Informacja

Klonowanie molekularne- endonukleazy restrykcyjne tępych końców

Klonowanie molekularne- endonukleazy restrykcyjne tępych końców



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pracuję w laboratorium mikrobiologicznym, gdzie dużo klonujemy. Zawsze używałem endonukleaz restrykcyjnych do cięcia DNA tak, aby końce były lepkie, a nie tępe. Obecnie pracuję nad projektem, który sugeruje użycie enzymu restrykcyjnego tępych końców, takiego jak EvoRV, a następnie przeprowadzenie ogonowania T plazmidu p14440. Moje pytanie brzmi: dlaczego nie traktuję insertu pcr'd skrótem restrykcyjnym, tak jak plazmid, jak sugeruje protokół? Skąd mam wiedzieć, że wstawka ma końce zdolne do ligacji z plazmidem, jeśli nie zaprojektuję miejsc restrykcyjnych w starterach?


Aby dowiedzieć się, czy końce są kompatybilne, zobacz kompatybilne końce kohezyjne (izoschizomery) na stronie internetowej NEB.

Jeśli nie masz pewności, wykonaj podwiązanie na tępe końce. Za stępienie lepkiego końca (z komentarzy):

Użyj polimerazy Klenowa lub Pfu (lub dowolnej polimerazy z korektą/wysokiej wierności).

Możesz użyć Taq, jeśli zamierzasz klonować TA.


Podstawy enzymów restrykcyjnych

Gdzie byłyby współczesne badania biologii molekularnej bez enzymów restrykcyjnych? Te konie robocze laboratorium od ponad 40 lat stoją za wieloma postępami w podstawowych badaniach biologicznych i zastosowaniach komercyjnych. Enzymy restrykcyjne (lub endonukleazy restrykcyjne) zostały po raz pierwszy zidentyfikowane w bakteriach, ale zostały później znalezione w niektórych archeonach. Ogólnie enzymy restrykcyjne rozszczepiają dwuniciowy DNA. Każdy enzym restrykcyjny rozpoznaje określone sekwencje DNA, a cięcie może nastąpić w obrębie sekwencji rozpoznawanej lub w pewnej odległości, w zależności od enzymu. Rozpoznawane sekwencje mają zazwyczaj długość od 4 do 8 par zasad (pz), a rozszczepienie może prowadzić do powstania lepkich końców (końce wystające 5′ lub 3′) lub tępych końców (Rysunek 1).

Rysunek 1. Lepkie lub wystające końce (5′ lub 3′) lub tępe końce wytwarzane przez określone enzymy restrykcyjne.

Obecnie scharakteryzowano około 4000 enzymów restrykcyjnych, a ponad 600 z nich jest dostępnych w handlu. REBASE jest użytecznym, możliwym do przeglądania źródłem wyczerpujących i aktualnych informacji na temat enzymów restrykcyjnych, w tym specyficzności, czułości i źródeł komercyjnych [1].

Na tej stronie:


Klonowanie molekularne - endonukleazy restrykcyjne tępych końców - Biologia

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) może być stosowana do szybkiego generowania fragmentów DNA do klonowania, pod warunkiem, że istnieje odpowiednie źródło matrycy DNA i znane są wystarczające informacje o sekwencji, aby umożliwić zaprojektowanie starterów specyficznych dla pożądanego amplikonu. W przeciwieństwie do tradycyjnego klonowania, PCR oferuje możliwość łatwego klonowania fragmentów DNA, których może być niewielka ilość w złożonej próbce, takiej jak genomowy DNA lub cDNA, które odpowiadają rzadkim transkryptom mRNA. Produkty PCR mogą być trawione i ligowane tradycyjnymi metodami, ligowane bezpośrednio (końce tępe lub TA) lub używane w klonowaniu niezależnym od ligacji (LIC) lub w aplikacjach klonowania bezszwowego, takich jak Gibson Assembly ® lub NEBuilder HIFI DNA Assembly (NEBuilderHiFi.com).

Podczas typowej reakcji PCR matryca DNA (zawierająca interesujący region) jest mieszana z deoksynukleotydami (dNTP), polimerazą DNA i starterami. Startery są krótkimi segmentami komplementarnego DNA, które parują zasad z matrycowym DNA, powyżej interesującego regionu i służą jako miejsca rekrutacji polimerazy. PCR obejmuje serię cykli temperaturowych, które są kontrolowane automatycznie za pomocą termocyklera, który precyzyjnie kontroluje zarówno temperaturę reakcji, jak i czas trwania każdego etapu temperatury, zapewniając wydajną amplifikację (więcej szczegółów na temat PCR można znaleźć w rozdziale Amplifikacja DNA).

Do rutynowych, solidnych reakcji PCR JedenTaq Najczęstszym enzymem jest polimeraza DNA. Ta polimeraza pozostawia głównie niezależne od matrycy pojedyncze adeniny (A) na końcu 3' produktu PCR. W przypadku PCR o wysokiej wierności należy zastosować polimerazę DNA z korektą. Takie enzymy nie tworzą pojedynczych nawisów zasad, pozostawiając tępe końce. Uwzględnienie końców produktów PCR, w tym ich statusu fosforylacji, jest ważne dla kolejnych strategii klonowania (patrz Modyfikacja końców). Gdy startery PCR zawierają miejsca dla enzymów restrykcyjnych, produkty PCR mogą być trawione i ligowane tradycyjnymi sposobami.

Cząsteczki wektorowe do klonowania można również wytworzyć metodą PCR. Miejsca restrykcyjne zawarte w starterach umożliwiają generowanie lepkich końców (wystających pojedynczych nici) w celu ułatwienia klonowania fragmentów restrykcyjnych. W przeciwnym razie wektor z tępymi końcami można wytworzyć metodą PCR przy użyciu polimerazy korekcyjnej o wysokiej wierności lub przez stępienie nawisu pojedynczej zasady 3&rsquo wytworzonego przez Taq polimeraza. Odwrotna transkrypcja RNA do pierwszej nici komplementarnego DNA (cDNA), a następnie PCR (RT-PCR) umożliwia klonowanie dwuniciowych cząsteczek DNA, które odpowiadają transkryptom genów (dla mRNA, patrz synteza cDNA).

