Informacja

Jaka jest rola CRISPR-dCas9 w kompleksach regulatorów transkrypcji gRNA-dCas9?

Jaka jest rola CRISPR-dCas9 w kompleksach regulatorów transkrypcji gRNA-dCas9?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

w tym papierze1Przeczytałem, że zmutowane wersje białek Cas, takie jak dezaktywowany Cas9 (dCas9), są używane wraz z kierującym RNA (gRNA) do tworzenia wariantów narzędzia CRISPR, które mogą działać jako regulatory transkrypcji.

Ponieważ zmutowany Cas9 utracił swoją funkcję nukleazy, zmutowany kompleks gRNA-dCas9 może „blokować” czynniki transkrypcyjne, takie jak polimeraza RNA, przed wiązaniem określonego genu, hamując w ten sposób transkrypcję lub wydłużanie.

Innym sposobem, w jaki dCas9 może regulować transkrypcję, jest „przenoszenie” innego czynnika transkrypcyjnego – czy to aktywatora, czy represora – i można to zrobić poprzez inżynierię dCas9 w fuzji z innym wybranym czynnikiem transkrypcyjnym.

Rozumiem, w jaki sposób dCas9 może blokować wiązanie innego czynnika transkrypcyjnego, aby powstrzymać inicjację lub wydłużenie transkrypcji, ale jaki jest sens łączenia innego czynnika transkrypcyjnego z dCas9? Wydaje mi się, że w tym scenariuszu dCas9 jest tylko biernym nośnikiem czynnika transkrypcyjnego, który faktycznie wykonuje tę pracę, dlaczego więc nie można zamiast tego połączyć czynnika transkrypcyjnego z gRNA, aby mógł bezpośrednio wpływać na transkrypcję, gdy gRNA tworzy komplementarne pary zasad z genem docelowym, zamiast być na pasywnym dCas9?

1. Jusiak, B., Cleto, S., Perez-Pinera, P. and Lu, T.K., 2016. Inżynieria syntetycznych obwodów genów w żywych komórkach za pomocą technologii CRISPR. Trendy w biotechnologii, 34(7), s.535-547.


dlaczego więc czynnik transkrypcyjny nie może być zamiast tego połączony z gRNA, aby mógł bezpośrednio wpływać na transkrypcję, gdy gRNA tworzy komplementarne pary zasad z genem docelowym, zamiast być na pasywnym dCas9?

Głównym tego powodem jest to, że zarówno kombinacja gRNA, jak i dCas9-TF (czynnik transkrypcyjny) może (każda) być kodowana genetycznie, podczas gdy kombinacja gRNA z czynnikiem transkrypcyjnym może być wygenerowana tylko chemicznie.

Możliwość genetycznego kodowania jednostki dCas9-TF+gRNA pozwala na:
a) stosować ustalone metody przenoszenia DNA do komórek, tak aby komórki same tworzyły Cas9 i gRNA oraz
b) generować komórki, które stabilnie eksprymują całą jednostkę (dCas9-TF + gRNA) na zawsze.

Żadna z tych opcji nie byłaby możliwa w przypadku chemicznie połączonego gRNA-TF (co jest również znacznie trudniejsze do wykonania w laboratoriach biologii molekularnej, które nie mają odpowiedniego sprzętu chemicznego).


Granice w naukach molekularnych

Afiliacje redaktora i recenzentów są najnowsze podane w ich profilach badawczych Loop i mogą nie odzwierciedlać ich sytuacji w momencie recenzji.


