Informacja

C12. Darmowa energia i kooperatywność - Biologia

C12. Darmowa energia i kooperatywność - Biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

(świetny przykład wykorzystania cykli termodynamicznych we współczesnej analizie biochemicznej)

Zmiana konformacji deoksyHb na oxyHb wymaga energii (około 6 kcal/mol lub odpowiednik około 2 wiązań H. Pamiętaj z naszej dyskusji na temat stabilności białek, białka z natury nie są aż tak stabilne. Denaturują w umiarkowanych temperaturach i są ustabilizowane ponad stan natywny tylko około 10 kcal/mol dla typowego białka składającego się ze 100 aminokwasów. Zmiany energii w białkach mogą wynikać z wiązania liganda lub trzecio-/czwartorzędowych zmian strukturalnych w białku. Rozważ następujące ważne punkty dotyczące wiązania O2.

  • łańcuch beta Hb wiąże O2 niekooperatywnie, z Kd podobną do Mb.
  • tetramer hemoglobiny (T) łatwo dysocjuje na dimery alfa-beta (D), które również wiążą O2 z wysokim powinowactwem i nie współpracując.

Stąd, gdy 2D ----> T, występuje kara energetyczna w postaci znacznie zmniejszonego powinowactwa O2, ale nabywana jest właściwość kooperacji wiązania O2, która ułatwia maksymalne rozładowanie O2 w warunkach fizjologicznych. Tę kooperatywność można zmierzyć jako ΔGcoop = ΔGc, gdzie
ΔGc = ΔGO2 wiąże się z tetramerem - ΔGO2 wiąże się z tym samym miejscem na dimerze, lub
ΔGc = ΔGT - ΔGD. ΔGT i ΔGD można określić na podstawie izoterm wiązania (Y vs [O2] przy różnych rozcieńczeniach tetrameru). Następnie można obliczyć ΔGc. Wyniki przedstawiono poniżej.

Powyższe tabele pokazują ΔGc dla wiązania tlenu z różnymi stanami Hb. Zauważ, że ΔGc jest dodatnia dla pierwszych 3 wiązań i ujemna dla ostatniego.

Modele kooperatywności dla wiązania tlen-Hb (model MWC-koncertowany i model KNF-sekwencyjny) są oparte na dwóch stanach końcowych (w pełni zligowany i całkowicie niezligowany) oraz stanach stopniowych (1, 2 lub 3 wiązanie O2). Nie opisują wiązania do określonych miejsc na tetramerze Hb. Oznacza to, że nie odzwierciedlają różnych możliwych mikrostanów. Na przykład, możliwe są 4 różne mikrostany, w których 2 O2 jest związane z tetramerem (patrz Tabela 1). Istnieje 8 różnych możliwych częściowo ligandowanych mikrostanów (tabela 1). Bezpośrednie badanie każdego z tych mikrostanów było trudne, ponieważ niemożliwe jest wyizolowanie ich w czystej postaci lub ustalenie ich różnych właściwości w mieszaninie. Dzieje się tak z trzech powodów:

  • każdy stan jest niestabilny, a wymiana O2 między stanami
  • tetramer (T) dysocjuje do 2D, który ponownie asocjuje dając hybrydy.
  • niższa względna obfitość półproduktów w systemie kooperacyjnym.

Ten problem został rozwiązany przez zastosowanie CO, NO i CN jako ligandów, ponieważ wiążą się one ściślej. Również Fe można zastąpić Co(II) lub Mn (III). Równowagę sprzężoną badaliśmy już wcześniej:

  • 2 monomery N-metyloacetamidowe (roztwór wodny) ---> dimer z wiązaniem wodorowym N-metyloacetamidu (niepolarny)
  • deoksyHb <---> oxyHb w obecności H+ i CO2 (patrz wyżej)

Widzieliśmy, zwłaszcza w pierwszym przypadku, jak cykle termodynamiczne lub powiązane równowagi mogą być użyte do obliczenia ΔG i K's dla reakcji, które byłyby trudne do przeprowadzenia. Zastosujmy teraz te koncepcje do wiązania Hb z ligandami. W szczególności, chcemy obliczyć ΔGc z ΔGs dla wiązania liganda do określonego miejsca na dimerze i tetramerze, jak pokazano poniżej.

Powinno być oczywiste, że:

ΔGo1 + ΔGo2 = ΔGo3 + ΔGo4 lub ΔGo3 - ΔGo1 = ΔGo2 - ΔGo4 = ΔGoc . Nie jest trudno określić ΔGo3 - ΔGo1, które można określić za pomocą chromatografii żelowej, ponieważ dimery można łatwo oddzielić od tetramerów. Można opracować metody przygotowania poszczególnych mikrostanów, a następnie wyznaczyć energię swobodną montażu. Z tego, używając cykli termodynamicznych, można obliczyć ΔGoc. Wyniki dla mikrostanów Cyanomet Hb przedstawiono w Tabeli 2. 10 mikrostanów podzielono na 3 różne kooperatywne wartości energii swobodnej. Sugeruje to, że może być problem z modelem MWC, który proponuje 2 stany czwartorzędowe, T i R. Czy istnieje trzeci stan czwartorzędowy, czy też istnieje zmiana w trzeciorzędowej strukturze stanów R lub T, które generują 3 kcal /mol spółdzielczej darmowej energii? Jeśli niezligowany stan „dezoksy” jest stanem T, a mikrostany 11,12 i 21 są również przypisane do stanu T, wtedy przejście T->R występuje, gdy wiązanie tworzy tetramer z 1 lub większą liczbą zligowanych podjednostek po każdej stronie interfejsu dimer/dimer.

Całkowita ΔGc jest generowana przez dwie różne zmiany konformacyjne. Po związaniu pierwszego liganda w zligowanym stanie dimerycznym zachodzą globalne zmiany konformacyjne. Interfejs D/D działa jako ograniczenie strukturalne, przeciwko któremu zmienia się struktura trzeciorzędowa. Gdy tlen wiąże się z zdysocjowanym dimerem, nie powoduje zmiany struktury trzeciorzędowej, ponieważ nie ma interfejsu przeciwstawiającego się ligandowi. Ta naprężona konformacja trzeciorzędowa podnosi energię o +3 kcal/mol. Druga zmiana konformacyjna powoduje globalną zmianę czwartorzędową, gdy mostki solne pękają, a stan T zmienia się w stan R.

Tworzenie i uwalnianie trzeciorzędowego ograniczenia jest siłą napędową kooperacyjnego wiązania liganda. Siła granicy T jest pokonana tylko wtedy, gdy w obu dimerach wystąpią niekorzystne zmiany konformacyjne indukowane ligandem. Interfejs T może wytrzymać 1 dimer ze zmienioną trzeciorzędową konformacją, a nie 2. Ruch Fe do płaszczyzny pierścienia hemu wyzwala trzeciorzędową zmianę. Wyzwalaczem czwartorzędowej zmiany są trzeciorzędowe zmiany w dimerach.

Teraz, gdy rozumiesz wiązanie ditlenowe, wyjaśnij poniższy rysunek.


Termodynamiczne rozwarstwienie oddziaływań receptora progesteronowego w promotorze wirusa raka sutka u myszy: wiązanie monomerów i silna kooperacja dominują w reakcji składania ☆

Receptory progesteronu (PR) odgrywają kluczową rolę w regulacji genów eukariotycznych, jednak mechanizmy, dzięki którym gromadzą się na swoich promotorach, są słabo poznane. Jednym z niewielu promotorów, które można poddać analizie, jest sekwencja regulatorowa genu mysiego wirusa nowotworu sutka. W obrębie tej sekwencji osadzone są cztery elementy odpowiedzi na progesteron (PRE) odpowiadające palindromicznemu PRE i trzem półmiejscowym PRE. Wczesne badania mutacyjne wykazały, że obecność wszystkich czterech miejsc generowała synergiczną i silną odpowiedź transkrypcyjną. Jednak analizy wiązania DNA sugerowały, że montaż receptora na promotorze zachodził przy braku znaczącej kooperacji. Podsumowując, wyniki wskazują, że interakcje kooperacyjne między PRE nie mogą wyjaśnić obserwowanej synergii funkcjonalnej. W szerszym ujęciu, badania podniosły pytanie, czy kooperatywność jest powszechną cechą regulacji genów za pośrednictwem PR. Jako krok w kierunku uzyskania ilościowego, a tym samym predykcyjnego zrozumienia funkcji receptora, przeprowadziliśmy termodynamiczną analizę oddziaływań PR A-izoforma na promotorze wirusa mysiego nowotworu sutka. Wykorzystując analityczne ultrawirowanie i ilościowe ślady, rozwiązaliśmy mikroskopijną energetykę wiązania izoformy PR A, w tym warunki kooperacyjności. Nasze wyniki ujawniają model sprzeczny z modelem wywnioskowanym z poprzednich badań biochemicznych. W szczególności jednostka wiążąca w połowie miejsca nie jest dimerem receptora, ale zamiast tego monomerem monomeru związanym w miejscach połowicznych są zdolne do znaczących interakcji kooperacyjnych w parach, aby wspólnie zaangażować dimer związany z palindromem, wymagana jest zajętość wszystkich trzech miejsc połówkowych wreszcie zgromadzeniu towarzyszą duże niekorzystne siły. Ogólnie rzecz biorąc, wiązanie monomeru odpowiada za większość wewnętrznej energetyki wiązania, a kooperacja przyczynia się do około 1000-krotnego wzrostu stabilności receptora-promotora. Wreszcie podział spółdzielczości sugeruje ramy dla interpretacji in vivo synergia transkrypcyjna. Wyniki te podkreślają wgląd dostępny w rygorystycznej analizie i pokazują, że interakcje między receptorem a promotorem są znacznie bardziej złożone, niż się to zwykle przewiduje.


Wyniki

Mutacja OL3 blokuje represję CI PRM

W modelu pokazanym na rysunku 1D, CI wiąże się z Or3, a co za tym idzie represje PRM, jest wzmocniony przez współdziałanie z CI związanym w OL3. Aby to przetestować, wyeliminowaliśmy wiązanie CI do OL3 zmieniając cztery pary zasad w operatorze (utworzenie OL3-4 mutacje). Przewidywany wpływ zmian na wiązanie CI to ΔΔg +10.3 kcal/mol (Sarai i Takeda 1989).

ten OLDo chromosomu wprowadzono 3-4 mutacje PRM konstrukcja reporterowa pokazana na rysunku 2, w której OL (OL1.OL2.OL3) znajduje się poniżej lacZ wyrażona pod kontrolą PRM.Or (Or3.Or2.Or1). Ten PRM.lacZ konstrukt fuzyjny zawiera region od +62 do -123 PRM z OL-Or rozstaw 3,8 kb. Zakres stężeń CI dostarczono reporterom z plazmidu, który kierował syntezą CI pod kontrolą promotora indukowanego przez IPTG. Poziomy CI w stosunku do tych w lizogenie λ typu dzikiego (jednostki lizogeniczne typu dzikiego, WLU) zostały określone wcześniej (Dodd et al. 2001).

OL3 jest potrzebne do skutecznego stłumienia CI PRM ale nie Pr. Działalność PRM::lacZ (A) oraz Pr::lacZ (b) fuzje operonów w zakresie stężeń CI (w jednostkach lizogenicznych typu dzikiego, WLU) dostarczonych przy użyciu plazmidów pZC320cI i pUHA1 (zapewniając gumilaka represor) z IPTG (0 do 200 μM). ten wt PRM Przedstawiono fuzję reporterową (A) w Pr reporterzy orientacja Or fragment jest odwrócony. Każdy reporter niósł trzech operatorów w Or to były wt z wyjątkiem Or3-r1 PRM::lacZ fuzja (Or3-r1). Poniżej lacZ albo nie było sekwencji λ (nie OL) lub 70-bp wt OL1.OL2.OL3 fragment (wt) lub niosący OL3-4 mutacje (OL3-4). Wstawka w (b) rozwija skrajną prawą część Pr wykres. Słupki błędów wskazują 95% granice ufności (n > 5).

Kiedy OL3 i Or3 były nienaruszone, PRM był aktywowany przy niskich stężeniach CI, ale został stłumiony przy wyższych stężeniach CI (ryc. 2A). Zgodnie z oczekiwaniami represje zostały utracone, gdy Or3 niosło r1 mutacja lub kiedy OL nie był obecny (Dodd i wsp. 2001). (Jak widać wcześniej, maksymalna PRM aktywacja była 35% większa przy braku OL niż w jego obecności. Wydaje się, że tworzenie oktameru nieznacznie hamuje zdolność dimeru CI związanego w Or2, aby aktywować PRM). represje CI PRM został również zniesiony przez OL3-4 mutacje. Więc OLMiejsce wiązania 3 CI, położone 3,8 kb od PRM, było konieczne do represji PRM przez fizjologiczne poziomy CI.

OL3 nie jest potrzebne do stłumienia CI Pr

Wyniki te wspierają ideę specyficznej interakcji między OL3 i Or3 za represję CI z PRM. Jednak alternatywną możliwością jest to, że dimer CI przy OL3 odgrywa bardziej pośrednią rolę w ułatwianiu PRM represje, na przykład poprzez interakcję z dimerem CI związanym w Or1, umożliwiając w ten sposób dimer CI związany w Or2 do współpracy z dimerem związanym w Or3. Zbadaliśmy możliwość, że dimer CI związany w OL3 oddziałuje z CI związanym w Or1 lub Or2, sprawdzając, czy OLMutacja 3-4 zakłócała ​​represję CI Pr.

ten Or fragment w konstrukcie reporterowym z Figury 2A został odwrócony tak, że lacZ został wyrażony z Pr (fragment wynosi od +42 do -143 z Pr). Testy w obecności różnych stężeń CI wykazały, że tłumienie CI Pr był najbardziej wydajny, gdy typ dziki OL był obecny (ryc. 2B). Usunięcie OL osłabienie represji nawet czterokrotnie, w zależności od stężenia CI, zgodnie z ustaleniami Réveta i in. (1999). Jednakże OL3-4 mutacje osłabiły represję Pr tylko nieznacznie, co wskazuje, że OL-Or pętla nie została przerwana.

