Informacja

8.7: Ekstrakcja DNA komórek policzka – biologia

8.7: Ekstrakcja DNA komórek policzka – biologia



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Korzystanie z Cytobrush

  1. Użyj sterylnej cytoszczoteczki i włóż do ust.
  2. Posmaruj cytoszczoteczką wewnętrzną stronę policzka 25 razy.
  3. Zamieszać cytoszczotką w 100 μl zawiesiny Chelex (10% w/v).
  4. Umieścić probówkę wirówkową z Chelexem i zawiesiną komórek na bloku grzejnym o temperaturze 100°C na 10 minut.
  5. Wiruj probówki z maksymalną prędkością przez 5 minut.
  6. DNA jest w supernatancie. Unikaj koralików na dole.
  7. Przechowuj DNA w temperaturze -20 °C.

PCR z perełkami PCR

  1. Dodaj 22 μl mieszanki starterów (do przodu i do tyłu) do kulek.
  2. Upewnij się, że koralik się rozpuścił.
  3. Dodać 3 μl DNA.

8.7: Ekstrakcja DNA komórek policzka – biologia

Ekstrakcja DNA z komórek policzkowych

adaptacja Roxane Bonner

Laboratorium Systematyki Molekularnej i Ewolucji University of Arizona

1. Energicznie popijać 15 ml Gatorade w ustach przez 30 sekund.

2. Gryź w policzki podczas machania, aby uzyskać jak najwięcej komórek.

3. Pamiętaj: więcej komórek = więcej DNA. Wrzuć Gatorade z powrotem do kubka, a następnie wlej go do nowej plastikowej probówki o pojemności 15 ml.

4. Oznacz probówkę i wieczko swoimi inicjałami. Znajdź partnera i upewnij się, że każda z Twoich probówek ma taką samą objętość.

5.Dodaj więcej Gatorade, jeśli to konieczne, aby wyrównać objętości. Umieść probówki naprzeciwko siebie w wirówce.

6. Wiruj probówki na wysokich obrotach przez 3-5 minut, aby zebrać komórki na dnie probówki.

7. Wlej płyn do pojemnika na odpady. Powtórz kroki #1-4.

8. Wlej Gatorade/Spit z drugiego płynu do płukania ust do probówki z komórkami z pierwszego płynu do płukania ust.

9. Dodaj 2,0 ml buforu do lizy do osadu komórek. Wymieszać, ostrożnie strzepując tubkę. OPCJONALNY .

10. Dodaj 50 (l Proteinazy K (patrz nauczyciel). Przekręć probówkę, aby rozbić osad komórek.

11. Inkubuj komórki w 65-70°C przez co najmniej godzinę, najlepiej przez noc. Przed kontynuowaniem roztwór powinien być klarowny, a komórki nie powinny być widoczne.

12. Dodaj 1,0 ml 5M NaCl. Dobrze wymieszaj, a następnie wiruj przez 10 minut z dużą prędkością.

13.Przenieść płyn do nowej probówki 15 mL. Nie pozwól, aby rzeczy na dnie wpadły do ​​nowej tuby. W razie potrzeby użyj czystej pipety, aby przenieść tylko płyn.

14. Dodaj 4 ml zimnego 95% etanolu do płynu w nowej probówce.

15. Dobrze wymieszaj, delikatnie kołysząc probówką w przód iw tył, aż DNA stanie się widoczne. Powinien wyglądać jak drobne białe włókna lub kłaczki.

Ekstrakcja DNA z komórek policzka Wskazówki:

Odpowiedz na wszystkie pytania pełnymi zdaniami.

1. Jak zebraliśmy osady komórkowe z płynu do płukania ust?

2. Dlaczego niektórzy ludzie mają większe granulki komórek niż inni?

3. Dlaczego po wyjęciu probówek z kąpieli wodnej nie widzimy osadu komórek?

4. Jaki był cel każdego z poniższych elementów?

  • Odwirować
  • Bufor do lizy i detergent do lizy
  • Kąpiel wodna i podgrzewanie wzmacniacza
  • Chlorek Sodu (NaCl)
  • Etanol

5. Pokaż, gdzie znajdują się tłuszcze, węglowodany, białka i DNA na każdym z kolejnych etapów.


Biologia OER

Cytobrush to mały pędzelek tradycyjnie używany do wykonywania testów na wymaz. Są sterylne i wygodne do jednorazowego użycia wewnątrz policzka jamy ustnej. Pędzle wiruje się w roztworze kulek Chelex tak, aby zawarte w roztworze czynniki chelatujące neutralizowały działanie dwuwartościowych kationów w celu ochrony DNA. Umieszczenie tych probówek z ogniwami i Chelexem na wrzącym bloku grzejnym ma na celu sterylizację roztworu w celu zapewnienia bezpiecznych warunków pracy. Alternatywą dla tego zastosowania Chelex jest umieszczenie komórek w buforze do lizy, który rozerwie komórki i ochroni DNA.