  • Pobierz artykuł
    • ściągnij PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Uzupełniający
      Materiał
    • Uwaga końcowa
    • Kierownik Referencji
    • Prosty plik TEKSTOWY
    • BibTex


    PODZIEL SIĘ

    Staphylococcus aureus jest Gram-dodatnią bakterią koksową, która jest powszechnym patogenem zarówno w pozaszpitalnych, jak i szpitalnych chorobach zakaźnych. S. aureus przebywa na powierzchni skóry i nozdrzach około 30% światowej populacji (Maeda i in., 2008) i może powodować złożone i różnorodne choroby, w tym miejscowe infekcje skóry, zatrucia pokarmowe, infekcje ropotwórcze, zespół wstrząsu septycznego i zapalenie płuc. Może infekować prawie wszystkie tkanki, szczególnie te u pacjentów z obniżoną odpornością (Lowy, 1998).S. aureus charakteryzuje się silną patogennością, wysokim wskaźnikiem infekcji i wysoką śmiertelnością, które zależą przede wszystkim od produkcji toksyn i enzymów inwazyjnych, takich jak α-hemolizyna, enterotoksyna, koagulaza osoczowa, proteazy, lipaza, hialuronidaza, toksyna z naskórka, zespół wstrząsu toksycznego toksyny i inne substancje (Kong i in., 2016).

    Inaktywacja genów to główne podejście do rozszyfrowania funkcji genu bakteryjnego. w S. aureus, klinicznie izolowane szczepy (takie jak metycylinooporne Staphylococcus aureusMRSA) często wykazują oporność na kilka antybiotyków, dlatego niezwykle trudno jest inaktywować wiele genów w tym samym szczepie przy użyciu konwencjonalnych metod rekombinacji homologicznej, ponieważ nie ma wystarczającej ilości dostępnych markerów antybiotykowych. Istniejące metody genetyki molekularnej generujące inaktywację genów w oparciu o rekombinację homologiczną przy użyciu szerokiej gamy metod inżynierii genomu, takich jak zastosowanie różnych wektorów docelowych, w tym pBT2 (Nakanishi i wsp., 1986) (w oparciu o determinanty antybiotykooporności), pMAD (Arnaud i in. al., 2004) (w oparciu o β-galaktozydazę do niebiesko-białego badania przesiewowego) oraz pKOR (Bae & Schneewind, 2006) i pIMAY (Monk i wsp., 2012) (w oparciu o indukowalne antysensowne antysensowne markery selekcyjne). Chociaż rozwój tych metod ułatwił badania funkcji genów w S. aureus, inaktywacja genu pozostaje procesem pracochłonnym, czasochłonnym i kosztownym. Co więcej, gdy docelowe geny mają kluczowe znaczenie dla przetrwania drobnoustrojów, niemożliwe jest uzyskanie szczepu nokautującego za pomocą technologii zakłócania genomu. Ponieważ mechanizm RNAi jest nieobecny w bakteriach, jednoniciowe antysensowne RNA (asRNA) (Nakashima & Tamura, 2009) lub antysensowne kwasy nukleinowe peptydów (Nekhotiaeva et al., 2004) zostały użyte jako narzędzia do warunkowego lub odwracalnego wyciszania genów poprzez celowanie w translację lub procesy transkrypcji. Jednak metody te są również pracochłonne i nieefektywne (Wagner & Flärdh, 2002). Badanie molekularnego mechanizmu S. aureus infekcja wymaga opracowania nowych molekularnych narzędzi genetycznych. Niedawno podejście do edycji genomu CRISPR/Cas okazało się prostym i opłacalnym narzędziem, które zrewolucjonizowało technologię edycji genów ze względu na swoją wydajność, przystępność cenową i dostępność (Qi i in., 2013). System CRISPR (zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne) jest systemem odporności nabytej, który istnieje w około 40% zsekwencjonowanych genomów bakteryjnych i