Wyniki te pokazują, że pomimo wiązania CI w OL3 krytyczne dla represji PRM, nie przyczynia się silnie do OL-Or interakcji, wspierając ideę określonej interakcji między OL3 i Or3.

Całe badania fagowe – rola OL3 w autoregulacji CI i indukcji profagów

Funkcja OL3 w rozwoju λ było zagadką, ponieważ powiązanie CI lub Cro z tym operatorem nie powinno wpływać PL aktywność (Johnson i in. 1981). Nasze wyniki wykazują potrzebę OL3 w represje CI z PRM teraz zaproponuj rolę dla OL3, ponieważ represje PRM jest niezbędny do skutecznego przejścia do rozwoju litycznego w odpowiedzi na UV (tj. indukcja profagów Dodd i wsp. 2001). Aby przetestować, czy nie OL3 faktycznie ułatwia indukcję profagowania, OLDo dzikiego typu λ wprowadzono 3-4 mutacje, aby uzyskać λOL3-4. Mutacja nie miała wykrywalnego wpływu na morfologię łysinek lub kinetykę wytwarzania fagów po infekcji (dane nie pokazane). Zmierzyliśmy poziomy CI w monolizogenach NK7049 λr1 (nosi Or3-r1 mutacja) i λOL3-4 stosując nasz test przesunięcia mobilności w żelu dla aktywności wiązania DNA CI (Dodd i wsp. 2001). Połączenie tych i poprzednich wyników testu przesunięcia żelu dało szacunkowe poziomy CI 2,8 WLU (95% granic ufności: 2,51-2,99, n = 5) i 3,0 WLU (95% granic ufności: 2,94-3,14, n = 4) dla λr1 i λOLOdpowiednio 3-4 lizogeny. Więc OL3-4 i Or3-r1 każda z mutacji powodowała podobny wzrost stężenia lizogennego CI, potwierdzając, że OL3 jest potrzebne do stłumienia CI PRM w rodzimym kontekście λ.

Następnie porównaliśmy indukowalność UV profagów typu dzikiego i zmutowanych przez pomiar frakcji indukowanych lizogenów w porównaniu z dawką UV (Dodd i wsp. 2001). λOLlizogen 3-4 wykazywał defekt w indukcji profagów bardzo podobny do λr1 lizogen, z tylko 25%-33% indukowanych lizogenów w porównaniu z kontrolą typu dzikiego przy trzech różnych dawkach UV (dane nie pokazane). Ta wada jest prawdopodobnie spowodowana wysokim poziomem CI w lizogenach. Możliwe, że OLMutacja 3-4 działała w jakiś sposób poprzez wpływ na PL lub jego regulacja, ale znaleźliśmy przy użyciu PL.lacZ reporterzy, że podstawowa aktywność i represywność IK PL nie zostały znacząco dotknięte przez OL3-4 mutacje (dane nie pokazane).

W związku z tym nasze wyniki wyjaśniają zachowanie trzeciego operatora przy OL, wskazując, że podstawową rolę OL3 jest zapewnienie autoregulacji ujemnej CI w celu ograniczenia stężenia CI w stanie lizogennym i umożliwienia skutecznego przejścia do rozwoju litycznego.

Lokalizowanie CI CTD w OL3 wystarczy, aby ułatwić represję PRM

Zgodnie z naszym modelem, rola OL3 cale PRM represja polega na zlokalizowaniu CTD dimeru w celu kontaktu z CTD dimeru CI związanego w Or3 (rys. 1D). Hybrydowy represor P22-λ Whipple et al. (1994) niesie wiążące DNA NTD represora P22 (reszty 1-94) połączone w regionie łącznika z CTD represora λ typu dzikiego (wt) (reszty 112-236). To białko hybrydowe jest funkcjonalne do wiązania się z operatorami P22 i do współdziałania z dimerami tego samego typu iz dimerami represora λ (Whipple i wsp. 1994). W związku z tym przewidzieliśmy, że ten represor hybrydowy będzie w stanie funkcjonalnie zastąpić wt λ CI, jeśli zostanie związany z DNA w pozycji OL3.

Aby przetestować tę prognozę, wymieniliśmy OL3 na chromosomie PRM konstruuje reporter z P22 Or1 operator (Poteete i wsp. 1980). Operatory λ mają długość 17 pz, a odstęp między środkami wynosi OL2 i OL3 to 20 pb w zamianie, odstęp między OL2, a 18-pz operator P22 wynosił 20,5 pz. Hybrydowy represor P22-λ dostarczono tym reporterom z plazmidu, który kieruje syntezą ilości odpowiadającej około 10 wartości lizogenu represora λ. Poziom lizogeniczny represora wt λ był dostarczany we wszystkich przypadkach z profagu λ (λat80) zintegrowany w miejscu mocowania ϕ80. Ponadto, ponieważ fagi reporterowe niosą region odporności faga 21 (imm21), represor faga 21 był również obecny. Fagi P22 i 21 są homo-odporne, represor P22 może wiązać się z operatorami faga 21, a represor 21 z operatorami P22 (Ballivet i wsp. 1977, 1978), a Or1 operatory tych fagów są identyczni (Poteete i wsp. 1980).

Represje PRM został zmierzony jako PRM-r1 Aktywność LacZ (= nierepresjonowana) podzielona przez aktywność wt PRM. W przypadku braku represora hybrydowego i z wt OL3, PRM został stłumiony 2,5-krotnie (ryc. 3, wiersz 1). Zgodnie z oczekiwaniami, wymiana λOL3 z operatorem P22 zapobiegły temu represjom PRM przez represor λ (rys. 3, wiersz 4). (Zauważ, że w przypadku braku represji a PRM Wartość „represji” 1,1 jest uzyskiwana, ponieważ r1 mutacja poprawia PRM aktywność o około 10% Dodd et al. 2001). Ponieważ spodziewamy się, że rezydent, reporter, represor 21, zajmie OL3 miejsce w tym konstrukcie, wynik ten wskazuje, że represje PRM nie jest wzmacniany przez wiązanie jakiegokolwiek białka w OL3 pozycja. Przywrócono obecność represora hybrydowego PRM represje w przypadku konstrukcji reporterowej z operatorem P22 na stanowisku OL3 (2,3-krotna represja Ryc. 3, wiersz 5), zgodnie z koncepcją, że hybrydowy dimer represorowy jest w stanie wiązać się z operatorem P22 za pomocą swoich P22 NTD i jednocześnie kontaktować się z dimerem λ CI związanym w Or3 za pomocą swoich λ CTD (schemat na ryc. 3). Represja była prawie tak silna jak w natywnej sytuacji λ (ryc. 3, wiersz 1), co wskazuje, że stężenie lizogeniczne represora 21 nie konkuruje znacząco z represorem hybrydowym o wartości lizogenu ∼10 o wiązanie z operatorem P22 w OL3.

CI CTD w OL3 pomagają w represjach PRM. Konstrukty reporterowe były takie jak na rys. 2, z tym wyjątkiem, że w niektórych przypadkach λ OLOperator 3 został zastąpiony przez P22 Or1 operator (szare pudełko). Rysunek przedstawia interakcje oczekiwane dla linii 5. Represor λ był zasilany z λat80 profag, a represor ϕ21 pochodził z λimm21 reporter sam się przepowiada. Represor hybrydowy P22-λ (około 10 WLU) dostarczono (lub nie) z plazmidu pFW7-280Δ (lub plazmidu rodzicielskiego pLR1ΔcI) z 5 μM IPTG. Hybrydowy represor P22-λ niosący podstawienie D197G dostarczono z pFW7-280Δ D197G, pochodnej pFW7-280Δ. Plazmid pAD325 był źródłem gumilaka represor. PRM wartości represji oblicza się dzieląc PRM lacZ jednostki dla reporterów przewożących r1 mutacja w Or3 (niepowstrzymane) przez jednostki dla reporterów, gdzie Or3 to wag. Pokazano średnie wyniki podwójnych testów przeprowadzonych w pojedynczym reprezentatywnym eksperymencie. Komórki zawierające pFW7-280Δ (kodujący represor hybrydowy) lub pLR1ΔcI (kodujący brak represora) były badane cztery razy z podobnymi wynikami, a komórki zawierające pFW7-280Δ D197G były testowane dwa razy z podobnymi wynikami.

Ten eksperyment pokazuje, że represje PRM nie wymaga określonej sekwencji DNA w OL3 lub konkretna domena wiążąca DNA związana w OL3. Zamiast tego skuteczne tłumienie można osiągnąć po prostu przez przywiązanie pary λ CI CTD w OL3 dla interakcji z CTD dimeru CI związanego w Or3.

Rysunek 2 pokazuje, że represje PRM zaginął, kiedy albo Or3 lub OL3 został zmutowany, aby zapobiec wiązaniu CI. Dane na wykresie 3 pokazują, że podobna utrata represji występuje, gdy obaj Or3 i OL3 są zmutowane, co wskazuje, że te dwie mutacje nie działają niezależnie, ale raczej zakłócają ten sam mechanizm represyjny. ten PRM działalność OL3-P22 Or3-r1 podwójny mutant (857 jednostek, ryc. 3, wiersz 4) był podobny do aktywności obserwowanej w przypadku pojedynczego mutanta (ryc. 3, wiersz 1, OL3 + Or3-r1 = 771 jednostek linia 4, OL3-P22 Or3 + = 798 jednostek).

Chcieliśmy przetestować wniosek, że interakcja między dimerami CI w granicy przy Or3 i OL3 obejmuje ten sam region CI CTD, który pośredniczy we wspólnym wiązaniu par dimerów z operatorami oddzielonymi dwoma lub kilkoma zwojami spiralnymi. W tym celu wprowadziliśmy podstawienie aminokwasowe D197G do λ CI CTD na hybrydowym represorze P22-λ. Ta substytucja znosi kooperację między dimerami CI, ale nie wpływa na wiązanie DNA lub dimeryzację represora (Whipple i wsp. 1994, 1998). Ponadto reszta D197 leży na granicy między dimerami represora w strukturze krystalicznej tetrameru domeny C-końcowej CI (Bell et al. 2000). Represor P22-λ D197G, w przeciwieństwie do hybrydy typu dzikiego, nie był w stanie wspomagać represji PRM (ryc. 3, wiersz 6), wspierając ideę, że interakcja dalekiego zasięgu między OL3 i Or3 pośredniczy ten sam interfejs używany do oddziaływań dimer-dimer bliskiego zasięgu.

OL3-OrSama interakcja 3 jest niewystarczająca do autoregulacji CI

Postawiliśmy hipotezę, że interakcja pośredniczona przez CI między: OL3 i Or3 zachodzi wydajnie tylko dlatego, że tworzenie połączenia oktameru CI Or1.Or2 i OL1.OL2 zestawienia OL3 i Or3 odpowiednio do wiązania tetrameru CI. Przetestowaliśmy tę hipotezę, sprawdzając, czy OLTylko 3 był w stanie pomóc w wiązaniu CI do Or3 samotnie, aby stłumić PRM. ten PRM konstrukcja reporterowa pokazana na rysunku 4 zawiera OL3 i Or3 rozmieszczone co 3,8 kb (dokładnie taka sama odległość jak w konstrukcjach z rys. 2), ale nie przenosi OL1, OL2, Or1, lub Or2. Nie było aktywacji PRM w tych reporterach, ponieważ Or2 jest nieobecne. Znaleźliśmy to Or3+ wersje tego reportera zostały tylko nieznacznie stłumione przy 4 CI WLU (przy użyciu pZC320cI, dane nie pokazane), więc wprowadziliśmy wyższy zakres stężeń CI (do 60 WLU) przy użyciu wysokokopiowego plazmidu ekspresyjnego CI, pZE15cI (Dodd i wsp. 2001). Odkryliśmy, że represje PRM wystąpiły przy tych wysokich poziomach CI tak długo, jak Or3 był nienaruszony (ryc. 4). Ponieważ OL3 jest znacznie silniejszym miejscem wiązania CI niż Or3 (patrz Tabela 1) i ponieważ jest jasne, że Or3 jest zajęty przy tych stężeniach, jesteśmy przekonani, że OL3 również był zajęty. Jednak nie było poprawy PRM represje przez obecność nienaruszonego OL3 przy 3,8 kb (ryc. 4). Zatem kooperatywność w tej odległości między CI związanym w OL3 i Or3 wymaga obecności innych operatorów λ.

Or3 i OL3 nie współdziałają pod nieobecność innych operatorów. Odpowiedź na CI z PRM::lacZ fuzje operonowe łożyskujące pojedyncze OL3 i Or3 operatorów w OL oraz Or. Strukturę fuzji reporterowych przedstawiono w wstawka. ten Or3-r1 oraz OLZastosowano 3-4 mutacje do zablokowania wiązania CI do jednego lub obu operatorów. CI dostarczono przy użyciu plazmidów pZE15cI i pUHA1 (0-500 μM IPTG). Słupki błędów wskazują 95% granice ufności (n = 8).

Parametry stosowane w modelowaniu fizykochemicznym

Modelowanie fizykochemiczne CI-OL-Orsystem

Statystyczne analizy termodynamiczne miareczkowania śladu CI DNazy I pozwoliły na określenie energii swobodnych dla interakcji CI z każdym z sześciu operatorów, a także dla interakcji kooperacyjnych między CI związanymi w tym samym zestawie operatorów (Tabela 1). Wcześniejsze analizy nie uwzględniały jednak dalekosiężnych interakcji między OL oraz Or. W celu walidacji naszego modelu regulacji CI, a także w celu uzyskania oszacowań energii swobodnej oddziaływań dalekiego zasięgu, zmodyfikowaliśmy statystyczne podejście termodynamiczne Shea i Ackersa (1985), aby uwzględnić OL-Or interakcja. Następnie przetestowaliśmy, czy ten nowy statystyczny model termodynamiczny, z odpowiednimi wartościami parametrów interakcji dalekiego zasięgu, może symulować nasze PRM oraz Pr dane reportera.