  1. Użyj sterylnej cytoszczoteczki i włóż ją do ust
  2. wyszczotkuj cytoszczoteczkę po wewnętrznej stronie policzka 25 razy
  3. Zawirować cytoszczotkę w 100 µl zawiesiny Chelex (10% w/v) lub buforu do lizy zawierającego EDTA
  4. Umieść probówkę wirówkową z Chelexem i zawiesiną komórek na bloku grzejnym 100 °C na 10 minut
  5. Wiruj probówki z maksymalną prędkością przez 5 minut
  6. DNA jest w supernatancie. (unikaj koralików na dole)
  7. Przechowuj DNA w -20 ° C

2. Wytrącanie DNA

Po rozbiciu błon komórkowych i jądrowych cząsteczki lipidów muszą zostać usunięte. Technik laboratoryjny dodaje wysoce stężony roztwór soli. Powoduje to wytrącanie się detergentu i innych szczątków komórkowych, takich jak białka. Wytrącanie oznacza tworzenie ciała stałego, które oddziela się od roztworu.

DNA pozostaje rozpuszczone w płynnym roztworze. Można go usunąć z resztek komórkowych przez wirowanie. Podczas wirowania płynny roztwór wiruje z dużą prędkością, tak że osad gromadzi się w postaci peletki na dnie probówki. DNA, które wciąż jest rozpuszczone w cieczy, można przenieść do nowej probówki. Alternatywnie osad można odfiltrować z roztworu. W ten sposób pozostaje płyn zawierający DNA.

DNA w jądrze jest owinięte wokół białek zwanych histony. Pomaga to uporządkować DNA w chromosomy. Aby usunąć białka histonowe, a proteaza można dodać. Proteaza to enzym rozkładający białka.


Ekstrakcja DNA z komórek policzkowych

Ekstrakcja DNA z komórek policzkowych
Gene Smith
29 lutego 2013
WPROWADZANIE
DNA, kwas dezoksyrybonukleinowy, jest materiałem genetycznym każdego żywego organizmu i znajduje się w jądrze komórek eukariotycznych. DNA jest często nazywane „planem życia”, ponieważ zawiera informacje niezbędne do przeprowadzenia wszystkich żywych procesów komórki (1). Celem tego laboratorium było wyodrębnienie DNA z ludzkich komórek policzkowych. Wyizolowane DNA można wykorzystać do mapowania lub sekwencjonowania, PCR, dochodzenia w miejscu przestępstwa lub innych dalszych zastosowań(2). MATERIAŁY I METODY

Aby wyekstrahować DNA z komórek policzkowych, do oznakowanej 15 ml probówki dodano 3 ml wody. Wewnętrzna wyściółka policzka była następnie żuta przez około 30 sekund. 3 ml wody użyto do płukania ust przez 30 sekund, po czym woda i komórki policzkowe zostały usunięte z powrotem do 15 ml probówki. Za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia dodano 2 ml buforu do lizy do probówki zawierającej wodę z komórkami policzkowymi. Probówkę następnie zamknięto i delikatnie odwrócono 5 razy w celu lizy komórek. Do próbki dodano pięć kropli proteazy i roztworu soli. Probówkę zamknięto i odwrócono 5 razy. Próbkę inkubowano w łaźni wodnej w 50°C przez 10 minut. Po inkubacji powoli dodano 10 ml zimnego etanolu, trzymając probówkę pod kątem 45°. Probówkę umieszczono pionowo w temperaturze pokojowej na pięć minut, po czym próbkę odwrócono 5 razy. Protokół ekstrakcji DNA oraz wszystkie materiały i odczynniki dostarczyła firma Bio-Rad(2). WYNIKI

W trakcie eksperymentu prowadzono liczne obserwacje. Woda zawierająca komórki policzkowe miała wygląd biały lub mętny. Po dodaniu buforu do lizy i proteazy roztwór stał się klarowny. Po dodaniu zimnego etanolu widoczny był biały osad. DYSKUSJA

Ekstrakcja DNA z komórek jest stosunkowo prostym i prostym procesem. Jest rutynowo przeprowadzany w laboratoriach i ma wiele dalszych zastosowań.