    90% tych z archeonów (Grissa i in., 2007). Niszczy genom najeźdźcy, gdy sekwencja przerywnika małego CRISPR RNA (crRNA) pasuje do sekwencji protoprzerywnika w genomie wirusa przez selektywne rozszczepienie (Barrangou i wsp., 2007, Wiedenheft i wsp., 2011, Wiedenheft i wsp., 2012 ). Istnieją trzy rodzaje systemów CRISPR w różnych organizmach, które opierają się na układzie cas geny. System CRISPR typu II od Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych systemów CRISPR (Makarova i in., 2011). System ten składa się z białka endonukleazy Cas9 i dwóch RNA: dojrzałego crRNA (crRNA) i częściowo komplementarnego RNA (tracrRNA). Kompleks tracrRNA-crRNA kieruje białkami Cas do komplementarnych docelowych sekwencji DNA sąsiadujących z odpowiednimi sekwencjami Protospacer Adjacent Motif (PAM), a następnie powoduje dwuniciowe pęknięcia (DSB) w celach przez cięcie endonukleazą Cas9. System ten jest dodatkowo uproszczony przez zastosowanie zmodyfikowanej małej chimery kierującej RNA (sgRNA), która zawiera obszar komplementarny specyficznie wiążący DNA, strukturę spinki do włosów wiążącą Cas9 i terminator transkrypcji pochodzący z S. pyogenes(Jinek et al., 2012) Niedawno opracowano system interferencji CRISPR przy użyciu dezaktywowanego Cas9, który zawierał dwie mutacje (D10A i H840A) w domenach nukleazy (Qi et al., 2013, Choudhary et al., 2015). Jak pokazano na ryc. 1A, gdy zdezaktywowany Cas9 (dCas9) tworzy kompleks docelowy z zaprojektowanymi małymi kierującymi RNA (sgRNA) komplementarnymi do pożądanego docelowego DNA i wiąże się z locus genomowego DNA przez parowanie zasad z sekwencją, która jest obok do PAM, dCas9 zakłóca transkrypcję docelowego genu i powoduje wydajną represję ekspresji genu.

    W niniejszym dokumencie opisujemy podejście do interferencji genów za pośrednictwem CRISPR/dCas9, które obejmuje przenoszoną przez plazmid ekspresję Cas9 ze specyficznym kierującym RNA. Stosując tę ​​strategię, skuteczna represja określonego genu w obrębie S. aureus można uzyskać genom. Wykazaliśmy również, że takie podejście może jednocześnie znokautować wiele genów. To podejście jest bardzo specyficzne, proste i opłacalne w porównaniu z innymi metodami. Przewidujemy, że może to ułatwić badanie funkcji genów S. aureus.


    Beerli, RR, Dreier, B. i Barbas, C.F. III Pozytywna i negatywna regulacja genów endogennych przez zaprojektowane czynniki transkrypcyjne. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 97, 1495–1500 (2000).

    Snowden, A.W., Gregory, PD, Case, C.C. & Pabo, dyrektor generalny Specyficzne dla genu celowanie w metylację H3K9 jest wystarczające do zainicjowania represji in vivo. Aktualn. Biol. 12, 2159–2166 (2002).

    Cong, L., Zhou, R., Kuo, Y.C., Cuniff, M. & Zhang, F. Kompleksowe badanie naturalnych modułów wiążących DNA TALE i domen represora transkrypcji. Nat. Komunia. 3, 968 (2012).

    Konermann, S. i in. Optyczna kontrola endogennej transkrypcji ssaków i stanów epigenetycznych. Natura 500, 472–476 (2013).

    Mendenhall, E.M. i in. Edycja modyfikacji histonów specyficznych dla miejsca w endogennych wzmacniaczach. Nat. Biotechnologia. 31, 1133–1136 (2013).

    Gilbert, L.A. i in. Modularna regulacja transkrypcji u eukariontów za pośrednictwem CRISPR. Komórka 154, 442–451 (2013).

    Perez-Pinera, P. i in. Aktywacja genów sterowana RNA przez czynniki transkrypcyjne oparte na CRISPR-Cas9. Nat. Metody 10, 973–976 (2013).

    Maeder, M.L. i in. Sterowana przez CRISPR RNA aktywacja endogennych ludzkich genów. Nat. Metody 10, 977–979 (2013).

