosphorylated Kv11.1. Consistently, the β1ARS312A mutant, which barely displays association with 14-3-3, is also unable to disrupt the Kv11.1/14-3-3 binding, whereas β1AR S312D markedly inhibits Kv11.1/14-3-3 coimmunoprecipitation, as the β1ARwt does (Figure 5A, right panel).

Figure 5. Modulation of Kv11.1/14-3-3ε interaction and Kv11.1 currents by expression of different β1AR mutants. (A) HEK-293 cells were cotransfected with Kv11.1 and HA-14-3-3ε in the absence or presence of the indicated β1AR constructs. After stimulation or not with Iso (10 μM) for 5 min, the presence of Kv11.1 in HA-14-3-3 immunoprecipitates was assessed as in Figure 1A. The expression levels of the different proteins in cell lysates were analyzed by immunoblot analysis as detailed in Materiały i metody. Results are representative of three independent experiments. (B and E) Kv11.1 current traces were obtained and analyzed as detailed in Figure 1 in the absence and the presence of 1 nM Iso in cells transfected with β1ARS312,412A or β1ARS312D as indicated. (C and F) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. (D and G) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso in cells transfected with the indicated receptor constructs. Each point represents the mean of ≥6 experiments and *p < 0.05 versus control.

Interestingly, in cells expressing β1ARS312,412A (Figure 5B) Iso increased the maximum outward current and accelerated the time course of activation but did not modify the time course of deactivation (Table 1). In contrast to the results obtained with β1ARwt (see Figure 1, E–G), Iso significantly increased the maximum outward current amplitude at negative potentials (Figure 5C) and markedly shifted the voltage-dependence of activation (Figure 5D), which may explain the increase in the tail and maximum outward currents observed at negative potentials (n = 6–9 p < 0.05 vs. control Table 1). It should be stressed that in cells expressing β1ARS312A or β1AR S412A the effects produced by Iso on current amplitude, as well as on the time- and voltage-dependent properties of the channels, were almost identical to those produced in cell expressing β1ARS312,S412A (Table 1). On the contrary, in cells expressing the β1ARS312D mutant (Figure 5, E–G), Iso accelerated the time course of the initial phase of deactivation (Table 1) and decreased the maximum outward current at potentials between −20 and +20 mV and the tail current elicited by applying pulses positive to −30 mV, without modifying the voltage-dependence of the activation (Figure 5G and Table 1), a situation reminiscent of the effects observed in cells expressing β1ARwt (Figure 1, E–G).

To better compare the effects induced by Iso, in Figures 6, I–K the percentages of change in the maximum outward current that elicited at −20 mV and in the amplitude of tail currents elicited after pulses to +60 mV or to −20 mV are shown. In cells expressing β1ARWt or β1ARS312D, Iso decreased the current amplitude at −20 mV by 19.9 ± 5.4% (n = 6) and by 23.5 ± 1.8% (n = 7), respectively (panel I), whereas in cells not transfected with β1AR, Iso increased the current by 13.9 ± 3.2% (n = 6). In cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A, Iso markedly increased the current amplitude (n = 6–9, p < 0.05 vs. increase in nontransfected cells panel I). In cells expressing β1ARwt or β1ARS312D, Iso inhibited the tail current after pulses to + 60 mV (panel J) by 30.1 ± 5.3 and 32.1 ± 12.3%, respectively. In contrast, the reduction of the tail currents induced by Iso in nontransfected cells and in cells expressing β1ARS312A, β1ARS412A, or β1ARS312,412A was significantly lower (p < 0.01, n = 6–9 panel J). Moreover, in these mutants again in contrast to the ≈20% inhibition observed in cells expressing β1ARwt or S312D, Iso significantly increased the tail current amplitude after pulses to −20 mV (n = 6–9 Figure 6K).

Figure 6. The differential effect of Iso on Kv11.1 currents mediated by β1ARwt or β1AR S312,412A is abolished in the presence of 14-3-3 inhibitors. (A, C, E, and G) Mean Kv11.1 current–voltage relationship 5 s isochronal in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1AR wt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (A and C) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (E and G). (B, D, F, and H) Mean Kv11.1 activation curves in the absence and presence of 1 nM Iso for cells transfected with β1ARwt or β1ARS312,412A in the presence of R18 (B and D) or in cells cotransfected with DN14-3-3 mutant (F and H). (I–K) Percentage of change induced by 1 nM Iso in the different conditions in the amplitude of Kv11.1 currents elicited after 5-s pulses to −20 mV (I) and tail currents elicited on repolarization to −60 mV after 5-s pulses to +60 mV (J) and −20 mV (K). In I *p < 0.05 versus Kv11.1. In J, *p <0.05 versus data obtained in β1ARwt transfected cells, # p < 0.05 versus data obtained in β1ARS312,S412A-transfected cells. Each point or bar represents the mean ± SEM of ≥6 experiments.

To confirm that 14-3-3 proteins are involved in these differential effects of the β1AR phosphorylation deficient mutants on Kv11.1 current modulation, we next performed similar experiments in conditions where endogenous 14-3-3 function was inhibited. We first studied the effects of Iso in the presence of R-18 (200 nM), an unphosphorylated peptide that binds to all 14-3-3 isoforms with equal affinities producing a competitive inhibition (Wang i in., 1999). Because it can be presumed that the membrane diffusion of R-18 would be limited, this inhibitor was added to the internal solution that dialyzed the cells when the patch seals were broken. Kv11.1 currents recorded in R-18 dialyzed cells were of similar amplitude to those recorded in not dialyzed cells (p > 0.05) and exhibited the same time- and voltage-dependent properties. Interestingly, under these conditions, the differential effects produced by Iso on Kv11.1 currents in β1ARwt- and β1ARS312,412A-transfected cells were not observed. Iso similarly inhibited the maximum outward current elicited in cells expressing either β1ARwt or β1ARS312,S412A (Figure 6, A and C), as well as the tail currents elicited on return to −60 mV (Figure 6, B and D). Furthermore, Iso did not modify either the time course of channel activation and deactivation, or the voltage-dependence of activation (Table 2). Similar results were obtained when a different strategy of inhibition of 14-3-3 function based on cotransfection with a DN14-3-3 mutant was used (Figure 6, E–H, and Table 2). The effects of Iso on Kv11.1 channels in cells expressing β1AR wt or β1ARS312,S412A in the presence of 14-3-3 inhibitors, were qualitatively identical and not quantitatively different to those produced in cells expressing β1ARwt in the absence of inhibitors.

Table 2. Effects of 1 nM Iso on the time course of activation, fast phase of deactivation, and voltage-dependence of activation of Kv11.1 currents recorded in CHO cells

τ, time constant of current activation at 0 mV τF, time constant of the fast phase of tail current deactivation, recorded after pulses to +60 mV Vh, midpoint of the activation curve k, slope of the activation curve.


Obejrzyj wideo: Ile jeść białka na ketozie? Ile jeść węglowodanów na diecie ketogenicznej? E03SOSK (Sierpień 2022).