Δg dla każdej konfiguracji 64 możliwych gatunków dla zajęcia CI Or oraz OL (sześciu operatorów, każdy niezajęty lub zajęty przez CI) można obliczyć z energii swobodnych wymienionych w tabeli 1. Modelowaliśmy OL-Or interakcja poprzez uwzględnienie równowagi zapętlonej-niezapętlonej, wprowadzenie dziewięciu zapętlonych konfiguracji i dwóch nowych kooperacyjnych terminów energii swobodnej, Δgpaździernik i Δgtet. Pętla DNA była dozwolona dla każdego gatunku, w którym CI był związany z sąsiednią parą operatorów w OL oraz do sąsiedniej pary operatorów w Or (cztery różne rodzaje czterodimerowe, cztery różne rodzaje pięciodimerowe i pojedynczy rodzaj sześciodimerowy), a energię swobodną dla każdej takiej zapętlonej konfiguracji uzyskano przez dodanie Δgpaździernik kooperatywność do energii swobodnej obliczonej dla konfiguracji bez pętli. Ten termin kooperatywności odzwierciedla zmianę energii swobodnej netto z powodu oktameryzacji CI związanego w poprzek Or-OL, wraz z kosztem utworzenia pętli DNA (ryc. 1B,C). Δgtet określenie spółdzielczości dodano tylko w przypadku, gdy wszyscy sześć operatorów było zajętych (stosowane oprócz Δgpaździernik). Ten termin kooperatywności odzwierciedla ogólną korzystną zmianę energii swobodnej z powodu tetrameryzacji między CI związanym z pozostałym operatorem w OL i do pozostałego operatora w Or gdy oktamer CI jest już obecny. Na podstawie eksperymentu z rysunku 4, który wykazał, że jeden operator przy OL i jednego operatora w Or nie współpracuj, Δgtet nie został zastosowany do gatunków, u których nie mogło dojść do tworzenia oktameru.

Aby wygenerować krzywe, które symulowałyby nasze dane reporterowe LacZ (aktywność LacZ jako funkcja stężenia CI), przypisaliśmy aktywności LacZ dla Pr oraz PRM dla każdej konfiguracji operatora, w oparciu o działania LacZ mierzone za pomocą naszych konstrukcji reporterowych (wyeliminowane lub całkowicie wyparte dla Pr podstawowa, aktywowana lub stłumiona przez PRM Ryc. 2 Dodd i in. 2001). Zastosowane wartości LacZ wymieniono w Tabeli 1, dalsze szczegóły podano w Materiałach i Metodach. Stężenia CI zostały przeliczone na jednostki lizogeniczne przy użyciu lizogenicznego stężenia CI 370 nM (Tabela 1). Początkowo stwierdziliśmy, że symulacje dały działania CI, które były około 10-krotnie bardziej skuteczne niż oczekiwano na podstawie danych reportera. Wiązanie CI do niespecyficznego DNA in vivo powinno obniżyć stężenie CI dostępnego do interakcji z określonymi miejscami, a my byliśmy w stanie dopasować teoretyczne krzywe represji z danymi represji in vivo, biorąc pod uwagę to niespecyficzne wiązanie (Materiały i metody). Parametr KNS (powinowactwo CI dla pojedynczego niespecyficznego miejsca) dostosowano, aby uzyskać rozsądne dopasowanie do danych reportera dla PRM i dla Pr w przypadku braku CI wiążącej do OL.

Rozsądne pasuje do wszystkich lacZ dane reporterowe dla typu dzikiego i mutanta PRM oraz Pr promotorzy w obecności OL uzyskano przy wartościach energii swobodnej -0,5 kcal/mol dla Δgpaździernik oraz -3 kcal/mol dla Δgtet. Rysunek 5A przedstawia symulacje dla PRM gdy Or jest typu dzikiego lub nosi mutacje w Or3 które znoszą (r1) lub poprawić (c12) wiązanie CI. Rysunek 5B przedstawia symulację Pr dane z Rysunku 2B. Istnieje rozsądne dopasowanie między danymi a teorią przy wyższych stężeniach CI, odtwarzając osłabienie Pr represje przez utratę OL a także bardzo nieznaczny efekt OL3-4 mutacje. Jednak z powodów, których nie rozumiemy, krzywe teoretyczne przewidują silniejsze represje Pr niż obserwowaliśmy przy stężeniach CI poniżej 1 WLU.

Modelowanie fizykochemiczne regulacji CI. (A-D) Symulacja PRM oraz Pr lacZ dane reporterowe przy użyciu modelu fizykochemicznego obejmującego interakcje CI dalekiego zasięgu (patrz tekst). Symulacje (linie ciągłe) za pomocą Δgpaździernik = -0,5 kcal/mol i Δgtet = -3,0 kcal/mol dla (A) wt PRM lub PRM niosąc r1 albo c12 mutacja w Or3 (OL prezentują dane z Dodd et al. 2001) (b) ten Pr dane reporterowe z ryc. 2B. (PŁYTA CD) Efekt zróżnicowania Δgpaździernik od -2 do +5 kcal/mol przy Δgtet ustalona na -3,0 kcal/mol (C) lub różne Δgtet od -4 do 0 kcal/mol przy Δgpaździernik ustalona na -0,5 kcal/mol (D) na symulacji wt PRM dane. (E, F) Frakcja każdego z 64 możliwych gatunków operatorów CI (zapętlone i niezapętlone frakcje każdego gatunku łącznie) przewidywana przez model w zakresie stężeń CI, w obecności (mi Δgpaździernik = -0,5, Δgtet = -3,0 kcal/mol) lub efektywna nieobecność (F Δgpaździernik = +5, Δgtet = -3,0 kcal/mol) oddziaływań dalekiego zasięgu. Gatunki podrzędne nie są oznakowane, linia przerywana pokazuje stężenie lizogennego CI.

Skutki zmian w Δgpaździernik igtet na dopasowanie symulacji z danymi pokazano dla typu dzikiego PRM na rysunku 5C,D. Z Δgtet utrzymywana na poziomie -3 kcal/mol, obniżając Δgpaździernik poniżej -0,5 kcal/mol powodowało bardziej czułą aktywację CI PRM, natomiast zwiększając Δgpaździernik wartości powyżej -1 kcal/mol osłabione tłumienie CI PRM (Rys. 5C). Ustawienie Δgpaździernik do +5 kcal/mol, skutecznie eliminując zapętlenie DNA, wykazywał brak PRM represję, której można by się spodziewać w przypadku mutanta CI specyficznie uszkodzonego w oktameryzacji. Obniżenie Δgtet trzymając Δgpaździernik przy -0,5 kcal/mol również zwiększyła represję CI PRM (rys. 5D).

Rysunek 5E przedstawia rozkład populacji 64 różnych gatunków okupacji operatorów (połączone konfiguracje zapętlone i niezapętlone) jako funkcję całkowitego stężenia represora, obliczoną przy użyciu Δgpaździernik = -0,5 i Δgtet = -3 kcal/mol. Przy tych kooperatywnościach, czterodimerowe i pięciodimerowe formy, które są zdolne do tworzenia pętli, są w 69% zapętlonej konfiguracji, podczas gdy w pełni ligandowane formy R123L123 są w 99,7% zapętlone. Chociaż model pozwala Δgpaździernik termin dotyczący współpracy dla wszystkich potencjalnych gatunków oktameru, te gatunki zdolne do tworzenia oktameru R12L12 stanowią co najmniej 90% możliwych gatunków zawierających oktamer w dowolnym stężeniu CI.

Uderzająco, pomimo dużej liczby możliwości, tylko pięć gatunków związanych z CI osiąga ponad 10% udział w całkowitej frakcji przy dowolnym stężeniu CI (ryc. 5E). Przy lizogennym stężeniu CI trzy rodzaje stanowią 90% całości: R12L12 (∼40%), kompleks R12L123 (∼20%) i w pełni zajęte rodzaje R123L123 (∼30%) z ~72% całkowita będąca zapętlonymi formami tych gatunków. Co ciekawe, stężenie lizogeniczne występuje w obszarze wykresu, w którym krzywe R12L12 i R123L123 mają strome i przeciwne nachylenia, tak że małe wahania stężenia CI powodowałyby duże zmiany w stosunku aktywowanych do stłumionych PRM. Wydaje się zatem, że stan lizogenny sprzyja maksymalnej reaktywności w autoregulacji ujemnej CI. Rysunek 5F przedstawia rozmieszczenie gatunków obliczone dla przypadku, w którym zapętlenie między Or oraz OL jest skutecznie nieobecny (Δgpaździernik = +5). Głównym efektem jest zmiana frakcji trzech gatunków lizogenicznych, przy czym gatunek R123L123 jest zasiedlony tylko na poziomie represora znacznie powyżej stężeń lizogenicznych, a tylko dwa PRM-aktywowane gatunki przeważające w fizjologicznych stężeniach CI.


Abstrakcyjny

Niniejsze badanie wykorzystuje okresową teorię funkcjonału gęstości (DFT) do określenia mechanizmu reakcji i wpływu wielkości reagentów dla wszystkich 20 aren (C6-C12) reakcje metylacji z użyciem CH3OH i CH3OCH3 jako środki metylujące w zeolitach H-MFI. Struktury odczynników, produktów i stanów przejściowych zostały ręcznie wygenerowane, zoptymalizowane, a następnie systematycznie przeorientowane i ponownie zoptymalizowane, aby w wystarczającym stopniu próbkować powierzchnię energii potencjalnej, a tym samym zidentyfikować globalne minima i najbardziej stabilne stany przejściowe, które je łączą. Te systematyczne reorientacje obniżyły energie nawet o 45 kJ mol -1 , co dowodzi ich konieczności przy analizie ścieżek reakcji czy właściwości adsorpcyjnych zeolitów. benzen-CH3OCH3 Metylacja zachodzi poprzez sekwencyjne szlaki, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, ale jest ograniczona przez metylację powierzchniową, która jest stabilizowana przez koadsorbowany benzen poprzez kooperację między kanałami i skrzyżowaniami w obrębie MFI. Te metylacje powierzchniowe wspomagane koadsorbatem generalnie przeważają nad drogami niewspomaganymi. Obliczone bariery energii swobodnej i energie reakcji sugerują, że mogą wystąpić zarówno sekwencyjne, jak i skoordynowane mechanizmy metylacji, w zależności od środka metylującego i metylobenzenu będącego reagentem, żaden pojedynczy mechanizm nie przeważa dla tych homologicznych reakcji. Wewnętrzne bariery metylacyjne dla stopniowych reakcji benzenu do heksametylobenzenu pozostają pomiędzy 75-137 kJ mol -1 w warunkach odpowiednich dla reakcji metanol-węglowodór (MTH), gdzie takie związki arenowe działają jako kokatalizatory. Wewnętrzne bariery metylacji są podobne w przypadku CH3OH i CH3OCH3, co sugeruje, że oba rodzaje są w równym stopniu zdolne do wzajemnego przekształcania rodzajów metylobenzenu. Dodatkowo, te bariery metylacyjne nie zwiększają się systematycznie wraz ze wzrostem liczby podstawników metylowych na arenie, a tworzenie się wyższych metylowanych arenów jest termodynamicznie korzystne. Bariery te są znacznie niższe niż te związane z tworzeniem się alkenów podczas cyklu aromatycznego, co sugeruje, że związki aromatyczne utworzone podczas reakcji MTH albo wychodzą z katalizatora — w zależności od struktury porów tego zeolitu — albo zostają uwięzione jako ekstensywnie podstawiony C10-C12 gatunki, które mogą albo izomeryzować, tworząc olefiny, albo ostatecznie tworzyć związki poliaromatyczne, które dezaktywują katalizatory MTH.


Abstrakcyjny

Na podstawie badań mutantów Asn do Ala, wzrost stabilności po zakopaniu grup amidowych, które są połączone wiązaniami wodorowymi z grupami peptydowymi, wynosi 80 cal/(mol Å 3 ). Na podstawie podobnych badań mutantów Leu do Ala i Ile do Val, wzrost stabilności po zakopaniu −CH2− grupy to 50 cal/(mol Å 3 ). Zatem zakopanie grupy amidowej bardziej przyczynia się do stabilności białka niż zakopanie równoważnej objętości −CH2− grupy. Zastosowanie tych wyników do sfałdowanych białek prowadzi do zaskakującego wniosku, że zakopywanie grup peptydowych ma większy wkład w stabilność białka niż zakopywanie niepolarnych łańcuchów bocznych. Kilka badań wykazało, że kara desolwatacji za zakopanie grup peptydowych jest znacznie mniejsza niż ogólnie sądzono. Sugeruje to, że wiązania wodorowe i oddziaływania van der Waalsa grup peptydowych w ciasno upakowanym wnętrzu złożonego białka są korzystniejsze niż podobne oddziaływania z wodą w białku niezłożonym.

Praca ta była wspierana przez NIH, Fundację Roberta A. Welcha oraz profesora Toma i Jeana McMullinów.

Do kogo należy kierować korespondencję. Telefon: (979) 845-1788. Faks: (979) 847-9481. E-mail: [email protected]


Wstęp

Interpretacja zmian w energii swobodnej wiązania w szeregu kongenerycznych ligandów (znanych również jako związek struktura-aktywność [SAR]) jest jednym z głównych filarów praktyki chemii medycznej. Te zmiany energii swobodnej są wypadkową zmian entalpii i entropii, które często przeciwstawiają się sobie (kompensacja entalpii entropii). Głębsze zrozumienie zmian termodynamiki wiązania w serii kongenerów 1𠄲 (struktura-termodynamika-zależność) jest w konsekwencji fundamentalne dla pełnego zrozumienia zależności SAR. Termodynamika wiązania jest określana przez stan termodynamiczny solwatowanego kompleksu ligand-białko w stosunku do solwatowanego nieskompleksowanego liganda i białka. Zmiany termodynamiczne można zatem wytworzyć, gdy solwatowany kompleks ligand-białko i/lub solwatowane układy nieskompleksowanego liganda są zaburzone przez strukturalne modyfikacje ligandów. Jednym z najbardziej wszechstronnych elementów tych systemów, który można łatwo zaburzyć, jest woda. Woda jest głównym graczem w wiązaniu ligand-białko, którego rola w procesie wiązania nie jest jeszcze w pełni poznana 3 . W ostatnich latach wzrosła świadomość wielu wcześniej niezbadanych aspektów zaangażowania wody w wiązanie ligand-białko 4𠄸. Na przykład bardzo niedawne badanie opublikowane przez Snydera i wsp. dostarczyło nowych informacji na temat efektu hydrofobowego poprzez analizę termodynamiki cząsteczek wody w miejscu aktywnym anhydrazy węglanowej 9 . Intrygującą cechą cząsteczek wody w miejscach aktywnych jest ich zdolność do uczestniczenia w rozszerzonych sieciach wiązań H10, które mogą mieć korzystne entalpie (ze względu na wiele wiązań H) i niekorzystne entropie (ze względu na zmniejszenie ruchliwości). Zaburzenia takich sieci przez przyrostowe zmiany strukturalne w ligandzie mogą mieć własne efekty kompensacji entalpii entropii, które są nakładane na te związane z kompleksami związanymi i niezwiązanymi ligandami. Zbadanie konsekwencji termodynamicznych tych perturbacji ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia względnej entalpii, entropii i energii swobodnej wiązania w szeregu kongenerycznych ligandów.