Wybierz typ:

Artykuły fabularne

Przeczytaj o związku między strukturą a funkcją polimerazy podczas kopiowania DNA.


Strategie klonowania, część 3: Klonowanie tępych końców

Klonowanie tępych końców jest jedną z najłatwiejszych i najbardziej wszechstronnych metod klonowania dsDNA do wektorów plazmidowych. Jest to łatwe, ponieważ wkładka z tępym zakończeniem wymaga niewielkiego lub żadnego przygotowania. Przeczytaj przegląd klonowania tępych końców ze wskazówkami, jak sprawić, by to podejście do klonowania było skuteczne.

Klonowanie cząsteczek dwuniciowego DNA (dsDNA) do wektorów plazmidowych jest jedną z najczęściej stosowanych technik w biologii molekularnej. Procedura służy do sekwencjonowania, budowania bibliotek cząsteczek DNA, ekspresji kodującego i niekodującego RNA oraz wielu innych zastosowań. Wcześniejsze artykuły DECOD, dostępne online pod adresem www.idtdna.com/DECODED, zawierały przegląd metody Gibson Assembly&trade oraz technik klonowania kohezyjnego końca. Znajdziesz tam również dodatkowe informacje na temat podstaw plazmidów w artykule: Strategie klonowania, Część 2: Klonowanie kohezyjne, co może być korzystne dla czytelników tego artykułu. Tutaj omówimy klonowanie tępych końców jako trzecią metodę, dzięki której fragmenty DNA mogą być wklonowane do wektora plazmidowego.

Omówienie klonowania tępego końca

Klonowanie tępych końców obejmuje ligację dsDNA z plazmidem, w którym zarówno wstawka, jak i linearyzowany plazmid nie mają wystających zasad na swoich końcach. Nie korzysta ze stabilizacji wiązań wodorowych związanej z komplementarnymi wystającymi zasadami stosowanymi w klonowaniu o kohezyjnym końcu, ale przejściowe asocjacje dostępnych 5&rsquo grup fosforanowych i 3&rsquo grup hydroksylowych są wystarczające do wytworzenia udanych klonów w obecności ligazy T4 [1] . Ilustracja podstawowego eksperymentu klonowania tępych końców jest pokazana na rycinie 1.

Klonowanie tępych końców jest również jedną z najłatwiejszych i najbardziej wszechstronnych metod klonowania dsDNA do wektorów plazmidowych. Jest to łatwe, ponieważ wstawka z tępymi końcami wymaga niewielkiego lub żadnego przygotowania, co pozwala uniknąć trawienia enzymatycznego i późniejszego oczyszczania potrzebnego do klonowania z kohezyjnymi końcami. Jest wszechstronny, ponieważ wstawka i wektor mają mniej ograniczeń sekwencji niż inne metody. Oznacza to, że klonowanie tępych końców ma pewne unikalne zalety, a także wady w porównaniu z klonowaniem kohezyjnym i metodami montażu izotermicznego.

Rozważania

Istnieje kilka czynników, które sprawiają, że klonowanie tępych końców stanowi wyzwanie. Jest 10&ndash100X mniej wydajne niż klonowanie kohezyjne, co skutkuje mniejszą liczbą kolonii, a połowa tych zrekombinowanych kolonii ma wstawki wstawione w złej orientacji. Ponadto dochodzi do dużej recyrkulacji plazmidu. Można go zmniejszyć, ale nie jest łatwo go wyeliminować, co skutkuje wieloma pustymi wektorami. Dlatego stosując tę ​​metodę, przed weryfikacją sekwencji należy przeprowadzić badanie przesiewowe przez trawienie restrykcyjne lub PCR.

Główną zaletą klonowania tępych końców jest to, że pożądana wstawka nie wymaga żadnych miejsc restrykcyjnych w sekwencji. To sprawia, że ​​klonowanie tępych końców jest niezwykle wszechstronne, upraszcza planowanie i pozwala uniknąć niechcianych, sztucznych dodawania sekwencji, które mogą niekorzystnie wpłynąć na niektóre aplikacje. Ponadto, ponieważ wstawka nie musi być przygotowywana przez trawienie restrykcyjne, klonowanie tępych końców może być znacznie szybsze.

Wskazówki dotyczące udanych podwiązań tępych

Przygotowanie wektora. Wektor można przygotować przez trawienie, jeśli miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) zawiera miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny, który wytwarza tępe końce, taki jak EcoRV (Figura 1). Można również użyć miejsc z ograniczeniami, które generują nawisy sekwencji, a następnie usunąć lub wypełnić nawisy, aby utworzyć tępe końce. Takie podejście nie jest jednak zalecane, ponieważ nie ma dobrej metody oceny powodzenia stępionej reakcji, co utrudnia rozwiązywanie nieudanych reakcji.

Alternatywnie, linearyzowany plazmid można przygotować do klonowania z tępymi końcami przez amplifikację z użyciem polimerazy o wysokiej wierności, a następnie PCR z użyciem starterów zaprojektowanych z ich końcami 5' w żądanym miejscu insercji. Linearyzowany produkt plazmidowy pojawia się jako odrębny prążek na żelu agarozowym, w porównaniu z rozmazem wytworzonym przez superskręcony szablon plazmidu, ułatwiając rozwiązywanie problemów. Okrągły plazmid matrycowy jest eliminowany przez trawienie DpnI lub podobnym enzymem restrykcyjnym, który tnie zmetylowany plazmid pozostawiając niezmetylowany produkt PCR

Plazmid jest zazwyczaj defosforylowany do metod ligacji i amplifikacji. Można jednak uniknąć tego wymogu (patrz alternatywa poniżej).