Czego potrzebujesz do ekstrakcji DNA:

Co robisz:

1. Przygotuj roztwór soli w zlewce, dodając dwie laboratoryjne miarki soli do około 25 ml wody destylowanej. Mieszaj, aż sól całkowicie się rozpuści.

2. Wlej słoną wodę do papierowego kubka.

3. Nie połykając, wypij łyk roztworu z papierowego kubka i potrząsaj nim w tę i z powrotem przez co najmniej 30 sekund, od czasu do czasu drapiąc zębami po wewnętrznej stronie policzków. Najlepiej zrobić to z czystymi ustami, czyli nie zaraz po obiedzie.

4. Wypluj płyn do płukania ust z powrotem do kubka. Następnie zagnij kubek w rodzaj dziobka i wlej roztwór do płukania ust do probówki, aż wypełni około pół cala dna probówki.

5. Ostrożnie dodaj dwie krople mydła w płynie.

6. Przechylając probówkę o około 45 stopni, za pomocą pipety (lub zakraplacza na butelce z alkoholem) dodaj 20 kropli schłodzonego alkoholu tak, aby zsunął się w dół probówki bez naruszania roztworu. Ponieważ jest mniej gęsty, alkohol znajdzie się na płynie do płukania jamy ustnej i roztworze mydła.

7. Mocno załóż nakrętkę na probówkę i bardzo powoli i delikatnie przechyl ją trzy razy do góry nogami, a następnie prawą stroną do góry. Zrób to ostrożnie, aby nie tworzyć bąbelków.

8. Pozostaw probówkę w pozycji pionowej na jedną minutę. W tym momencie powinieneś zacząć widzieć mlecznobiałą nić, prawdopodobnie przeplataną bąbelkami, pojawiającą się między roztworem a alkoholem. To jest Twoje DNA! Po kilku minutach DNA powinno zostać zawieszone w warstwie alkoholowej.

9. Jeśli chcesz, włóż szpikulec lub mieszadełko do probówki i delikatnie nawiń wokół niej DNA.

10. Aby go uratować, ostrożnie zeskrob go do małej fiolki z kilkoma kroplami alkoholu. Przechowywane w zamrażarce, możesz przechowywać swoje DNA niemal w nieskończoność!


Krok 1. Rozbicie komórek w celu uwolnienia DNA

Komórki w próbce są oddzielane od siebie, często za pomocą środków fizycznych, takich jak mielenie lub worteksowanie, i umieszczane w roztworze zawierającym sól. Dodatnio naładowane jony sodu w soli pomagają chronić ujemnie naładowane grupy fosforanowe, które biegną wzdłuż szkieletu DNA.

Następnie dodaje się detergent. Detergent rozkłada lipidy w błonie komórkowej i jądrach komórkowych. DNA jest uwalniane, gdy te błony są rozrywane.

Krok 2. Oddzielenie DNA od białek i innych resztek komórkowych

Aby uzyskać czystą próbkę DNA, konieczne jest usunięcie jak największej ilości resztek komórkowych. Można to zrobić różnymi metodami. Często proteaza (enzym białkowy) jest dodawana w celu degradacji białek związanych z DNA i innych białek komórkowych. Alternatywnie, niektóre szczątki komórkowe można usunąć przez filtrowanie próbki.

Krok 3. Wytrącanie DNA alkoholem

Na koniec do próbki DNA ostrożnie dodaje się lodowaty alkohol (albo etanol albo izopropanol). DNA jest rozpuszczalny w wodzie, ale nierozpuszczalny w obecności soli i alkoholu. Delikatnie mieszając warstwę alkoholu sterylną pipetą, osad staje się widoczny i można go odgarnąć. Jeśli jest dużo DNA, możesz zobaczyć żylasty, biały osad.

Krok 4. Czyszczenie DNA

Próbkę DNA można teraz poddać dalszemu oczyszczeniu (oczyszczeniu). Następnie jest ponownie zawieszany w lekko zasadowym buforze i gotowy do użycia.

Krok 5. Potwierdzenie obecności i jakości DNA

W dalszej pracy laboratoryjnej ważne jest poznanie stężenia i jakości DNA.

Odczyty gęstości optycznej wykonane przez spektrofotometr można wykorzystać do określenia stężenia i czystości DNA w próbce. Alternatywnie można użyć elektroforezy żelowej do wykazania obecności DNA w próbce i wskazania jego jakości.


Obejrzyj wideo: Izolacja DNA z truskawki - warsztaty dla uczniów organizowane przez WIMiC (Sierpień 2022).