Zrozumienie zależności struktura-aktywność i struktura-termodynamika jest również uwarunkowane odkryciem szczegółów innego ważnego aspektu wiązania ligand-białko: współdziałania grup funkcyjnych ligandów. Na zmiany termodynamiki wiązania w szeregu kongenerów ligandów może wpływać obecność innych grup funkcyjnych w ligandzie. Na przykład wykazano, że poprawa swobodnej energii wiązania w szeregu kongenerycznych inhibitorów trombiny, w których hydrofobowy łańcuch boczny wiążący kieszonkę S3 był systematycznie zmieniany, była bardziej wyraźna w obecności liganda NH2 grupa zdolna do tworzenia wiązania H z białkiem 11 . NH2 grupa i hydrofobowy łańcuch boczny w tej serii inhibitorów trombiny są zatem synergistyczne, innymi słowy wykazują pozytywną kooperację. Mówi się, że dwie grupy funkcyjne ligandu współpracują, gdy ich jednoczesne istnienie w strukturze liganda przyczynia się mniej lub bardziej korzystnie do swobodnej energii wiązania niż suma wkładów tych grup, gdy są one obecne indywidualnie. Współdziałanie między grupami ligandów X i Y można na przykład ocenić za pomocą cykli podwójnych mutantów 12�, porównując zmianę energii swobodnej wiązania zachodzącej, gdy obie grupy istnieją w ligandzie (ΔΔG(H,H→X,Y)) z sumą wiążących zmian energii swobodnej występujących, gdy każda grupa istnieje indywidualnie (ΔΔG(H,H→X,H)+ ΔΔG(H,H→H,Y)). Kiedy ΔΔG(H,H→X,Y) ma bardziej ujemną wartość niż ΔΔG(H,H→X,H)+ ΔΔG(H,H→H,Y), grupy X i Y są synergistyczne (tj. ΔΔG(H,H→X,Y)< ΔΔG(H,H→X,H)+ ΔΔG(H,H→H,Y): pozytywna współpraca). Wręcz przeciwnie, kiedy ΔΔG(H,H→X,Y) ma mniejszą wartość ujemną niż ΔΔG(H,H→X,H)+ ΔΔG(H,H→H,Y), grupy X i Y są antagonistyczne (tj. ΔΔG(H,H→X,Y)> ΔΔG(H,H→X,H)+ ΔΔG(H,H→H,Y): negatywna kooperatywność). Innym sposobem oszacowania wielkości kooperatywności jest porównanie różnicowej energii wiązania 16 spowodowanej zastąpieniem liganda H grupą X w obecności “ΔΔG(H,Y→X,Y)” i brak grupy Y “ΔΔG(H,H,→X,H)”, czyli różnicowa energia wiązania spowodowana wymianą H→Y w obecności “ΔΔG(X,H→X,Y)” i brak grupy X “ΔΔG(H,H→H,Y)”. Jeśli na przykład ΔΔG(H,Y→X,Y) ma większą wartość ujemną niż ΔΔG(H,H→X,H), grupy X i Y wykazują pozytywną współpracę i odwrotnie.

Kooperatywność można uzyskać, jeśli zmodyfikowana zostanie siła bezpośrednich oddziaływań ligand-białko. Na przykład wzajemne wzmacnianie bezpośrednich oddziaływań ligand-białko17, które może być związane z redukcją resztkowej ruchliwości ligandu, może powodować pozytywną kooperację (np. inhibitory trombiny)11. We współpracy mogą też pośredniczyć inne czynniki wpływające na proces wiązania. Na przykład, może wynikać z wprowadzenia odchylenia konformacyjnego w jednym z łańcuchów bocznych ligandu przez inny lub z modyfikacji trybu wiązania liganda12. Jednym z potencjalnych źródeł kooperatywności, które według naszej najlepszej wiedzy nie zostało zbadane, jest wpływ grupy funkcyjnej ligandu na zmiany strukturalne wywołane przez inną grupę w warstwach hydratacyjnych nieskompleksowanego liganda i/lub liganda. kompleks białkowy (kooperatywność za pośrednictwem wody). Na przykład wypieranie wody, reorganizacja i inne zmiany strukturalne w powłokach hydratacyjnych spowodowane przez grupę ligandów X mogą być ułatwiane lub hamowane przez inną grupę ligandów Y. Może to nastąpić, gdy grupa Y bezpośrednio oddziałuje z przemieszczanymi, reorganizowanymi cząsteczkami wody itp. przez grupę X lub pośrednio zaburza rozszerzone sieci wiązań H, w których te cząsteczki wody mogą uczestniczyć. być mniej lub bardziej przychylnym (ΔΔG(H,Y→X,Y)< ΔΔG(H,H→X,H): pozytywna współpraca, ΔΔG(H,Y→X,Y)> ΔΔG(H,H→X,H): negatywna kooperatywność).

W tym badaniu przetestowaliśmy hipotezę, że kooperatywność może być pośredniczona przez zmiany w powłokach hydratacyjnych. Termolizyna (TLN), endopeptydaza Zn 18� uzyskana z Bacillus termoproteolyticus, został wybrany jako biologiczny system modelowy do testowania tej hipotezy. Jednym z powodów wyboru tego systemu było to, że w trakcie badań wiązania hydrofobowego w kieszeniach termolizyny S1′ i S2′ stwierdzono, że wiązanie ZG P LG 16 z termolizyną pozostawia dobrze nawodnioną kieszeń S2′ liczba cząsteczek wody związanych wiązaniami wodorowymi z białkiem i ze sobą (szczegóły na rys. 1a podano później). Zgodnie z hipotezą okazało się, że niektóre z tych cząsteczek wody mogą zostać przemieszczone i/lub przegrupowane przez wprowadzenie hydrofobowego łańcucha bocznego zdolnego do wiązania kieszeni S2′. Na przykład, struktura krystaliczna wcześniej opisanego inhibitora termolizyny, ZG P LL 21�, pokazuje, że boczny łańcuch izobutylowy wypiera niektóre cząsteczki wody z kieszeni S2′ (Fig. 1b). Ponieważ te cząsteczki wody tworzą wiązania wodorowe z Asn112, który z kolei jest wiązany wiązaniem wodorowym z ligandem COO−, postulowano, że wody, które są przemieszczone lub przegrupowane w wyniku wiązania łańcucha bocznego z kieszenią S2′ może mieć wpływ obecność COO−, a ich termodynamika może być modulowana przez tę grupę, powodując zmiany wkładu łańcucha bocznego w termodynamikę wiązania (tj. kooperatywność).

Schematyczne przedstawienie oddziaływań między inhibitorami amidofosforynów (kolor niebieski) i wiązaniami H termolizyny pokazano liniami kropkowanymi, cząsteczki wody przedstawiono jako niebieskie kulki, a hydrofobowe kieszenie enzymu przedstawiono jako czerwone krzywe A) ZG P LG: trzy krystalograficzna woda cząsteczki są pokazane w kieszeni S2′ inne nie są pokazane schemat oparty jest na jednej ze struktur krystalicznych omówionych w dalszej części tego artykułu. B) ZG P LL: dwie z trzech cząsteczek wody pokazanych w kieszeni S2′ ZG P LG są przesunięte przez diagram izobutylowego łańcucha bocznego oparty na strukturze krystalicznej ZG P LL (3FWD).

Podejście zastosowane do zbadania potencjalnej kooperatywności między łańcuchami bocznymi, które wiążą się w kieszeni S2′ i grupą ligandu COO−, polegało na porównaniu zmian w powinowactwach wiązania i profilach termodynamicznych związanych z wprowadzeniem tych łańcuchów bocznych S2′ w obecność i nieobecność grupy COO −. Łańcuchem bocznym, który został wybrany do tego wstępnego badania, była grupa Me. Ligandy fosfonoamidowe 8a: ZG P LG i 8b: ZG PL LA, z których oba mają grupę terminalną COO −, a także ich analogi 8c oraz 8d, które nie zawierają COO −, zostały zatem zsyntetyzowane i przeanalizowane za pomocą testu kinetycznego, kalorymetrii izotermicznej i krystalografii rentgenowskiej, aby odpowiedzieć na następujące pytania: Kieszeń S2′ i grupa terminala ligandu COO −? 2) Czy ta współpraca jest pozytywna czy negatywna? 3) Czy ta kooperatywność jest napędzana entalpicznie czy entropowo? 4) Czy środowisko wodne kieszeni S2′ odgrywa rolę w tej kooperacji? W celu dokładniejszego ujawnienia pochodzenia kooperatywności zastosowano szczegółowe podejście teoretyczne wraz ze wstępną analizą obliczeniową, aby głębiej zagłębić się w różniczkowe parametry termodynamiczne wywołane zastąpieniem grupy H→Me. Dodatkowe inhibitory, z różnymi większymi alkilowymi łańcuchami bocznymi wiążącymi kieszeń S2′, są obecnie badane i zostaną opisane w kolejnych publikacjach.


Metody

Obecny rozwój technik QM/MM pozwala traktować granicę białko-RNA na wysokim poziomie teorii kwantowej, jednocześnie opisując całe białko i solwatację na poziomie klasycznym. Wszystkie obliczenia QM/MM i QM są przeprowadzane za pomocą pakietu programów Schrödingera (31, 32). System QM/MM obejmuje białko U1A plus zasady U8, G9, C10, A11 i C12 ze struktury krystalograficznej [kod ID Protein Data Bank (PDB) 1URN] (21). System jest początkowo solwatowany w pudle (w minimalnej odległości 15 Å od krawędzi pudła do powierzchni białka/RNA) prostych cząsteczek wody naładowanej punktowo z sześcioma anionami chloru i czterema kationami sodu. Rozpuszczalnik, atomy wodoru i brakujące łańcuchy boczne zostały wstępnie zrównoważone przez 40-ps dynamikę molekularną uruchomioną w 300 K w okresowych warunkach granicznych. Ostateczny system QM/MM uzyskuje się poprzez trzymanie wszystkich cząsteczek wody w odległości 14 Å od dowolnego atomu białka/RNA. Region QM obejmuje wszystkie zasady, Phe-56 i Asp-92, łącznie 225 atomów QM. System został zminimalizowany za pomocą funkcjonału gęstości B3LYP (DFT) i pola siłowego OPLS-AA MM (bardziej szczegółowy opis znajduje się w legendzie do Rys. 1).

Wszystkie próbki konformacyjne białek są przeprowadzane za pomocą plop (33, 34), programu do modelowania białek przy użyciu funkcji energii wszystkich atomów i uogólnionego powierzchniowo modelu solwatacji Born continuum. plop zawiera algorytmy wieloskalowej skróconej minimalizacji Newtona, optymalizacji łańcucha bocznego i przewidywania pętli.


Bibliografia

Dill KA, MacCallum JL. Problem fałdowania białek po 50 latach. Nauki ścisłe. 2012338:1042–6.

Englander SW, Mayne L. Natura szlaków fałdowania białek. Proc Natl Acad Sci USA 2014111:15873–80.

Fersht AR, Sato S. Analiza wartości Phi i natura stanów przejściowych fałdowania białek. Proc Natl Acad Sci USA 2004101:7976–81.

Matouschek A, Kellis JT, Serrano L, Fersht AR. Mapowanie stanu przejściowego i szlaku fałdowania białek za pomocą inżynierii białkowej. Natura. 1989340:122-6.

Kuwajima K. Stan stopionej kulki jako wskazówka do zrozumienia fałdowania i współdziałania struktury globularno-białkowej. Białka. 19896:87-103.

Baldwin RL, Róża GD. Stopione globule, zmiana konformacyjna spowodowana entropią i fałdowanie białek. Curr Opin Struct Biol. 201323:4-10.

Kim PS, Baldwin RL. Pośredniczy w reakcjach fałdowania małych białek. Annu Rev Biochem. 199059:631–60.

Baldwin AJ, Kay LE. Spektroskopia NMR skupia się na niewidzialnych stanach białek. Metody Nat. 20095:808–14.

Kim YE, Hipp MS, Bracher A, Hayer-Hartl M, Ulrich HF. Chaperon molekularny pełni funkcję fałdowania białek i proteostazy. Annu Rev Biochem. 201382:323–55.

Hartl FU, Bracher A, Hayer-Hartl M. Chaperony molekularne w składaniu białek i proteostazie. Natura. 2011475:324–32.

Freedberg DI, Selenko P. NMR na żywo. Annu Rev Biofizy. 201443:171–92.

Thommen M, Holtkamp W, Rodnina MV. Zwijanie kotranslacyjne białek: postęp i metody. Curr Opin Struct Biol. 201742:83–9.

Nilsson OB, Hedman R, Marino J, Wickles S, Bischoff L, Johansson M i in. Kotranslacyjne fałdowanie białek w tunelu wyjściowym rybosomu. Rep. komórki 201512:1533-40.