Projektowanie wkładki. Wstawka z tępymi końcami musi być fosforylowana. Jeśli planujesz wygrzewać oligonukleotydy lub użyć IDT gBlocks i fragmentów genów reg jako wstawki, pamiętaj, że nie są one syntetyzowane z 5 grupami fosforanowymi, chyba że zostaniesz o to poproszony. Alternatywnie, fosforany można dodać do końca 5' dsDNA w prostej reakcji kinazy, na przykład przy użyciu dostępnej w handlu kinazy polinukleotydowej T4. Jednak ta metoda jest mniej wydajna, szczególnie gdy zasady inne niż G są docelowymi kinazami.

Gdy końce wkładki nie są tępe, wymagana jest reakcja polerowania lub wypełniania. Przykłady końców, które wymagają polerowania lub wypełnienia, obejmują wstawki wytworzone przez ścinanie lub sonikację lub przez polimerazę Taq, która preferencyjnie pozostawia pojedynczy nawis adenozyny na końcach 3' wstawki wytworzone przez trawienie restrykcyjne i niektóre wstawki wytworzone przez wygrzewanie wielu oligonukleotydów w celu wytworzenia dłuższych produktów. Szereg polimeraz DNA usunie nawisy DNA i/lub może być użytych do uzupełnienia brakujących zasad, jeśli dostępny jest 3&rsquo hydroksyl do primingu. Polimerazy do takich reakcji obejmują polimerazę DNA T4, PFU i fragment Klenowa polimerazy DNA I. Dostępnych jest wiele opcji i zestawów, więc skontaktuj się z producentami, aby określić, który z nich działa najlepiej dla twojego zastosowania.

Podobnie jak w przypadku innych metod klonowania, krótsze wstawki zwykle ligują skuteczniej niż dłuższe. Producenci zazwyczaj zawierają zalecenia dotyczące wielkości wstawek plazmidowych w dokumentacji plazmidu jako przydatny przewodnik w planowaniu eksperymentu klonowania.

Wreszcie, w przeciwieństwie do klonowania z kohezyjnym końcem, klonowanie z tępymi końcami nie odtwarza automatycznie miejsca restrykcyjnego po ligacji wstawki, chyba że do sekwencji wstawki dodaje się zasady w celu uzupełnienia brakującego miejsca (Figura 1).

Warunki podwiązania. W ligacjach z tępymi końcami asocjacja 5 grup fosforanowych i 3 grup hydroksylowych jest bardziej przejściowa niż w ligacjach z kohezyjnymi końcami. Ze względu na brak stabilizacji wiązań wodorowych spoistych końców, ligacje tępych końców są bardziej wrażliwe na warunki reakcji, zwłaszcza na stężenia składników reakcji.

Prawdopodobieństwo skojarzenia wstawki z linearyzowanym plazmidem jest zwiększone dzięki wysokiemu stężeniu dostępnych tępych końców wstawki. Jednak wewnątrzcząsteczkowa cyrkulacja plazmidu po połączeniu jednego końca wstawki działa najlepiej przy niższych stężeniach. Zbyt wysokie stężenia wstawek lub zbyt wysokie ogólne stężenia DNA mogą skutkować powstaniem plazmidów z wieloma wstawkami lub konkatemerów. Chociaż nie zawsze jest to konieczne, niektórzy badacze przeprowadzają krótką 1-godzinną inkubację z wysokimi stężeniami insertu i ligazy, a następnie rozcieńczają reakcję 20X buforem ligazy i pozwalają na ligację przez kolejne 4 godziny, aby ułatwić drugi etap ligacji reakcja [1].

Ważna jest również jakość i stężenie ligazy T4. Ligacje z tępymi końcami zazwyczaj mają miejsce w obecności wyższych stężeń ligazy niż ligacje z kohezyjnymi końcami. Na przykład, podczas gdy ligacja z kohezyjnym końcem może wykorzystywać 1 jednostkę ligazy T4/20 μl reakcji, tępa reakcja może wykorzystywać do 3 jednostek/20 μl reakcji. Dostępne w handlu ligazy T4 zazwyczaj określają, czy są zoptymalizowane do ligacji tępych końców, czy nie. Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta i rsquos, aby określić, która ligaza jest odpowiednia dla twojego eksperymentu klonowania i jakiego stężenia użyć. Należy zauważyć, że ligaza Taq, jak również kilka innych ligaz, nie łączy tępych końców.

Alternatywna metoda tępego końca. Jak wspomniano, o ile wstawka nie jest zaprojektowana z niezbędnymi zasadami do odtworzenia miejsca restrykcyjnego, tępe miejsce restrykcyjne użyte do linearyzacji wektora nie jest normalnie odtwarzane przez ligację wstawki (Figura 1). Pozwala to na alternatywną, mniej powszechną metodę klonowania tępych końców, która nie wymaga defosforylacji wektora. Zamiast tego opiera się na konkurencyjnych reakcjach trawienia i ligacji w celu zmniejszenia pustego tła wektorowego.

W tej metodzie cyrkularny plazmid i wstawkę umieszcza się w mieszaninie reakcyjnej zawierającej enzym restrykcyjny wytwarzający tępe końce&minus, jak również ligazę T4. Okrągły plazmid jest cięty, a wstawka ligowana w reakcji w jednej probówce. Pusty plazmid wytworzony przez ligację T4 jest następnie ponownie cięty przez enzym restrykcyjny. Dopóki wstawka nie jest zaprojektowana do wytwarzania tego specyficznego miejsca restrykcyjnego, wszystkie cyrkularne plazmidy powinny zawierać pożądaną wstawkę. Specyfikę tej metody&mdash również opisaną za pomocą enzymu polerującego&mdash można znaleźć w Sambrook i Russell [1]. Jednym z powodów, dla których naukowcy mogą chcieć uniknąć tej techniki, jest to, że obejmuje ona mieszanie wielu zoptymalizowanych buforów enzymatycznych, co może niekorzystnie wpływać na aktywność poszczególnych enzymów. Skontaktuj się z producentem(ami) enzymu, aby ustalić, czy wybrane enzymy są zgodne z tą metodą.