    Kearns, NA i in. Funkcjonalna adnotacja natywnych wzmacniaczy z fuzją Cas9-demetylazy histonowej. Nat. Metody 12, 401–403 (2015).

    Hilton, I.B. i in. Edycja epigenomu przez acetylotransferazę opartą na CRISPR-Cas9 aktywuje geny z promotorów i wzmacniaczy. Nat. Biotechnologia. 33, 510–517 (2015).

    Maeder, M.L. i in. Ukierunkowana demetylacja DNA i aktywacja endogennych genów przy użyciu programowalnych białek fuzyjnych TALE-TET1. Nat. Biotechnologia. 31, 1137–1142 (2013).

    Rivenbark, AG i in. Przeprogramowanie epigenetyczne komórek nowotworowych poprzez ukierunkowaną metylację DNA. Epigenetyka 7, 350–360 (2012).

    Jinek, M. i in. Programowalna endonukleaza DNA sterowana podwójnym RNA w adaptacyjnej odporności bakterii. Nauki ścisłe 337, 816–821 (2012).

    Cong, L. i in. Wielokrotna inżynieria genomu przy użyciu systemów CRISPR/Cas. Nauki ścisłe 339, 819–823 (2013).

    Mali, P. i in. Inżynieria genomu ludzkiego sterowana RNA za pośrednictwem Cas9. Nauki ścisłe 339, 823–826 (2013).

    Gilbert, L.A. i in. Kontrola represji i aktywacji genów za pośrednictwem CRISPR w skali genomu. Komórka 159, 647–661 (2014).

    Konermann, S. i in. Aktywacja transkrypcyjna w skali genomu przez zmodyfikowany kompleks CRISPR-Cas9. Natura 517, 583–588 (2015).

    Gao, X. i in. Porównanie designerskich czynników transkrypcyjnych TALE i CRISPR/dCas9 w regulacji ekspresji genów poprzez celowanie w wzmacniacze. Kwasy nukleinowe Res. 42, e155 (2014).

    Chakraborty, S. i in. System oparty na CRISPR/Cas9 do przeprogramowania specyfikacji linii komórkowej. Raporty o komórkach macierzystych 3, 940–947 (2014).

    Chavez, A. i in. Wysoce wydajne programowanie transkrypcyjne za pośrednictwem Cas9. Nat. Metody 12, 326–328 (2015).

    Nissim, L., Perli, SD, Fridkin, A., Perez-Pinera, P. & Lu, T.K. Multipleksowana i programowalna regulacja sieci genów za pomocą zintegrowanego zestawu narzędzi RNA i CRISPR/Cas w komórkach ludzkich. Mol. Komórka 54, 698–710 (2014).

    Thurman, R.E. i in. Dostępność krajobrazu chromatyny ludzkiego genomu. Natura 489, 75–82 (2012).

    Boyle, A.P. i in. Mapowanie w wysokiej rozdzielczości i charakterystyka otwartej chromatyny w całym genomie. Komórka 132, 311–322 (2008).

    Konsorcjum Projektu ENCODE. i in. Zintegrowana encyklopedia elementów DNA w genomie człowieka. Natura 489, 57–74 (2012).

    Sripathy, S.P., Stevens, J. & Schultz, D.C. Korepresor KAP1 działa w celu koordynowania montażu de novo Mikrośrodowiska heterochromatyny oddzielone od HP1 wymagane do represji transkrypcyjnej za pośrednictwem białka palca cynkowego KRAB. Mol. Komórka. Biol. 26, 8623–8638 (2006).

    Groner, AC i in. Białka KRAB-palca cynkowego i KAP1 mogą pośredniczyć w dalekosiężnej represji transkrypcyjnej poprzez rozprzestrzenianie się heterochromatyny. PLoS Genet. 6, e1000869 (2010).