Holtkamp W, Kokic G, Jäger M, Mittelstaet J, Komar AA, Rodnina MV. Kotranslacyjne fałdowanie białek na rybosomie monitorowane w czasie rzeczywistym. Nauki ścisłe. 2015350:1104–7.

Schlebach JP, Sanders CR. Taniec bezpieczeństwa: biofizyka fałdowania i nieprawidłowego fałdowania białek błonowych w kontekście komórkowym. Biofizyka Q Rev. 201548:1–34.

Fleming KG. Energetyka fałdowania białek błonowych. Annu Rev Biofizy. 201443:233–55.

Booth PJ, Curnow P. Badanie sceny składania: białka błonowe. Curr Opin Struct Biol. 200919:8–13.

Stanley AM, Fleming KG. Proces fałdowania białek w błony: wyzwania i postęp. Arch Biochem Biofizy. 2008469:46-66.

Bowie UJ. Rozwiązanie problemu fałdowania białek błonowych. Natura. 2005438:581-9.

Booth PJ, Templer RH, Meijberg W, Allen SJ, Curran AR, Lorch M. Badania in vitro fałdowania białek błonowych. Crit Rev Biochem Mol Biol. 200136:501–603.

Biały SH, Wimley WC. Fałdowanie i stabilność białek błonowych: zasady fizyczne. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 199928:319–65.

Pogozheva ID, Mosberg HI, Lomize AL. Życie na granicy: adaptacja białek do anizotropowego środowiska błony. Białko Sci. 201423:1165–96.

Kennedy SJ. Struktury białek błonowych. J Membr. Biol. 197842:265-79.

Wimley WC, biała SH. Eksperymentalnie wyznaczona skala hydrofobowości białek na granicy błon. Nat Struct Mol Biol. 19963:842-8.

Engelman DM, Steitz TA, Goldman A. Identyfikacja niepolarnych transdwuwarstwowych helis w sekwencjach aminokwasowych białek błonowych. Annu Rev Biophys Biophys Chem. 198615:321–53.

Kleffel B, Garavito RM, Baumeister W, Rosenbusch JP. Drugorzędowa struktura białka tworzącego kanały: poryna z błon zewnętrznych E. coli. EMBO J. 19854: 1589-92.

Popot JL, Engelman DM. Fałdowanie i oligomeryzacja białek błonowych: model dwuetapowy. Biochemia. 199029:4031-7.

Hagan CL, Silhavy TJ, Kahne D. Zespół białka błonowego β-Barrel przez kompleks Bam. Annu Rev Biochem. 201180:189–210.

Dornmair K, Kiefer H, Jähnig F. Ponowne zwijanie integralnego białka błonowego. OmpA Escherichia coli. J Biol Chem. 1990265:18907-11.

Surrey T, Jähnig F. Ponowne fałdowanie i zorientowane wstawianie białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej. Proc Natl Acad Sci USA. 199289:7457–61.

Surrey T, Schmid A, Jähnig F. Składanie i wstawianie błony trimerycznej beta-beczki białka OmpF. Biochemia. 199635:2283-8.

Huysmans GHM, Radford SE, Brockwell DJ, Baldwin SA. N-końcowa helisa jest zaciskiem pomontażowym w bakteryjnym białku błony zewnętrznej PagP. J Mol Biol. 2007373:529–40.

Burgess NK, Dao TP, Stanley AM. Białka beczkowe Fleming KG β, które znajdują się w zewnętrznej błonie Escherichia coli in vivo, wykazują różne zachowania fałdowania in vitro. J Biol Chem. 2008283:26748–58.

Anfinsen CB. Zasady rządzące fałdowaniem łańcuchów białkowych. Nauki ścisłe. 1973181:223–30.

Fairman JW, Noinaj N, Buchanan SK. Biologia strukturalna białek błonowych β-beczułek: podsumowanie ostatnich doniesień. Curr Opin Struct Biol. 201121:523–31.

Bos MP, Robert V, Tommassen J. Biogeneza błony zewnętrznej bakterii gram-ujemnych. Annu Rev Microbiol. 200761:191-214.

Dong H, Xiang Q, Gu Y, Wang Z, Paterson NG, Stansfeld PJ, et al. Strukturalna podstawa insercji lipopolisacharydów do błony zewnętrznej. Natura. 2014511:52–6.

Cao B, Zhao Y, Kou Y, Ni D, Zhang XC, Huang Y. Struktura kanału sekrecji amyloidu nomerowego bakteryjnego. Proc Natl Acad Sci USA 2014111:E5439–44.

Barnhart MM, Chapman MR. Biogeneza i funkcja Curli. Annu Rev Microbiol. 200660:131–47.

Yan Z, Yin M, Xu D, Zhu Y, Li X. Strukturalne wglądy w kanał translokacji sekretyny w układzie wydzielniczym typu II. Nat Struct Mol Biol. 201724:177–83.

Costa TRD, Felisberto-Rodrigues C, Meir A, Prevost MS, Redzej A, Trokter M, et al.Systemy sekrecyjne u bakterii Gram-ujemnych: spostrzeżenia strukturalne i mechanistyczne. Nat Rev Micro. 201513:343–59.

de Leij L, Witholt B. Strukturalna niejednorodność błon cytoplazmatycznych i zewnętrznych Escherichia coli. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1977471: 92–104.

Jarosławski S, Duquesne K, Sturgis JN, Scheuring S. Architektura wysokiej rozdzielczości błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych Roseobacter denitrificans. Mol Mikrobiol. 200974: 1211–22.

Koebnik R. Zespół błonowy białka błony zewnętrznej Escherichia coli OmpA: badanie ograniczeń sekwencji na transbłonowych niciach beta. J Mol Biol. 1999285:1801–10.

Lin M, Gessmann D, Naveed H, Liang J. Fałdowanie i topologia białka błony zewnętrznej ze skali swobodnej energii transferu obliczeniowego. J Am Chem Soc. 2016138:2592–601.

Koper KA. Dominujące siły w fałdowaniu białek. Biochemia. 199029:7133–55.

Nicholls A, Sharp KA, Honig B. Składanie i asocjacja białek: spostrzeżenia na temat międzyfazowych i termodynamicznych właściwości węglowodorów. Białka. 199111:281–96.

Peterson JH, Plummer AM, Fleming KG, Bernstein HD. Selektywna presja umożliwiająca szybką integrację z błoną ogranicza sekwencję bakteryjnych białek błony zewnętrznej. Mol Mikrobiol. 2017106(5):777–92.

Stapleton JA, Whitehead TA, Nanda V. Przeprojektowanie obliczeniowe powierzchni skierowanej do lipidów białka błony zewnętrznej OmpA. Proc Natl Acad Sci USA 2015112:9632–7.

Hong H, Tamm LK. Elastyczne sprzężenie stabilności integralnych białek błonowych z siłami dwuwarstwy lipidowej. Proc Natl Acad Sci USA 2004101:4065–70.

Hong H, Szabo G, Tamm LK. Sprzężenia elektrostatyczne w bramkowaniu kanałów jonowych OmpA sugerują mechanizm otwierania porów. Nat Chem Biol. 20062:627–35.

Hong H, Park S, Flores Jiménez RH, Rinehart D, Tamm LK. Rola aromatycznych łańcuchów bocznych w fałdowaniu i termodynamicznej stabilności integralnych białek błonowych. J Am Chem Soc. 2007129:8320–7.

Andersen KK, Wang H, Otzen DE. Analiza kinetyczna fałdowania i rozwijania OmpA w moczniku i chlorku guanidyniowym: szlaki pojedyncze i równoległe. Biochemia. 201251:8371–83.

Kleinschmidt JRH, Popot JL. Fałdowanie i stabilność integralnych białek błonowych w amfipolach. Arch Biochem Biofizy. 2014564:327–43.

Huysmans GHM, Baldwin SA, Brockwell DJ, Radford SE. Stan przejściowy dla fałdowania białka błony zewnętrznej. Proc Natl Acad Sci USA. 2010107:4099–104.

Moon CP, Zaccai NR, Fleming PJ, Gessmann D, Fleming KG. Stabilność termodynamiczna białek błonowych może służyć jako pochłaniacz energii do sortowania w peryplazmie. Proc Natl Acad Sci USA 2013110:4285–90.

Iyer BR, Zadafiya P, Vetal PV, Mahalakshmi R. Energetyka partycjonowania łańcucha bocznego reszt sygnału β w samodzielnym fałdowaniu białka transbłonowego β-beczki. J Biol Chem. 2017292:12351–65.

Księżyc CP, Kwon S, Fleming KG. Przezwyciężenie histerezy w celu uzyskania odwracalnego fałdowania równowagi dla fosfolipazy a błony zewnętrznej w dwuwarstwach fosfolipidowych. J Mol Biol. 2011413:484-94.

Inouye M, Yee M-L. Jednorodność białek otoczki Escherichia coli rozdzielonych elektroforezą żelową w dodecylosiarczanie sodu. J Bakteriol. 1973113:304-12.

Schweizer M, Hindennach I, Garten W, Henning U. Główne białka błony zewnętrznej otoczki komórkowej Escherichia coli. Oddziaływanie białka II z lipopolisacharydem. Eur J Biochem. 197882:211-7.

Nakamura K, Mizushima S. Wpływ ogrzewania w roztworze siarczanu dodecylu na konformację i ruchliwość elektroforetyczną wyizolowanych głównych białek błony zewnętrznej z Escherichia coli K-12. J Biochem. 197680:1411–22.

Księżyc CP, Fleming KG. Skala hydrofobowości łańcucha bocznego pochodząca z fałdowania białek transbłonowych w dwuwarstwy lipidowe. Proc Natl Acad Sci USA. 2011108:10174–7.

Qu J, Mayer C, Behrens S, Holst O, Kleinschmidt JH. Trimeryczny białko opiekuńcze peryplazmatyczne Skp Escherichia coli tworzy kompleksy 1:1 z białkami błony zewnętrznej poprzez oddziaływania hydrofobowe i elektrostatyczne. J Mol Biol. 2007374:91–105.

Wu S, Ge X, Lv Z, Zhi Z, Chang Z, Zhao XS. Interakcja między białkami błony zewnętrznej bakterii a peryplazmatycznymi czynnikami kontroli jakości: mechanizm podziału kinetycznego. Biochem J. 2011438:505–11.

Schiffrin B, Calabrese AN, Higgins AJ, Humes JR, Ashcroft AE, Kalli AC i in. Wpływ białek opiekuńczych peryplazmatycznych i grubości błony na fałdowanie białek błony zewnętrznej katalizowane przez BamA. J Mol Biol. 2017. doi: 10.1016/j.jmb.2017.09.008.

Wülfing C, Plückthun A. Składanie białek w peryplazmie Escherichia coli. Mol Mikrobiol. 199412:685–92.

Fleming KG. Połączone wypychanie kinetyczne i przyciąganie termodynamiczne jako siły napędowe do sortowania i fałdowania białek błony zewnętrznej u bakterii. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015370:20150026.

Gershenson A, Gierasch LM, Pastore A, Radford SE. Krajobrazy energetyczne białek funkcjonalnych są z natury ryzykowne. Nat Rev Mol Cell Biol. 201410:884-91.

Pocanschi CL, Apell H-J, Puntervoll P, Høgh B, Jensen HB, Welte W, et al. Główne białko błony zewnętrznej Fusobacterium nucleatum (FomA) fałduje się i wstawia do dwuwarstw lipidowych poprzez równoległe szlaki fałdowania. J Mol Biol. 2006355:548–61.

Pocanschi CL, Popot JL, Kleinschmidt JH. Fałdowanie i stabilność białka błony zewnętrznej A (OmpA) z Escherichia coli w amfipatycznym polimerze amfipol A8-35. Eur Biophys J. 201342:103-18.

Shakhnovich BE, Deeds E, Delisi C, Shakhnovich E. Struktura białka i historia ewolucji określają topologię przestrzeni sekwencji. Genom Res. 200515:385–92.

Iyer BR, Mahalakshmi R. Zależny od pozostałości koszt termodynamiczny i plastyczność beczki równoważy aktywność w aktywowanym przez PhoPQ enzymie PagP Salmonella typhimurium. Biochemia. 201554:5712–22.

Cuesta-Seijo JA, Neale C, Khan MA, Moktar J, Tran CD, Bishop RE i in. PagP wykrystalizowany z SDS/kosolwenta ujawnia drogę dostępu fosfolipidów do linijki węglowodorowej. Struktura Fold Des. 201018:1210-9.

van den Berg B. Rodzina FadL: niezwykłe transportery do nietypowych podłoży. Curr Opin Struct Biol. 200515:401–7.

Hong H, Patel DR, Tamm LK, van den Berg B. Białko błony zewnętrznej OmpW tworzy ośmioniciową beczkę beta z kanałem hydrofobowym. J Biol Chem. 2006281:7568–77.

Noinaj N, Kuszak AJ, Gumbart JC, Lukacik P, Chang H, Easley NC i in. Strukturalny wgląd w biogenezę białek błonowych β-beczułek. Natura. 2013501:385–90.

Bakelar J, Buchanan SK, Noinaj N. Struktura zespołu maszyn do montażu beczek β. Nauki ścisłe. 2016351:180–6.

Gu Y, Li H, Dong H, Zeng Y, Zhang Z, Paterson NG i in. Strukturalne podstawy insercji białek błony zewnętrznej przez kompleks BAM. Natura. 2016531:64–9.

Iadanza MG, Higgins AJ, Schiffrin B, Calabrese AN, Brockwell DJ, Ashcroft AE i in. Boczny otwór w nienaruszonej maszynerii montażowej β-beczki uchwyconej przez krio-EM. Społeczność Nat. 20167:12865.

Doerner PA, Sousa MC. Ekstremalna dynamika w szwie Bama β-beczki. Biochemia. 201756:3142–9.

Killian JA, von Heijne G. Jak białka przystosowują się do interfejsu błona-woda. Trendy Biochem Sci. 200025:429–34.

Yau W-M, Wimley WC, Gawrisch K, Biały SH. Preferencje tryptofanu dla interfejsów błonowych. Biochemia. 199837:14713-8.