Klonowanie molekularne: podręcznik laboratoryjny (Czwarta edycja)

Klonowanie molekularne od 30 lat służy jako podstawa wiedzy technicznej w laboratoriach na całym świecie. Żaden inny podręcznik nie był tak popularny ani tak wpływowy. Klonowanie molekularne, wydanie czwarte, autorstwa znanego założyciela Joe Sambrooka i nowego współautora, wybitnego badacza HHMI Michaela Greena, zachowuje bardzo chwalone szczegóły i przejrzystość poprzednich wydań oraz zawiera konkretne rozdziały i protokoły zamówione do książki od ekspertów praktyków z Yale, U Mass, Rockefeller University, Texas Tech, Cold Spring Harbor Laboratory, Washington University i inne wiodące instytucje. Teoretyczne i historyczne podstawy technik są ważnymi cechami całej prezentacji, informacją, która w dużym stopniu pomaga w rozwiązywaniu problemów eksperymentalnych.

W czwartym wydaniu tej klasycznej pracy treść została całkowicie przeredagowana, aby uwzględnić metody oparte na kwasach nukleinowych wybrane jako najszerzej stosowane i wartościowe w laboratoriach biologii molekularnej i komórkowej.

Główne rozdziały z trzeciego wydania zostały zrewidowane, aby przedstawić aktualne strategie i podejścia do przygotowania i klonowania kwasów nukleinowych, transferu genów i analizy ekspresji. Zostały one uzupełnione o 12 nowych rozdziałów, które pokazują, w jaki sposób należy przygotowywać, oceniać i manipulować DNA, RNA i białkami oraz jak można obsługiwać generowanie i analizę danych.

Nowa zawartość obejmuje metody badania interakcji między komponentami komórkowymi, takie jak mikromacierze, technologie sekwencjonowania nowej generacji, interferencja RNA i analiza epigenetyczna przy użyciu technik metylacji DNA i immunoprecypitacji chromatyny. Aby zrozumieć bogactwo danych uzyskanych za pomocą tych technik, rozdział bioinformatyczny opisuje zastosowanie narzędzi analitycznych do porównywania sekwencji genów i białek oraz identyfikowania wspólnych wzorców ekspresji wśród zestawów genów.

Opierając się na trzydziestu latach zaufania, rzetelności i autorytetu, czwarta edycja Klonowanie molekularne jest nowym złotym standardem — jedynym niezbędnym podręcznikiem i źródłem odniesienia dla laboratorium biologii molekularnej.

Najważniejsze nowości w nowej edycji:

  • Obszerna nowa zawartość: 12 całkowicie nowych rozdziałów poświęconych najbardziej ekscytującym aktualnym strategiom badawczym, w tym analizie epigenetycznej, interferencji RNA, sekwencjonowaniu genomu i bioinformatyce
  • Rozszerzony zakres: wybrane do włączenia techniki oparte na kwasach nukleinowych promują najnowsze postępy w transferze genów, ekspresji białek, analizie RNA i ekspresji sklonowanych genów
  • Klasyczna zawartość: 10 oryginalnych głównych rozdziałów zostało zaktualizowanych, aby odzwierciedlić rozwój i innowacje w standardowych technikach oraz wprowadzić nowe, najnowocześniejsze protokoły
  • Łatwy do naśladowania format: słynna dbałość o szczegóły i dokładność poprzednich wydań została w pełni zachowana
  • Niezbędne dodatki: zawiera aktualny zbiór odczynników, wektorów, pożywek, systemów wykrywania i powszechnie stosowanych technik
  • Rozszerzone autorstwo: rozdziały i protokoły zostały specjalnie zlecone renomowanym ekspertom z wiodących instytucji

Pochwała za poprzednią edycję:

“Każde podstawowe laboratorium badawcze stosujące techniki biologii molekularnej skorzysta na posiadaniu kopii nowo opublikowanego trzeciego wydania Klonowanie molekularne: podręcznik laboratoryjny. pierwsze dwa wydania tej książki były podstawą biologii molekularnej o sprawdzonej reputacji dokładności i dokładności.” —Naukowiec

“W każdej kuchni jest przynajmniej jedna niezastąpiona książka kucharska. Klonowanie molekularne: podręcznik laboratoryjny wypełnia tę samą niszę w laboratorium (z) informacjami, aby pomóc zarówno niedoświadczonym, jak i zaawansowanym użytkownikom. (To) po raz kolejny ugruntowało swoją prymat jako podręcznik laboratorium molekularnego i prawdopodobnie można je znaleźć na stanowiskach laboratoryjnych. na całym świecie.” ——Trendy w neuronaukach

“Klonowanie molekularne: podręcznik laboratoryjny zawsze była podstawą protokołów i technik laboratoryjnych. Ma rasowe pochodzenie, a nowe wydanie nie zawodzi. (It) zawiera panele informacyjne na końcu każdego rozdziału, które opisują zasady stojące za protokołami. Dodanie tych informacji rozszerza Klonowanie molekularne z niezbędnego zasobu laboratoryjnego do nowej sfery, łączącej poprzedni prototyp z nowoczesną monografią molekularną. następne pokolenie Klonowanie molekularne nie tylko kontynuuje dumne dziedzictwo dwóch pierwszych wydań, ale także w sposób godny podziwu rozwija tę tradycję, zapewniając naprawdę niezbędny podręcznik laboratoryjny.” —Trendy w mikrobiologii


Łączenie DNA in vitro w celu utworzenia rekombinowanych cząsteczek

Ograniczenie endonukleazycięte w określonych sekwencjach (zwykle) 4 lub 6 pz. Pozwala to na wycięcie interesującego DNA w określonych miejscach. Funkcją fizjologiczną endonukleaz restrykcyjnych jest służenie jako część systemu ochrony bakterii przed inwazją wirusów lub innych organizmów. (patrz rozdział 7)