    Schultz, DC, Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G.G. & Rauscher, FJ 3rd SETDB1: nowatorska metylotransferaza histonowa H3 związana z KAP-1, specyficzna dla lizyny 9 metylotransferaza, która przyczynia się do wyciszania genów euchromatycznych za pośrednictwem HP1 przez białka palca cynkowego KRAB. Geny Dev. 16, 919–932 (2002).

    Reynolds, N. i in. Deacetylacja H3K27 za pośrednictwem NuRD ułatwia rekrutację kompleksu represyjnego Polycomb 2 w celu kierowania represją genów. EMBO J. 31, 593–605 (2012).

    Wu, X. i in. Wiązanie w całym genomie endonukleazy CRISPR Cas9 w komórkach ssaków. Nat. Biotechnologia. 32, 670–676 (2014).

    Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J. & Adli, M. Analiza całego genomu ujawnia charakterystykę miejsc poza docelowymi związanych przez endonukleazę Cas9. Nat. Biotechnologia. 32, 677–683 (2014).

    Grimmer, MR i in. Analiza sztucznego modulatora epigenetycznego palca cynkowego: powszechne wiązanie, ale ograniczona regulacja. Kwasy nukleinowe Res. 42, 10856–10868 (2014).

    Ayyanathan, K. i in. Regulowana rekrutacja HP1 do genu euchromatycznego indukuje mitotycznie dziedziczne, epigenetyczne wyciszanie genów: model zmienności genów w hodowli komórek ssaków. Geny Dev. 17, 1855–1869 (2003).

    Hathaway, NA i in. Dynamika i pamięć heterochromatyny w żywych komórkach. Komórka 149, 1447–1460 (2012).

    Hardison, R. i in. Regiony kontroli locus klastrów genów beta-globin ssaków: łączenie analiz filogenetycznych i wyników eksperymentalnych w celu uzyskania wglądu funkcjonalnego. Gen 205, 73–94 (1997).

    Tuan, D., Kong, S. & Hu, K. Transkrypcja wzmacniacza HS2 w miejscu nadwrażliwości w komórkach erytroidalnych. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 89, 11219–11223 (1992).

    McDowell, JC i Dean, A. Strukturalny i funkcjonalny cross-talk między odległym wzmacniaczem a promotorem genu epsilon-globina pokazuje współzależność tych dwóch elementów w chromatynie. Mol. Komórka. Biol. 19, 7600–7609 (1999).

    Vakoc, C.R. i in. Bliskość odległych elementów regulatorowych w locus beta-globiny wymaga GATA-1 i FOG-1. Mol. Komórka 17, 453–462 (2005).

    Dostie, J. i in. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): masowo równoległe rozwiązanie do mapowania interakcji między elementami genomu. Genom Res. 16, 1299–1309 (2006).

    Dean, A., Ley, TJ, Humphries, RK, Fordis, M. & Schechter, A.N. Indukowalna transkrypcja pięciu genów globiny w ludzkich komórkach białaczki K562. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 80, 5515–5519 (1983).

    Polstein, L.R. i in. Swoistość wiązania DNA, regulacji genów i przebudowy chromatyny w całym genomie za pomocą aktywatorów transkrypcyjnych opartych na TALE i CRISPR/Cas9. Genom Res. 25, 1158–1169 (2015).

    H. O'Geen, IM Henry, M.S. Bhakta, J.F. Meckler i D.J. Segal. Analiza swoistości wiązania Cas9 w całym genomie przy użyciu sekwencji ChIP i ukierunkowanego wychwytywania sekwencji. Kwasy nukleinowe Res. 43, 3389–3404 (2015).

    Ikonomi, P. i in. Poziomy czynników transkrypcyjnych GATA-1/GATA-2 modulują ekspresję hemoglobin embrionalnych i płodowych. Gen 261, 277–287 (2000).