McDonald SK, Fleming KG. Energie swobodne transferu wody do lipidów aromatycznego łańcucha bocznego wykazują zależność głębokościową w obrębie normalnej błony. J Am Chem Soc. 2016138:7946–50.

Jackups Jr R, Liang J. Wzory parowania między niciami w białkach błonowych β-beczki: reguła dodatnia na zewnątrz, ratowanie aromatów i przewidywanie rejestracji nici. J Mol Biol. 2005354:979–93.

von Heijne G. Przewidywanie struktury białek błonowych. Analiza hydrofobowości i zasada pozytywnego wnętrza. J Mol Biol. 1992225:487–94.

Marks DC, Fleming KG. Wpływ rusztowania białkowego na swobodne energie przenoszenia łańcucha bocznego. Biophys J. 2017113:597–604.

Ferguson AD, Hofmann E, Coulton JW, Diederichs K, Welte W. Transport żelaza za pośrednictwem sideroforów: struktura krystaliczna FhuA ze związanym lipopolisacharydem. Nauki ścisłe. 1998282:2215-20.

Kucharska I, Liang B, Ursini N, Tamm LK. Oddziaływania molekularne lipopolisacharydu z białkiem błony zewnętrznej z Pseudomonas aeruginosa sondowane metodą NMR w roztworze. Biochemia. 201655:5061–72.

Arunmanee W, Pathania M, Solovyova AS, Le Brun AP, Ridley H, Baslé A, et al. Poryny trimeryczne Gram-ujemne mają specyficzne miejsca wiązania LPS, które są niezbędne do biogenezy poryn. Proc Natl Acad Sci USA 2016113:E5034–43.

Lomize AL, Pogozheva ID, Lomize MA, Mosberg HI. Pozycjonowanie białek w błonach: podejście obliczeniowe. Białko Sci. 200615:1318–33.

Wu EL, Fleming PJ, Yeom MS, Widmalm G, Klauda JB, Fleming KG i in. Błona zewnętrzna E. coli i interakcje z OmpLA. Biophys J. 2014106:2493-502.

Merkel JS, Regan L. Aromatyczne ratowanie glicyny w arkuszach β. Złóż Des. 19983:449–56.

Michalik M, Orwick-Rydmark M, Habeck M, Alva V, Arnold T, Linke D. Ewolucyjnie zachowany motyw glicyno-tyrozynowy tworzy rdzeń zwijający w białkach błony zewnętrznej. PLoS Jeden. 201712:e0182016–23.

Leyton DL, Johnson MD, Thapa R, Huysmans GHM, Dunstan RA, Celik N i in. Złącze czopowe w domenie transbłonowej moduluje montaż autotransportera do bakteryjnych błon zewnętrznych. Społeczność Nat. 20145:4239.

Frey L, Lakomek N-A, Riek R, Bibow S. Micelles, Bicelles i Nanodiscs: Porównanie wpływu mimetyków błonowych na dynamikę szkieletu białek błonowych. Angew Chem Int Ed Engl. 201756:380–3.

Bryngelson JD, Onuchic JN, Socci ND, Wolynes PG. Lejki, ścieżki i krajobraz energetyczny fałdowania białek: synteza. Białka. 199521:167-95.

Onuchic JN, Luthey-Schulten Z, Wolynes PG. Teoria fałdowania białek: perspektywa krajobrazu energetycznego. Annu Rev Phys Chem. 199748:545–600.

Wolynes PG. Ewolucja, krajobrazy energetyczne i paradoksy fałdowania białek. Biochimie. 2015119:218–30.

Ferreiro DU, Komives EA, Wolynes PG. Frustracja w biomolekułach. Biofizyka Q Rev. 201447:285–363.

Popot JL. Składanie białek błonowych in vitro: tabela i kilka uwag. Arch Biochem Biofizy. 2014564:314–26.

Kleinschmidta JH. Fałdowanie białek błonowych β-beczułek w dwuwarstwach lipidowych — Fałdowanie i wstawianie niewspomagane i wspomagane. Biochim Biophys Acta Biomembr. 20151848:1927–43.

Chaturvedi D, Mahalakshmi R. Transbłonowe beczki β: ewolucja, fałdowanie i energetyka. Biochim Biophys Acta. 20171859:2467–82.

Kleinschmidta JH, Tamma LK. Składane produkty pośrednie białka błonowego beta-beczki. Kinetyczne dowody na wieloetapowy mechanizm wprowadzania błony. Biochemia. 199635: 12993-3000.

Rodionova NA, Tatulian SA, Surrey T, Jaehnig F. Charakterystyka dwóch związanych z błoną form OmpA. Biochemia. 199534:1921-9.

Patel GJ, Behrens-Kneip S, Holst O, Kleinschmidt JH. Peryplazmatyczny chaperon Skp ułatwia celowanie, wstawianie i fałdowanie OmpA do błon lipidowych o ujemnym potencjale powierzchni błon. Biochemia. 200948:10235–45.

Kleinschmidta JH. Kinetyka fałdowania białek błony zewnętrznej OmpA i FomA w dwuwarstwy fosfolipidowe. Lipidy z chemii fizykochemicznej. 2006141:30–47.

Huysmans GHM, Radford SE, Baldwin SA, Brockwell DJ. Plastyczność mechanizmu fałdowania białka błony zewnętrznej PagP: ścieżki równoległe i efekt elastyczności błony. J Mol Biol. 2012416:453–64.

Danoff EJ, Fleming KG. Nowe kinetyczne produkty pośrednie zasiedlone wzdłuż szlaku fałdowania transbłonowej β-beczki OmpA. Biochemia. 201756:47–60.

Krishna MMG, Anglia SW. Zunifikowany mechanizm fałdowania białek: z góry określone ścieżki z opcjonalnymi błędami. Białko Sci. 200716:449–64.

Wzorek JS, Lee J, Tomasek D, Hagan CL, Kahne DE. Integracja błonowa niezbędnego białka β-beczkowego wymaga pogrzebania pętli pozakomórkowej. Proc Natl Acad Sci USA 2017114:2598–603.

Kleinschmidt JH, den Blaauwen T, Driessen AJ, Tamm LK. Białko błony zewnętrznej A Escherichia coli wstawia się i fałduje w dwuwarstwy lipidowe według uzgodnionego mechanizmu. Biochemia. 199938:5006-16.

Kleinschmidta JH, Tamma LK. Tworzenie struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej białka błonowego β-beczki OmpA jest zsynchronizowane i zależy od grubości błony. J Mol Biol. 2002324:319–30.

Raschle T, Rios Flores P, Opitz C, Müller DJ, Hiller S. Monitorowanie tworzenia wiązań wodorowych szkieletu w składaniu białka błony β-beczki. Angew Chem. 2016128:6056–9.

Tan AE, Burgess NK, DeAndrade DS, Marold JD, Fleming KG. Samoasocjacja niesfałdowanych białek błony zewnętrznej. Makromol Biosci. 201010:763–7.

Wang H, Andersen KK, Vad BS, Otzen DE. OmpA może tworzyć złożone i niesfałdowane oligomery. Biochim Biophys Acta, Proteomika białek. 20131834:127–36.

West MW, Wang W, Patterson J, Mancias JD, Beasley JR, Hecht MH. Białka amyloidowe de novo z zaprojektowanych bibliotek kombinatorycznych. Proc Natl Acad Sci USA. 199996:11211–6.

Stroobants K, Kumita JR, Harris NJ, Chirgadze DY, Dobson CM, Booth PJ, et al. Włókna podobne do amyloidu z α-helikalnego białka transbłonowego. Biochemia. 201756:3225–33.

Danoff EJ, Fleming KG. Wodne, niesfałdowane OmpA tworzy amyloidopodobne włókienka po samoasocjacji. PLoS Jeden. 201510:e0132301–10.

Knowles TPJ, Vendruscolo M, Dobson CM. Stan amyloidu i jego związek z chorobami związanymi z nieprawidłowym fałdowaniem białek. Nat Rev Mol Cell Biol. 201415:384-96.

Napiwki KW, van Oosten-Hawle P, Hewitt EW, Radford SE. Włókna amyloidowe: obojętne agregaty w końcowym stadium czy kluczowi gracze w chorobie? Trendy Biochem Sci. 201540:719–27.

Otzen DE, Andersen KK. Fałdowanie białek błony zewnętrznej. Arch Biochem Biofizy. 2013531:34–43.

Marsh D, Shanmugavadivu B, Kleinschmidt JH. Fluktuacje sprężystości błony oraz insercja i nachylenie białek beta-beczkowych. Biophys J. 200691:227-32.

Pocanschi CL, Patel GJ, Marsh D, Kleinschmidt JH. Elastyczność krzywiznowa i ponowne fałdowanie OmpA w dużych jednowarstwowych pęcherzykach. Biophys J. 200691:L75-7.

Maurya SR, Chaturvedi D, Mahalakshmi R. Modulowanie dynamiki lipidów i płynności błony w celu szybkiego składania beczki przezbłonowej. Sci Rep. 20133:1–6.

McMorran LM, Bartlett AI, Huysmans GHM, Radford SE, Brockwell DJ. Analiza wpływu białek opiekuńczych peryplazmatycznych na fałdowanie in vitro białka błony zewnętrznej PagP. J Mol Biol. 2013425:3178–91.

Patel GJ, Kleinschmidt JH. Białko błonowe wstawione w dwuwarstwę lipidową BamA z Escherichia coli ułatwia wstawianie i zwijanie białka błony zewnętrznej A z jego kompleksu z Skp. Biochemia. 201352:3974–86.

Gessmann D, Chung YH, Danoff EJ, Plummer AM, Sandlin CW, Zaccai NR i in. Fałdowanie białka β-beczki zewnętrznej błony jest fizycznie kontrolowane przez peryplazmatyczne grupy głowy lipidów i BamA. Proc Natl Acad Sci USA 2014111:5878–83.

Hagan CL, Kim S, Kahne D. Odtworzenie zestawu białek błony zewnętrznej z oczyszczonych składników. Nauki ścisłe. 2010328:890–2.

Hagan CL, Kahne D. Odtworzony kompleks Escherichia coli Bam katalizuje wiele rund składania β-beczki. Biochemia. 201150:7444–6.

Hagan CL, Westwood DB, Kahne D. Bam lipoproteiny montują BamA in vitro. Biochemia. 201352:6108–13.

Roman-Hernandez G, Peterson JH, Bernstein HD. Rekonstytucja zestawu autotransportera bakteryjnego przy użyciu oczyszczonych składników. życie. 20143: 711–48.

Plummer AM, Fleming KG. Sam BamA przyspiesza fałdowanie białek błony zewnętrznej in vitro poprzez mechanizm katalityczny. Biochemia. 201554:6009-11.

Webb CT, Heinz E, Lithgow T. Ewolucja maszyn do montażu beczek β. Trendy Mikrobiol. 201220:612–20.

Behrens-Kneip S. Rola czynnika SurA w transporcie i zjadliwości białek błony zewnętrznej. Int J Med Microbiol. 2010300:421–8.

Burmann BM, Holdbrook DA, Callon M, Bond PJ, Hiller S. Ponowne spojrzenie na interakcję między chaperonem Skp i lipopolisacharydem. Biophys J. 2015108:1516–26.

Ellis RJ, Hartl FU. Zasady fałdowania białek w środowisku komórkowym. Curr Opin Struct Biol. 19999:102-10.

Hipp MS, Park SH, Hartl FU. Zaburzenia proteostazy w chorobach związanych z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją białek. Trendy Biol. 201424:506–14.

Goemans C, Denoncin K, Collet J-F. Mechanizmy fałdowania białek peryplazmatycznych. Biochim Biophys Acta, Mol Cell Res. 20141843:1517–28.

De Geyter J, Tsirigotaki A, Orfanoudaki G, Zorzini V, Economou A, Karamanou S. Składanie białka w otoczce komórkowej Escherichia coli. Mikrobiol Nat. 20161:16107.

McMorran LM, Brockwell DJ, Radford SE. Mechanistyczne badania biogenezy i fałdowania białek błony zewnętrznej in vitro i in vivo: czego do tej pory się dowiedzieliśmy? Arch Biochem Biofizy. 2014564:265–80.

Lyu Z-X, Shao Q, Gao YQ, Zhao XS. Bezpośrednia obserwacja wychwytu białek błony zewnętrznej przez periplazmatyczny chaperon Skp. PLoS Jeden. 20127:e46068-13.

Zaccai NR, Sandlin CW, Hoopes JT, Curtis JE, Fleming PJ, Fleming KG i in. Znakowanie deuterem wraz z zmiennością kontrastu rozpraszania neutronów pod małym kątem sugeruje, w jaki sposób skp wychwytuje i uwalnia niesfałdowane białka błony zewnętrznej. Metody Enzymol. 2016566:159-210.

Schiffrin B, Calabrese AN, Devine PWA, Harris SA, Ashcroft AE, Brockwell DJ, et al. Skp jest wielowartościowym chaperonem białek błony zewnętrznej. Nat Struct Mol Biol. 201623:786–93.

Holdbrook DA, Burmann BM, Huber RG, Petoukhov MV, Svergun DI, Hiller S, et al. Sprężynowy mechanizm reguluje dynamikę przypominającą klamrę opiekuńczego Skp. Struktura. 201725:1079–1088.e3.

Costello SM, Plummer AM, Fleming PJ, Fleming KG. Dynamiczny peryplazmatyczny zbiornik opiekuńczy ułatwia biogenezę białek błony zewnętrznej. Proc Natl Acad Sci USA 2016113:E4794–800.

Burmann BM, Wang C, Hiller S. Konformacja i dynamika peryplazmatycznych kompleksów błonowo-białko-opiekuńczych OmpX–Skp i tOmpA–Skp. Nat Struct Mol Biol. 201320:1265–72.

Callon M, Burmann BM, Hiller S. Mapowanie strukturalne powierzchni interakcji chaperon-podłoże. Angew Chem Int Ed Engl. 201453:5069–72.

Bitto E, McKay DB.Struktura krystalograficzna SurA, molekularnego chaperonu, który ułatwia fałdowanie poryn błony zewnętrznej. Struktura Fold Des. 200210:1489–98.