Tabela 3.1. Lista endonukleaz restrykcyjnych i ich miejsc cięcia. A ' oznacza, że ​​nukleaza tnie między tymi 2 nukleotydami, aby wytworzyć 3' hydroksyl i 5' fosforan.
Enzym Strona Enzym Strona
Alui AG'CT Niei GC'GGCCGC
BamCZEŚĆ G'GATCC Psti CTGCA'G
BglII A'GATCT PvuII CAG'CTG
EkoRI G'AATTC Sali G'TCGAC
HaeIII GG’CC Sau3AI „GATC”
Hhai GCG'C Smai CCC'GGG
hincII GTY'RAC Spei A'CTAGT
hindIII A'AGCTT Taqi T'CGA
hinfi G'ANTC Xbai T'CTAGA
HpaII C'CGG Xhoi C'TCGAG
Kpni GGTAC'C Xmai C'CCGGG
Mboi „GATC”

a. Lepkie końce

(1) Ponieważ sekwencje rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne są pseudopalindromami, cięcie poza środkiem w miejscu rozpoznania wygeneruje nawis 5' lub nawis 3' z końcami samokomplementarnymi (lub „lepkimi”).

np. 5' zwis EcoRI G'AATTC

(2) Gdy końce fragmentów restrykcyjnych są komplementarne,

końce mogą się wygrzewać. Dowolne dwa fragmenty, niezależnie od ich pochodzenia (zwierzęce, roślinne, grzybowe, bakteryjne) mogą zostać połączone in vitro w rekombinowane cząsteczki (Rysunek 3.3).

b. Tępe końce

(1) Endonukleaza restrykcyjna tnie w środku miejsca rozpoznania pseudopalindromicznego, aby wytworzyć tępe (lub spłukane) końce.

Ligaza DNA T4 służy do łączenia fragmentów DNA (rysunek 3.4). Zauważ, że wygrzane „lepkie” końce fragmentów restrykcyjnych mają: nicki(zazwyczaj 4 pz od siebie). Nacięcia są przerwami w szkielecie fosfodiestrowym, ale obecne są wszystkie nukleotydy. Lukiw jednej nici brakuje ciągu nukleotydów.

Ligaza DNA T4 wykorzystuje ATP jako źródło grupy adenylylowej przyłączonej do końca 5' nacięcia, co jest dobrą grupą opuszczającą po ataku 3' OH. (Patrz rozdział 5 na temat replikacji).

Przy wysokim stężeniu końców DNA i ligazy, enzym może również ligować razem tępo zakończone fragmenty DNA. Zatem dowolne dwa fragmenty z tępymi końcami mogą być zligowane razem. Uwaga: Dowolny fragment z nawisem 5' można łatwo przekształcić w cząsteczkę o tępych końcach przez syntezę fill‑in katalizowaną przez polimerazę DNA (często fragment Klenowa polimerazy I DNA). Następnie można go zligować z innym tępo zakończonym fragmentem.

Wyrazy łączące są krótkimi oligonukleotydami dupleksowymi, które zawierają miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej. Można je zligować z dowolną cząsteczką o tępych końcach, tworząc w ten sposób nowe miejsce cięcia restrykcyjnego na końcach cząsteczki. Ligacja łącznika na fragmencie restrykcyjnym, a następnie rozszczepienie endonukleazą restrykcyjną jest jednym z kilku sposobów generowania końca, który można łatwo zligować z innym fragmentem DNA.

Wyżarzanie homopolimer ogony to kolejny sposób na połączenie dwóch różnych cząsteczek DNA.

Enzym końcowy deoksynukleotydyl transferazakatalizuje dodanie ciągu nukleotydów do końca 3' fragmentu DNA. Zatem inkubując każdy fragment DNA z odpowiednią dNTP i terminalną transferazą deoksynukleotydylową, można dodać komplementarne homopolimery do końców DNA, które chce się połączyć. Np. można dodać ciąg liter G do końców 3' jednego fragmentu i ciąg liter C do końców 3' drugiego fragmentu. Teraz te dwa fragmenty połączą się poprzez ogony homopolimeru.

Rysunek 3.5. Wykorzystanie linkerów (po lewej) i ogonów homopolimerowych (po prawej) do tworzenia rekombinowanych cząsteczek DNA.


ZASTOSOWANIA I ZNACZENIE ENZYMÓW WYKORZYSTYWANYCH W DOŚWIADCZENIACH Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ

OGRANICZENIA ŚRODKOWE: Endonukleazy restrykcyjne to enzymy, które tną kwasy nukleinowe (w tym cząsteczki DNA i RNA) w określonych miejscach. Dzięki enzymom restrykcyjnym lub endonukleazom biolodzy molekularni mogą ciąć lub nacinać DNA w precyzyjny i powtarzalny sposób, co ma kluczowe znaczenie dla technik klonowania genów i innych eksperymentów z zakresu biologii molekularnej. Endonukleazy restrykcyjne to enzymy tnące DNA specyficznie znalezione i wyizolowane z bakterii, które nacinają określone miejsca w sekwencji nukleotydowej znanej jako witryny z ograniczeniami. Witryny z ograniczeniami to różne miejsca na cząsteczce DNA, która została nacięta przez określony enzym restrykcyjny. Istnieje kilka rodzajów enzymów restrykcyjnych, które pochodzą głównie z mikroorganizmów (szczególnie bakterii), ale mogą być również syntetyzowane chemicznie. Enzymy restrykcyjne lub endonukleazy są zwykle podzielone na trzy (3) grupy, a mianowicie: Typ I, Typ II, oraz Typ III enzymy restrykcyjne (RE). RE typu I i typu III wiążą się z cząsteczką kwasu nukleinowego w sekwencjach rozpoznawanych, ale specyficznie nacinają cząsteczkę DNA w znacznej odległości od miejsc restrykcyjnych. Jednak RE typu II są znacznie bardziej przydatne w różnych manipulacjach biologii molekularnej, ponieważ tną cząsteczki DNA dokładnie w ich miejscach restrykcyjnych.

KLIKNIJ TUTAJ, ABY KUPIĆ PODRĘCZNIKI MIKROBIOLOGICZNE

Niektóre przykłady enzymów restrykcyjnych to EkoRI (z E coli), HaeIII (z Haemophilus aegyptius), BamCZEŚĆ (z Bacillus amyloliquefaciens), Pvui (z Proteus vulgaris), ŁaniaII (z Haemophilus influenzae)oraz Sau3A (z S. aureus) wśród innych. Nomenklatura endonukleaz restrykcyjnych jest dość prosta. Enzymy restrykcyjne są zwykle nazywane po bakteriach, z których faktycznie zostały wyizolowane. Pierwsze trzy alfabety w nazwie enzymu restrykcyjnego reprezentują nazwę rodzajową i gatunkową bakterii, podczas gdy pozostałe alfabety lub liczby dołączone do nazwy reprezentują kolejność wykrywania enzymów w tym konkretnym organizmie. Te późniejsze alfabety lub liczby (zwykle w cyfrach rzymskich) mogą również reprezentować oznaczenie szczepu endonukleaz restrykcyjnych i typ. Na przykład, EkoRI to E coli enzym restrykcyjny I. Endonukleazy restrykcyjne są stosowane w wielu technikach biologii molekularnej, w tym między innymi w klonowaniu genów, amplifikacji genów, sekwencjonowaniu DNA i technikach blottingu.

FOSFATAZY ALKALICZNEJ: Fosfataza alkaliczna jest enzymem wytwarzanym przez organizmy takie jak E coli oraz tkankę jelitową cielęcia, która usuwa grupę fosforanową obecną na końcu 5′ cząsteczki DNA. Swoiście usuwa grupy fosforanowe z końca 5'8242 DNA, aby dać koniec 5'8242-OH, który może łączyć się z końcem 3'8242 wektora, który transportuje egzogenny DNA do komórki gospodarza biorcy. W ten sposób zapobiega niepożądanemu ponownemu ligowaniu lub ponownemu łączeniu już naciętych lub pociętych cząsteczek DNA.

LIGAZA DNA: Ligaza DNA to enzym, który specyficznie łączy ze sobą pocięte (nacięte) cząsteczki DNA. Naprawiają i łączą dwa pojedyncze jednoniciowe fragmenty DNA (tj. wektor do klonowania i cząsteczkę DNA do klonowania) pocięte przez tę samą endonukleazę restrykcyjną. Ligacja przeprowadzana przez enzym ligazę DNA jest zwykle ostatnim etapem techniki klonowania genów przed transformacją komórki bakteryjnej biorcy. Połączenie cząsteczki DNA do sklonowania z wektorem prowadzi do powstania nowej cząsteczki znanej jako cząsteczka rekombinowanego DNA (rDNA). Rekombinowana cząsteczka DNA to cząsteczka DNA, która jest utworzona przez ligację wektora z przeciętą cząsteczką DNA i zwykle zachodzi to w probówce, w której przecięty DNA, wektor i enzymy ligazy DNA są mieszane razem, aby zaszła reakcja. Na przykład w technice klonowania genów ten sam enzym restrykcyjny stosowany do cięcia interesującego DNA powinien być użyty do cięcia nośnika lub wektora przeznaczonego do przenoszenia interesującego genu do komórki gospodarza biorcy. Użycie tego samego enzymu restrykcyjnego do wykonania nacięcia lub nacięcia zapewni, że jedna część nie zostanie nienormalnie nacięta, ale zostanie tak samo nacięta, aby można je było odpowiednio zligować lub połączyć przez enzym ligazy DNA, który pochodzi głównie z genetycznie zmodyfikowanej E coli.

Taq POLIMERAZA: Enzym polimerazy Taq jest termostabilnym enzymem polimerazy DNA, który jest izolowany z termostabilnych bakterii (szczególnie Thermus aquaticus), i który jest stosowany w technikach PCR do wydłużania starterów wzdłuż jednoniciowej cząsteczki DNA w kierunku 5′-3′.

POLIMERAZA DNA I: Polimeraza DNA I jest enzymem, który syntetyzuje cząsteczki DNA komplementarne do matrycy DNA w kierunku 5′-3′. Generalnie syntetyzuje DNA na matrycy DNA lub RNA. Polimeraza DNA I zwykle zaczyna się od startera oligonukleotydowego z końcem 3′ OH i jest stosowana do wydłużania starterów oligonukleotydowych wzdłuż jednoniciowych cząsteczek DNA. Polimerazy DNA są syntetyzowane przez E coli, i wykonują podobną aktywność jak enzym polimerazy Taq. Parują zasady i polimeryzują rosnące nici DNA aż do osiągnięcia miejsca terminacji.

ENZYM RNazy: Enzym RNaza jest enzymem nukleazy, który trawi RNA.

ENZYM DNazy: Enzym DNaza to enzym nukleaza, który trawi DNA.

Jądra: Nukleazy to enzymy degradacyjne, które tną, skracają i degradują kwasy nukleinowe (w tym DNA i RNA). Są one zwykle używane w reakcji PCR i innych eksperymentach biologii molekularnej do trawienia cząsteczek kwasu nukleinowego.

Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K i Watson J.D (2002). Biologia molekularna komórki. Czwarta edycja. Nowy Jork, Girlanda, USA.

Cooper GM i Hausman RE (2004). Komórka: podejście molekularne. Trzecia edycja. ASM Naciśnij.

Dale J (2003). Genetyka molekularna bakterii. Jeremy W. Dale i Simon Park (wyd. 4). John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, Wielka Brytania. str. 312-313.

Lewis R (2004). Genetyka człowieka: koncepcje i zastosowania. Szósta edycja. Wydawnictwo McGraw Hill, USA.

Robert L. Nussbaum, Roderick R. McInnes i Huntington F. Willard (2001). Genetyka w medycynie. Filadelfia, Stany Zjednoczone. Wydawcy Saundersa.

Sambrook, J., Russell, D.W. (2001). Klonowanie molekularne: podręcznik laboratoryjny, wyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nowy Jork.