Saio T, Guan X, Rossi P, Economou A, Kalodimos CG. Strukturalne podstawy działania antyagregacyjnego białka opiekuńczego czynnika wyzwalającego. Nauki ścisłe. 2014344:1250494–4.

Huang C, Rossi P, Saio T, Kalodimos CG. Strukturalne podstawy działania przeciwfałdowego molekularnego białka opiekuńczego. Natura. 2016537:202–6.

Thoma J, Burmann BM, Hiller S, Müller DJ. Wpływ chaperonów holdazowych Skp i SurA na fałdowanie białek błony zewnętrznej β-beczki. Nat Struct Mol Biol. 201522:795–802.

Bitto E, McKay DB. Peryplazmatyczne białko opiekuńcze SurA wiąże motyw peptydowy, który jest charakterystyczny dla integralnych białek błony zewnętrznej. J Biol Chem. 2003278:49316–22.

Hennecke G, Nolte J, Volkmer-Engert R, Schneider-Mergener J, Behrens S. Opiekun peryplazmatyczny SurA wykorzystuje dwie cechy charakterystyczne dla integralnych białek błony zewnętrznej do selektywnego rozpoznawania substratu. J Biol Chem. 2005280:23540-8.

Jarchow S, Lück C, Görg A, Skerra A. Identyfikacja potencjalnych białek substratowych dla peryplazmatycznej Escherichia coli chaperone Skp. Proteom. 20088:4987–94.

Vertommen D, Ruiz N, Leverrier P, Silhavy TJ, Collet J-F. Charakterystyka roli peryplazmatycznego białka opiekuńczego Escherichia coli SurA przy użyciu proteomiki różnicowej. Proteom. 20099:2432–43.

Behrens S, Maier R, De Cock H, Schmid FX, Gross CA. Peryplazmatyczna PPIaza SurA pozbawiona domen parwulinowych działa in vivo i ma aktywność opiekuńczą. EMBO J. 200120:285-94.

Walton TA, Sandoval CM, Fowler CA, Pardi A, Sousa MC. Wnęka-opiekuna Skp chroni substrat przed agregacją, ale umożliwia niezależne fałdowanie domen substratu. Proc Natl Acad Sci USA. 2009106:1772–7.

Ha SC, Pereira JH, Jeong JH, Huh JH, Kim S-H. Oczyszczanie ludzkich czynników transkrypcyjnych Nanog i Sox2, każdy w kompleksie z Skp, peryplazmatycznym chaperonem Escherichia coli. Protein Expr Purif. 200967:164-8.

Entzminger KC, Chang C, Myhre RO, McCallum KC, Maynard JA. Chaperon Skp pomaga w fałdowaniu rozpuszczalnych białek in vitro poprzez hamowanie agregacji. Biochemia. 201251:4822–34.

He L, Sharpe T, Mazur A, Hiller S. Molekularny mechanizm rozpoznawania opiekuńczego-klienta. Nauka Przysł. 20162:e1601625–5.

Tafer H, Hiller S, Hilty C, Fernández C, Wüthrich K. Nielosowa struktura w białku błony zewnętrznej Escherichia coli rozwiniętej w moczniku X (OmpX). Biochemia. 200443:860-9.

Hiller S, Wider G, Imbach LL, Wüthrich K. Interakcje z klastrami hydrofobowymi w niesfałdowanym białku błonowym mocznika OmpX. Angew Chem Int Ed. 200847:977–81.

Krainer G, Gracia P, Frotscher E, Hartmann A, Gröger P, Keller S, et al. Powolna interkonwersja w heterogenicznym zespole w stanie rozwiniętym fosfolipazy błony zewnętrznej A. Biophys J. 2017113:1280-9.

Danoff EJ, Fleming KG. Rozpuszczalna, peryplazmatyczna domena OmpA fałduje się jako niezależna jednostka i wykazuje aktywność opiekuńczą poprzez zmniejszenie skłonności do samoasocjacji rozwiniętej transbłonowej beczki OmpA β. Biofizyka Chem. 2011159:194–204.

Noinaj N, Guillier M, Barnard TJ, Buchanan SK. Transportery zależne od TonB: regulacja, struktura i funkcja. Annu Rev Microbiol. 201064:43–60.

Lee J, Xue M, Wzorek JS, Wu T, Grabowicz M, Gronenberg LS i in. Charakterystyka zespołu zatrzymanego na maszynie montażowej β-beczki. Proc Natl Acad Sci USA 2016113:8717–22.

Duguay AR, Silhavy TJ. Kontrola jakości w peryplazmie bakteryjnej. Biochim Biophys Acta, Mol Cell Res. 20041694: 121–34.

Ruiz N, Silhavy TJ. Wyczuwanie stresu zewnętrznego: psy stróżujące otoczki komórkowej Escherichia coli. Curr Opin Mikrobiol. 20058:122–6.

Raivio TL. Wszystko, co stare, jest znowu nowe: aktualizacja aktualnych badań nad reakcją na stres otoczki Cpx. Biochim Biophys Acta. 20141843:1529–41.

Mecsas J, Rouviere PE, Erickson JW. Aktywność sigma E, indukowalnego ciepłem czynnika sigma Escherichia coli, jest modulowana przez ekspresję białek błony zewnętrznej. Geny Dev. 19937:2618–28.

Narita S-I, Masui C, Suzuki T, Dohmae N, Akiyama Y. homolog proteazy BepA (YfgC) promuje montaż i degradację białek błonowych β-beczki w Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 2013110:E3612-21.

Soltes GR, Martin NR, Park E, Sutterlin HA, Silhavy TJ. Szczególne role proteaz peryplazmatycznych w utrzymaniu niezbędnego zespołu białek błony zewnętrznej. J Bakteriol. 2017. doi: 10.1128/JB.00418-17.

Rassam P, Copeland NA, Birkholz O, Tóth C, Chavent M, Duncan AL i in. Zespoły supramolekularne wspierają obrót białek błony zewnętrznej bakterii. Natura. 2015523:333–6.

Kleanthous C, Rassam P, Baumann CG. Oddziaływania białko-białko a dynamika czasoprzestrzenna białek błony zewnętrznej bakterii. Curr Opin Struct Biol. 201535:109–15.

Powers ET, Powers DL, Gierasch LM. FoldEco: Model proteostazy w E. coli. Rep. komórki 20121:265-76.

Kim KH, Aulakh S, Paetzel M. Zewnętrzna bakteryjna błona zewnętrzna β-beczkowa maszyna montażowa. Białko Sci. 201221:751–68.

Ricci DP, Silhavy TJ. Maszyna Bam: molekularny bednarz. Biochim Biophys Acta Biomembr. 20121818:1067–84.

Rollauer SE, Sooreshjani MA, Noinaj N, Buchanan SK. Biogeneza białek błony zewnętrznej u bakterii Gram-ujemnych. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015370:20150023.

Plummer AM, Fleming KG. Od chaperonów do membrany z BAM! Trendy Biochem Sci. 201641:872–82.

Botos I, Noinaj N, Buchanan SK. Wprowadzenie białek i lipopolisacharydu do błony zewnętrznej bakterii. Phil Trans R Soc B. 2017372:20160224–9.

Noinaj N, Gumbart JC, Buchanan SK. Maszyna do montażu beczek β w ruchu. Nat Rev Micro. 201715:197–204.

Konovalova A, Kahne DE, Silhavy TJ. Biogeneza błony zewnętrznej. Annu Rev Microbiol. 201771:539–56.

Knowles TJ, Scott-Tucker A, Overduin M, Henderson IR. Architekci białek błonowych: rola kompleksu BAM w składaniu białek błony zewnętrznej. Nat Rev Micro. 20097:206–14.

Selkrig J, Leyton DL, Webb CT, Lithgow T. Montaż białek β-beczkowych w bakteryjnych błonach zewnętrznych. Biochim Biophys Acta. 20141843:1542–50.

Voulhoux R. Rola wysoce konserwatywnego białka bakteryjnego w tworzeniu białek błony zewnętrznej. Nauki ścisłe. 2003299:262–5.

Wu T, Malinverni J, Ruiz N, Kim S, Silhavy TJ, Kahne D. Identyfikacja wieloskładnikowego kompleksu wymaganego do biogenezy błony zewnętrznej u Escherichia coli. Komórka. 2005121:235–45.

Malinverni JC, Werner J, Kim S, Sklar JG, Kahne D, Misra R i in. YfiO stabilizuje kompleks YaeT i jest niezbędny do składania białek błony zewnętrznej u Escherichia coli. Mol Mikrobiol. 200661:151–64.

Sklar JG, Wu T, Kahne D, Silhavy TJ. Określenie ról peryplazmatycznych białek opiekuńczych SurA, Skp i DegP w Escherichia coli. Geny Dev. 200721:2473–84.

Bennion D, Charlson ES, Coon E, Misra R. Rozcięcie szlaków montażu białka błony zewnętrznej β-baryłki poprzez scharakteryzowanie mutantów BamA POTRA 1 Escherichia coli. Mol Mikrobiol. 201077:1153–71.

Lugtenberg EJ, Peters R. Dystrybucja lipidów w błonach cytoplazmatycznych i zewnętrznych Escherichia coli K12. Biochim Biophys Acta. 1976441:38–47.

De Cock H, Struyvé M, Kleerebezem M, van der Krift T, Tommassen J. Rola karboksy-końcowej fenyloalaniny w biogenezie białka błony zewnętrznej PhoE Escherichia coli K-12. J Mol Biol. 1997269:473-8.

Struyvé M, Moons M, Tommassen J. Karboksy-końcowa fenyloalanina jest niezbędna do prawidłowego montażu bakteryjnego białka błony zewnętrznej. J Mol Biol. 1991218:141-8.

Hagan CL, Wzorek JS, Kahne D. Hamowanie maszyny montażowej β-beczki przez peptyd wiążący BamD. Proc Natl Acad Sci USA 2015112:2011–6.

Albrecht R, Zeth K. Podstawy strukturalne biogenezy białek błony zewnętrznej u bakterii. J Biol Chem. 2011286:27792-803.

Robert V, Volokhina EB, Senf F, Bos MP, Van Gelder P, Tommassen J. Czynnik składania Omp85 rozpoznaje substraty białka błony zewnętrznej za pomocą specyficznego dla gatunku motywu C-końcowego. PLoS Biol. 20064:e377.

Danoff EJ, Fleming KG. Defekty błony przyspieszają fałdowanie białka β-baryłki zewnętrznej błony. Biochemia. 201554:97–9.

Noinaj N, Kuszak AJ, Balusek C, Gumbart JC, Buchanan SK. Boczne otwieranie i tworzenie porów wyjściowych są wymagane dla funkcji BamA. Struktura. 201422:1055–62.

Gruss F, Zähringer F, Jakob RP, Burmann BM, Hiller S, Maier T. Strukturalne podstawy translokacji autotransporterów przez TamA. Nat Struct Mol Biol. 201320:1318–20.

Han L, Zheng J, Wang Y, Yang X, Liu Y, Sun C i in. Struktura kompleksu BAM i jej implikacje dla biogenezy białek błony zewnętrznej. Nat Struct Mol Biol. 201623:192–6.

Mahoney TF, Ricci DP, Silhavy TJ. Klasyfikowanie podłoży montażowych β-beczki poprzez manipulowanie niezbędnymi elementami kompleksu Bam. J Bakteriol. 2016198: 1984-92.

Eichner T, Radford SE. Różnorodność mechanizmów składania generycznego fałdu amyloidowego. Mol komórki. 201143:8-18.

Kleinschmidt JH, Bulieris PV, Qu J, Dogterom M, den Blaauwen T. Asocjacja sąsiednich nici β białka błony zewnętrznej A w dwuwarstwach lipidowych ujawniona przez ukierunkowane wygaszanie fluorescencji. J Mol Biol. 2011407:316–32.

Schulz GE. Białka błonowe β-beczki. Curr Opin Struct Biol. 200010:443–7.

Sapra KT, Damaghi M, Köster S, Yildiz Ö, Kühlbrandt W, Müller DJ. Jedna spinka do włosów β po drugiej: badanie mechanicznych szlaków rozwijania transbłonowego białka β-beczki OmpG. Angew Chem Int Ed. 200948:8306-8.

Thoma J, Bosshart P, Pfreundschuh M, Müller DJ. Na zewnątrz, ale nie do środka: duże transbłonowe białko beczkowe β FhuA rozwija się, ale nie może się ponownie zwijać przez spinki do włosów β. Struktura. 201220:2185–90.

Ricci DP, Hagan CL, Kahne D, Silhavy TJ. Aktywacja maszyny do montażu β-beczek Escherichia coli (Bam) jest wymagana do prawidłowego współdziałania istotnych komponentów z podłożem. Proc Natl Acad Sci USA. 2012109:3487–91.

McCabe AL, Ricci D, Adetunji M, Silhavy TJ. Zmiany konformacyjne, które koordynują aktywność BamA i BamD, umożliwiające montaż beczek β. J. Bakteriol. 2017. doi: 10.1128/JB.00373-17.

Warner LR, Gatzeva-Topalova PZ, Doerner PA, Pardi A, Sousa MC. Elastyczność w peryplazmatycznej domenie BamA jest ważna dla funkcjonowania. Struktura. 201725:94–106.

Kim S, Malinverni JC, Sliz P, Silhavy TJ, Harrison SC, Kahne D. Struktura i funkcja podstawowego elementu maszyny do montażu białek błony zewnętrznej. Nauki ścisłe. 2007317:961–4.

Gatzeva-Topalova PZ, Walton TA, Sousa MC. Struktura krystaliczna YaeT: elastyczność konformacyjna i rozpoznawanie substratów. Struktura Fold Des. 200816:1873–81.

Rigel NW, Ricci DP, Silhavy TJ. Specyficzne dla konformacji znakowanie BamA i analiza supresora sugerują cykliczny mechanizm składania β-beczki w Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 2013110:5151–6.

Rigel NW, Schwalm J, Ricci DP, Silhavy TJ. BamE moduluje komponent maszyny do montażu beczek beta Escherichia coli, BamA. J Bakteriol. 2012194:1002-8.