Tamarin Robert H (2002). Zasady genetyki. Wydanie siódme. Tata McGraw-Hill Publishing Co Ltd, Delhi.

Twyman RM (1998). Zaawansowana biologia molekularna: zwięzłe odniesienie. Wydawnictwa Naukowe Bios. Oksford, Wielka Brytania.


Jaka jest różnica między lepkimi a tępymi końcami?

Enzymy restrykcyjne przecinają dwuniciowy DNA na pół. W zależności od enzymu restrykcyjnego cięcie może skutkować albo lepki koniec lub a tępy koniec. Lepkie końce są bardziej przydatne w klonowaniu molekularnym, ponieważ zapewniają wstawienie fragmentu ludzkiego DNA do plazmidu we właściwym kierunku.

Poza powyższym, do czego służą tępe końcówki? Tępe końce nie mają zwisu. Nie mogą pasować tak dokładnie, jak DNA z lepkim kończy się jednak mogą być przydatne, gdy są lepkie kończy się nie może być używany. SmaI to enzym restrykcyjny, który sprawia, że tępe końce.

Tak więc, jaka jest różnica między quizletem z tępymi końcówkami a lepkimi końcówkami?

Lepkie końce są wtedy, gdy enzymy dokonują rozłożonych cięć w dwie nici. Cięcia, które nie są naprzeciwko siebie. Lepkie końce są najbardziej przydatne w rDNA, ponieważ można ich użyć do połączenia dwóch różne kawałki DNA pocięte przez ten sam enzym restrykcyjny.

Jak zamienić tępe końcówki na lepkie końcówki?

Tępy oraz lepkie końce może być inter nawrócony albo dodając restrykcyjne miejsca poznawcze, albo usuwając niektóre z nich. Tępy koniecnawrócony do lepki koniec przed klonowaniem.


Metody

Linie komórkowe i media

ten E coli HB101 zastosowano do przygotowania plazmidowego DNA. Bakterie hodowano na pożywce Luria-Bertani (LB). Ludzkie embrionalne komórki T nerki (HEK) 293 hodowano w pożywce Dulbecco Modified Eagle (DMEM) uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1 mM pirogronianem sodu, 0,1 mM nieistotnymi aminokwasami, 2 mM L-glutaminą, 100 mg/ml streptomycyny i 100 jednostek/ml penicyliny. Linię komórkową białaczki szpikowej C1498 [52] hodowano w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej tymi samymi odczynnikami co DMEM. Komórki dzielono co drugi dzień, aby utrzymać je w fazie logarytmicznej.

Plazmidy, startery, PCR i sekwencjonowanie

Plazmid zawierający sekwencję kodującą genu tdTomato, plazmid zawierający wektor alfa-retrowirusowy i plazmidy zawierające alfaretrowirusowy gag/pol zoptymalizowany pod względem kodonów [53] zostały dostarczone przez Axel Schambach (MHH Hannover, Niemcy). Starter przedni (5'-ACCGGTGCCACCATGGCCCACAACCATGGTG-3') i odwrotny (5'-GTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3') użyty do amplifikacji genu tdTomato zostały zsyntetyzowane przez Eurofins Genomics (Ebersberg, Niemcy).

Optymalne bufory dla enzymów lub innych odczynników zostały dostarczone przez producentów wraz z odpowiednimi enzymami lub w zestawach. Jeśli są dostępne u producentów, wymienia się pH i składniki buforów. Startery rozpuszczono w wodzie ultraczystej w stężeniu podstawowym 20 pmol/μl. Plazmid matrycowy rozcieńczono w wodzie do stężenia wyjściowego 50 ng/μl. For PCR, the following reagents were mixed and filled up with water to a total volume of 50 μl: 1 μl plasmid DNA (1 ng/μl final concentration), 1.25 μl of each primer (0.5 pmol/μl final concentration for each primer), 1 μL dNTP (10 mM each), 10 μl of 5X Phusion HF buffer (1X buffer provides 1.5 mM MgCl2), and 0.5 μl Phusion DNA polymerase (2U/μl, Thermo Scientific).

PCR was performed using a peqSTAR thermocycler (PEQLAB Biotechnologie) at: 98°C for 3 minutes 25 cycles at 98°C for 10 seconds, 66°C for 30 seconds, 72°C for 30 seconds and 72°C for 10 minutes. To prepare a 0.8% agarose gel, 0.96 g agarose (CARL ROTH) was dissolved in 120 ml 1X TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA, pH of 50X TAE: 8.4) and boiled for 4 minutes. Then 3 μl SafeView nucleic acid stain (NBS Biologicals) was added to the solution and the mixture was poured into a gel-casting tray.

DNA was mixed with 10 μl loading dye (6X) (Thermo Scientific) and loaded on the agarose gel (CARL ROTH) using 80 V for one hour in TAE buffer. The separated DNA fragments were visualized using an UV transilluminator (365 nm) and quickly cut to minimize the UV exposure. DNA was extracted from the gel slice using Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research). The concentration of DNA was determined using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific).

For sequence validation, the PCR product was subcloned using CloneJET PCR cloning kit (Thermo Scientific). 1 μl of blunt vector (50 ng/μl), 50 ng/μl of the PCR product, and 10 μl of 2X reaction buffer (provided in the kit) were mixed and filled with water to a total volume of 20 μl. 1 μl of T4 DNA ligase (5 U/μl) was added to the mixture, mixed and incubated at room temperature for 30 minutes. For bacterial transfection, 10 μl of the mixture was mixed with 100 μl of HB101 E coli competent cells and incubated on ice for 45 minutes. Then the mixture was heat-shocked (42°C/2 minutes), put on ice again (5 minutes), filled up with 1 ml LB medium and incubated in a thermomixer (Eppendorf) for 45 minutes/37°C/450RPM. Then the bacteria were spun down for 4 minutes. The pellet was cultured overnight at 37°C on an agarose Petri dish containing 100 μg/mL of Ampicillin. The day after, colonies were picked and cultured overnight in 3 ml LB containing 100 μg/mL of ampicillin.

After 16 hours (overnight), the plasmid was isolated from the cultured bacteria using the QIAprep spin miniprep kit (QIAGEN) according to the manufacturer’s instructions. 720 to 1200 ng of plasmid DNA in a total of 12 μl water were sent for sequencing (Seqlab) in Eppendorf tubes. The sequencing primers pJET1.2-forward (5′-CGACTCACTATAGGGAG-3′), and pJET1.2-reverse (5′-ATCGATTTTCCATGGCAG-3′), were generated by the Seqlab Company (Göttingen, Germany). An ABI 3730XL DNA analyzer was used by the Seqlab Company to sequence the plasmids applying the Sanger method. Sequence results were analyzed using NCBI Blast as explained in the Results and discussion section.

Manipulation of DNA fragments

For viewing plasmid maps, Clone Manager suite 6 software (SciEd) was used. Restriction endonuclease enzymes (Thermo Scientific) were used to cut plasmid DNA. 5 μg plasmid DNA, 2 μl buffer O (50 mM Tris–HCl (pH 7.5 at 37°C), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1 mg/mL BSA, Thermo Scientific), 1 μl SalI (10 U), and 1 μl AgeI (10 U) were mixed in a total of 20 μl water and incubated (37°C) overnight in an incubator to prevent evaporation and condensation of water under the tube lid. The next day, DNA was mixed with 4 μl loading dye (6X) (Thermo Scientific) and run on a 0.8% agarose gel at 80 V for one hour in TAE buffer. The agarose gel (120 ml) contained 3 μl SafeView nucleic acid stain (NBS Biologicals). The bands were visualized on a UV transilluminator (PEQLAB), using a wavelength of 365 nm, and quickly cut to minimize the UV damage. DNA was extracted from the gel slices using the Zymoclean™ gel DNA recovery kit (Zymo Research). The concentration of DNA was determined using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific).

For the ligation of vector and insert fragments, a ligation calculator was designed (the Excel file available in the Additional file 1) for easy calculation of the required insert and vector volumes. The mathematical basis of the calculator is inserted into the excel spreadsheet. The size and concentration of the vector and insert fragments and the molar ratio of vector/insert (normally 1:3) must be provided for the calculation. Calculated amounts of insert (tdTomato) and vector (alpha-retroviral backbone) were mixed with 2 μl of 10X T4 ligase buffer (400 mM Tris–HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8 at 25°C), Thermo Scientific), 1 μl of T4 ligase (5 U/μl, Thermo Scientific), filled up to 20 μl using ultrapure water and incubated overnight at 16°C. The day after, HB101 E coli was transfected with the ligation mixture as mentioned above. The clones were picked and consecutively cultured for one day in LB medium containing ampicillin. Plasmid DNA was isolated using Zyppy™ plasmid miniprep kit (Zymo Research) and digested with proper restriction enzymes for screening. Digested plasmids were mixed with the loading dye and run on an agarose gel as mentioned above. The separated DNA fragments were visualized using a Gel Doc™ XR+ System (BIO-RAD) and analyzed by the Image Lab™ software (BIO-RAD). The positive clone was cultured overnight in 450 ml LB medium containing ampicillin. Plasmid DNA was isolated using QIAGEN plasmid maxi kit (QIAGEN), diluted in ultrapure water and stored at −20°C for later use.

Production of viral supernatant and transduction of cells

HEK293T cells were thawed, split every other day for one week and grown in log phase. The day before transfection, 3.5 × 10 6 cells were seeded into tissue culture dishes (60.1 cm 2 growth surface, TPP). The day after, the cells use to reach about 80% confluence. If over confluent, transfection efficiency decreases. The following plasmids were mixed in a total volume of 450 μl ultrapure water: codon-optimized alpharetroviral gag/pol (2.5 μg), VSVG envelope (1.5 μg), and the alpharetroviral vector containing the tdTomato gene (5 μg). Transfection was performed using calcium phosphate transfection kit (Sigma-Aldrich). 50 μl of 2.5 M CaCl2 was added to the plasmid DNA and the mixture was briefly vortexed. Then, 0.5 ml of 2X HEPES buffered saline (provided in the kit) was added to a 15 ml conical tube and the calcium-DNA mixture was added dropwise via air bubbling and incubated for 20 minutes at room temperature. The medium of the HEK293T cells was first replaced with 8 ml fresh medium (DMEM containing FCS and supplement as mentioned above) containing 25 μM chloroquine. Consecutively the transfection mixture was added. Plates were gently swirled and incubated at 37°C. After 12 hours, the medium was replaced with 6 ml of fresh RPMI containing 10% FCS and supplements. Virus was harvested 36 hours after transfection, passed through a Millex-GP filter with 0.22 μm pore size (Millipore), and used freshly to transduce C1498 cells. Before transduction, 24 well plates were coated with retronectin (Takara, 280 μl/well) for 2 hours at room temperature. Then, retronectin was removed and frozen for later use (it can be re-used at least five times) and 300 μl of PBS containing 2.5% bovine serum albumin (BSA) was added to the wells for 30 minutes at room temperature. To transduce C1498 cells, 5 × 10 4 of cells were spun down and resuspended with 1 ml of fresh virus supernatant containing 4 μg/ml protamine sulfate. The BSA solution was removed from the prepared plates and plates were washed two times with 0.5 ml PBS. Then cells were added to the wells. Plates were centrifuged at 2000RPM/32°C/90 minutes. Fresh medium was added to the cells the day after.

Flow cytometry and fluorescence microscope

For flow cytometry assessment, cells were resuspended in PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA and were acquired by a BD FACSCanto™ (BD Biosciences) flow cytometer. Flow cytometry data were analyzed using FlowJo software (Tree Star). Imaging was performed with an Olympus IX71 fluorescent microscope equipped with a DP71 camera (Olympus). Images were analyzed with AxioVision software (Zeiss). Fluorescent images were superimposed on bright-field images using adobe Photoshop CS4 software (Adobe).