Bernsteina HD. Wygląd może być mylący: ostatnie wglądy w mechanizm wydzielania białek przez szlak autotransportera. Mol Mikrobiol. 201597:205–15.

Ieva R, Bernstein HD. Interakcja domeny pasażera autotransportera z BamA podczas jego translokacji przez bakteryjną błonę zewnętrzną. Proc Natl Acad Sci USA. 2009106:19120-5.

Ieva R, Tian P, Peterson JH, Bernstein HD. Sekwencyjne i przestrzennie ograniczone oddziaływania czynników montażu z domeną β autotransportera. Proc Natl Acad Sci USA. 2011108:E383-91.

Rossiter AE, Leyton DL, Tveen-Jensen K, Browning DF, Sevastsyanovich Y, Knowles TJ i in. Do biogenezy autotransportera niezbędne są komponenty kompleksu maszyn do montażu beczek β, BamD i BamA. J Bakteriol. 2011193:4250–3.

Grijpstra J, Arenas J, Rutten L, Tommassen J. Wydzielanie autotransportera: zróżnicowanie tematyczne. Res mikrobiol. 2013164:562–82.

Albenne C, Ieva R. Kandydatki do pracy: role maszyn montażowych β-beczek oraz modułu translokacji i montażu w wydzielaniu autotransportera. Mol Mikrobiol. 2017106:505–17.

Bamert RS, Lundquist K, Hwang H, Webb CT, Shiota T, Stubenrauch CJ, et al. Podstawy konstrukcyjne doboru podłoża przez moduł translokacji i montażu maszyny montażowej β-beczka. Mol Mikrobiol. 2017106(1):142–56.

Geibel S, Procko E, Hultgren SJ, Baker D, Waksman G. Strukturalne i energetyczne podstawy transportu złożonego białka przez biletera FimD. Natura. 2014496:243–6.

Horne JE, Radford SE. Rosnący zestaw narzędzi technik do badania fałdowania i biogenezy białek błony zewnętrznej β-beczki. Biochem Soc Trans. 201644:802–9.

Hagn F, Etzkorn M, Raschle T, Wagner G. Zoptymalizowane dwuwarstwowe nanodyski fosfolipidowe ułatwiają określenie struktury białek błonowych w wysokiej rozdzielczości. J Am Chem Soc. 2013135:1919-25.

Pautsch A, Schulz GE. Struktura domeny błonowej OmpA o wysokiej rozdzielczości. J Mol Biol. 2000298:273-82.

Vandeputte-Rutten L, Kramer RA, Kroon J, Dekker N, Egmond MR, Gros P. Struktura krystaliczna proteazy błony zewnętrznej OmpT z Escherichia coli sugeruje nowe miejsce katalityczne. EMBO J. 200120:5033-9.

Barnard TJ, Dautin N, Lukacik P, Bernstein HD, Buchanan SK. Struktura autotransportera ujawnia rozszczepienie wewnątrz lufy, a następnie zmiany konformacyjne. Nat Struct Mol Biol. 200714:1214–20.

Snijder HJ, Ubarretxena-Belandia I, Blaauw M, Kalk KH, Verheij HM, Egmond MR i in. Strukturalne dowody na regulowaną przez dimeryzację aktywację integralnej fosfolipazy błonowej. Natura. 1999401:717–21.

Yildiz Ö, Vinothkumar KR, Goswami P, Kühlbrandt W. Struktura monomerycznej membrany zewnętrznej Poryn OmpG w konformacji otwartej i zamkniętej. EMBO J. 200625:3702-13.

van den Berg B, Czarny PN, Clemons WM, Rapoport TA. Struktura krystaliczna długołańcuchowego transportera kwasów tłuszczowych FadL. Nauki ścisłe. 2004304:1506-9.

Cowan SW, Garavito RM, Jansonius JN, Jenkins JA, Karlsson R, König N, et al. Struktura poryny OmpF w postaci kryształu tetragonalnego. Struktura Fold Des. 19953:1041-50.

Schirmer T, Keller TA, Wang YF, Rosenbusch JP. Strukturalna podstawa translokacji cukru przez kanały maltoporyny przy rozdzielczości 3,1 A. Nauki ścisłe. 1995267:512–4.

Locher KP, Rees B, Koebnik R, Mitschler A, Moulinier L, Rosenbusch JP, et al. Sygnalizacja transbłonowa poprzez receptor FhuA bramkowany ligandem: struktury krystaliczne stanów wolnych i związanych z ferrichromem ujawniają zmiany allosteryczne. Komórka. 199895:771–8.

Phan G, Remaut H, Wang T, Allen WJ, Pirker KF, Lebedev A, et al. Struktura krystaliczna łącznika FimD związanego z jego pokrewnym podłożem FimC–FimH. Natura. 2011474:49–53.

Qiao S, Luo Q, Zhao Y, Zhang XC, Huang Y. Podstawa strukturalna do wstawiania lipopolisacharydów w bakteryjną błonę zewnętrzną. Natura. 2014511:108–11.

O’Neil PK, Rollauer SE, Noinaj N, Buchanan SK. Montaż elementów zespołu maszyn do montażu beczek β. Biochemia. 201554:6303-11.

Ferguson AD, Ködding J, Walker G, Bos C, Coulton JW, Diederichs K, et al. Aktywny transport pochodnej antybiotyku ryfamycyny przez białko błony zewnętrznej FhuA. Struktura Fold Des. 20019:707-16.

Baker NA, wrzesień D, Joseph S, Holst MJ, McCammon JA. Elektrostatyka nanosystemów: zastosowanie do mikrotubul i rybosomu. Proc Natl Acad Sci USA. 200198:10037–41.

Hwang PM, Choy W-Y, Lo EI, Chen L, Forman-Kay JD, Raetz CRH i in. Struktura roztworu i dynamika enzymu błony zewnętrznej PagP metodą NMR. Proc Natl Acad Sci USA 200299:13560-5.

Fiser A, Do RK, Sali A. Modelowanie pętli w strukturach białkowych. Białko Sci. 20009:1753-73.

Bischoff L, Wickles S, Berninghausen O, van der Sluis EO, Beckmann R. Wizualizacja wielotopowego białka błonowego podczas insercji błony za pośrednictwem SecY. Społeczność Nat. 20145:4103.

Walton TA, Sousa MC. Struktura krystaliczna Skp, chaperonu podobnego do prefoldyny, który chroni białka rozpuszczalne i błonowe przed agregacją. Mol komórki. 200415:367–74.

Schrödingera, LLC. System grafiki molekularnej PyMOL, wersja 1.8. 2015. https://pymol.org.

Walsh NP, Alba BM, Bose B, Gross CA, Sauer RT. Sygnały peptydu OMP inicjują odpowiedź na stres otoczki poprzez aktywację proteazy DegS poprzez złagodzenie inhibicji, w której pośredniczy jej domena PDZ. Komórka. 2003113:61–71.

Merdanovic M, Clausen T, Kaiser M, Huber R, Ehrmann M. Kontrola jakości białka w peryplazmie bakterii. Annu Rev Microbiol. 201165:149-68.

Krojer T, Sawa J, Schäfer E, Saibil HR, Ehrmann M, Clausen T. Podstawa strukturalna regulowanej proteazy i funkcji opiekuńczej DegP. Natura. 2008453:885–90.

Humphrey W, Dalke A, Schulten K. VMD: wizualna dynamika molekularna. Wykres J Mola. 199614:33-8-27-8.

Silhavy TJ, Kahne D, Walker S. Otoczka komórek bakteryjnych. Cold Spring Harb Perspect Biol. 20102:a000414–4.

Du D, Wang Z, James NR, Voss JE, Klimont E, Ohene-Agyei T, et al. Budowa pompy wielolekowej AcrAB-TolC. Natura. 2014509:512–5.

Matias VRF, Al-Amoudi A, Dubochet J, Beveridge TJ. Kriotransmisyjna mikroskopia elektronowa zamrożonych i uwodnionych skrawków Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa. J Bakteriol. 2003185:6112–8.


STRESZCZENIE

Metanoaricia dendrobranchiata Blake (Polychaeta Orbiniidae) występuje licznie w powiązaniu ze zbiorowiskami małży Batymodiolus childressi przy wyciekach węglowodorów na stoku Luizjany w Zatoce Meksykańskiej. Jej mikrośrodowisko może być silnie niedotlenione (tlen jest często niewykrywalny) i siarczkowe (stężenia siarczków mogą osiągnąć poziom milimolowy), co może poważnie zaszkodzić metabolizmowi tlenowemu. Opisujemy zestaw adaptacji do jego środowiska o niskiej zawartości tlenu. Robaki są w stanie regulować tempo zużycia tlenu do ciśnienia parcjalnego około 870 Pa tlenu.Ta zdolność koreluje z dużą powierzchnią skrzelową, małą odległością dyfuzji z wody morskiej do krwi, bardzo wysokim powinowactwem hemoglobiny do tlenu (P50=27,8 Pa w 10°C i pH 7,6) oraz efekt Bohra, który jest wyraźny przy wysokim nasyceniu tlenem. W pełni nasycona hemoglobina wiąże wystarczającą ilość tlenu tylko przez 31 minut metabolizmu tlenowego. Jednak te wieloszczety mogą wytrzymać dłuższe okresy anoksji zarówno w przypadku braku, jak i obecności 1 mmol -1 siarczku (TL50=ok. odpowiednio 5,5 i 4 dni).


Materiały i metody

Szacowanie prawdopodobieństw P(ΛD)

Aby oszacować wielkości termodynamiczne PD) w modelu jawno-łańcuchowym zdefiniowanym przez funkcję energii mi0 w Równaniu 1 stosujemy następującą strategię obliczeniową: Funkcja energii pomocniczej miλ=mi0mistronniczość służy do obliczania dwuwymiarowych histogramów prawdopodobieństwa Pλi (nD, mistronniczość), gdzie nD jest liczbą natywnych kontaktów odległych od sekwencji, dla serii K dyskretnych sił odchylenia λ1, …, λK. Maksymalna siła polaryzacji, λK, dobiera się tak, aby istniała znaczna populacja rodzimego stanu topomeru w tym λ, a mianowicie, PD)>gt10-4. Histogramy te można następnie połączyć za pomocą standardowej techniki ponownego ważenia histogramów (Ferrenberg i Swendsen 1989) w celu uzyskania lepszych szacunków Pλ(nD, mistronniczość), dla dowolnego λ. Stąd, używając λ=0 w tej procedurze ponownego ważenia otrzymujemy P0(nD, mistronniczość), z którego pożądane prawdopodobieństwo P0D)=PD) można łatwo obliczyć.

Powyższa strategia pobierania próbek jest prosta. W zasadzie, gdyby możliwe było próbkowanie nieskończone, wynik powinien być niezależny od konkretnego wyboru potencjału obciążenia. W praktyce jednak należy zachować ostrożność, aby próbkowanie natywnego stanu topomeru było reprezentatywne. Dlatego konstruujemy mistronniczość nie jako funkcja wszystkich n Cα pozycje Cα łańcuch, ale tylko z podzbioru Cα stanowiska, które są zaangażowane w ΛD natywne kontakty odległe od sekwencji zgodnie z definicją TSM. Ta funkcja odchylenia składa się z „skręcania” i terminu kontaktowego:

gdziek są kątami skręcania utworzonymi przez cztery kolejne Cα pozycje w podzbiorze zdefiniowanym przez TSM, oraz ϕ′k n odpowiednie wartości w natywnej strukturze pdb. Pierwsze podsumowanie dotyczy wszystkich takich kątów skręcania. Drugie podsumowanie dotyczy wszystkich kontaktów natywnych kl (r n kl<rC), dla których zarówno k, jak i l są częścią podzbioru C . określonego przez TSMα stanowiska.

Otrzymujemy dwuwymiarowe rozkłady prawdopodobieństwa Pλi (nD, mistronniczość) metodą parametrów dynamicznych ściśle powiązaną z symulowanym odpuszczaniem (Lyubartsev i in. 1992 Marinari i Parisi 1992 Irbäck i Potthast 1995 ). W symulowanym odpuszczaniu przestrzeń konfiguracyjna systemu zostaje poszerzona o temperaturę, która staje się parametrem dynamicznym. Tutaj zamiast tego pozwalamy, aby parametr odchylenia λ stał się parametrem dynamicznym. Używamy ośmiu różnych wartości oddzielonych liniowo (K=8) od λ1=0 do λK. Zastosowane maksymalne odchylenie, λK, waha się od 1,15 (dla 1 aps i jaC=4 i rC=8 Å) do 8,0 (dla 1 lb i jaC=12 i rC=6 Å). Próbkowanie konformacyjne odbywa się za pomocą dynamiki Langevina, dokładnie tak jak poprzednio dla symulacji z ograniczeniami łańcuchów i zmian między sąsiednimi λi wartości są wykonywane jako elementarne ruchy Monte Carlo. Częste wizyty w λ1=0 skutecznie dekorelacji wygenerowanej sekwencji konformacji i poprawia pobieranie próbek. Dla każdego jaC oraz rC w tabeli 4 symulacja z czasem próbkowania 109 wykonuje się kroki, aby uzyskać osiem P(nD, mistronniczość) histogramy, które są następnie łączone w celu uzyskania odpowiedniego PD) wartość. Jako przykład pokazujemy na rysunku 9 rozkłady krańcowe P(mistronniczość) uzyskany z jednej z tych symulacji, pokazujący, że wystarczające nakładanie się między sąsiednimi mistronniczość rozkłady są uzyskiwane pomimo stosunkowo nielicznych λi używane wartości. Każda symulacja jest inicjowana z nieuporządkowanej konformacji. Zauważamy, że zastosowana tutaj metoda parametrów dynamicznych dobrze współpracuje z techniką ponownego ważenia histogramu, ponieważ zapewnia swobodne energie przy każdym wybranym λi (tzw. parametry g), które są potrzebne do uzyskania spójnego rozwiązania równań z wielokrotnym ważeniem histogramu (Ferrenberg i Swendsen 1989 ).


Obejrzyj wideo: Free Energy, Darmowa Energia, Tesla, Magnetic Power, Magnetic Fan (Sierpień 2022).