    Deng, W. i in. Reaktywacja rozwojowo wyciszonych genów globiny przez wymuszone zapętlenie chromatyny. Komórka 158, 849–860 (2014).

    Kabadi, AM, Outsterout, DG, Hilton, I.B. i Gersbach, Kalifornia Multipleksowa inżynieria genomowa oparta na CRISPR/Cas9 z jednego wektora lentiwirusowego. Kwasy nukleinowe Res. 42, e147 (2014).

    Łosoś, P. & Trono, D. Produkcja i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Aktualn. Prot. Neurosci. Rozdział 4, Rozdział 4.21 (2006).

    Gertz, J. i in. Konstruowanie bibliotek sekwencji RNA za pośrednictwem transpozazy. Genom Res. 22, 134–141 (2012).

    Langmead, B. i Salzberg, S.L. Szybkie wyrównanie z przerwami w odczycie z Bowtie 2. Nat. Metody 9, 357–359 (2012).

    Anders, S. i Huber, W. Analiza różnicowej ekspresji dla danych zliczania sekwencji. Biol genomowy. 11, R106 (2010).

    Li, H. i in. Format Sequence Alignment/Map i SAMtools. Bioinformatyka 25, 2078–2079 (2009).

    Zhang, Y. i in. Analiza modelowa ChIP-Seq (MACS). Biol genomowy. 9, R137 (2008).

    Quinlan, AR & Hall, IM BEDTools: elastyczny zestaw narzędzi do porównywania cech genomicznych. Bioinformatyka 26, 841–842 (2010).

    Love, M.I., Huber, W. & Anders, S. Umiarkowane oszacowanie krotności zmiany i dyspersji dla danych sekwencji RNA za pomocą DESeq2. Biol genomowy. 15, 550 (2014).

    Song, L. i Crawford, G.E. DNase-seq: technika wysokiej rozdzielczości do mapowania aktywnych elementów regulatorowych genów w genomie z komórek ssaków. Zimna Wiosna Harb. Prot. 2010 10.1101/pdb.prot5384 (luty 2010).

    Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. i Salzberg, S.L. Ultraszybkie i wydajne pamięciowo dopasowanie krótkich sekwencji DNA do ludzkiego genomu. Biol genomowy. 10, R25 (2009).


    Terapia CRISPR w chemiowrażliwości

    Oporność wielolekowa jest spowodowana różnicową ekspresją genów w komórkach nowotworowych, powszechnie zwanych genami oporności wielolekowej (MDR). Oporność ta jest odpowiedzialna za nieudane chemioterapie i powodujące w krótkim czasie wysoką śmiertelność. Alternatywą dla przezwyciężenia tego wyzwania jest wyciszenie lub dezaktywacja tych genów MDR (20�). W ostatnich latach w tym celu zastosowano zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) w połączeniu z nukleazą powiązaną z CRISPR 9 (Cas9) ze względu na ich praktyczne zastosowanie, wszechstronność i skuteczność cięcia w prawie każdej sekwencji docelowej (20, 23). System CRISPR-Cas9 składa się z endonukleazy kierowanej przez RNA (kompleks Cas9/sgRNA), która składa się z pojedynczych fuzji kierowanego RNA (sgRNA) z Cas9. sgRNA składa się z CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującego crRNA (tracrRNA) (21, 22).

    W przypadku terapii przeciwnowotworowej, każdy cel terapeutyczny CRISPR jest wybierany według typu nowotworu. Na przykład oceniano CRISPR-Cas9 celujący w receptor CXC chemokin 4 (CXCR4) in vitro oraz in vivo badania nad rakiem wątroby, który znacząco zmniejszał jego ekspresję oraz hamował proliferację i migrację komórek, prowadząc do mniejszej inwazyjności, a także znacząco zwiększał chemiowrażliwość na cisplatynę (24). W innym badaniu system CRISPR-Cas9 został wykorzystany do dezaktywacji genu nuklearnego czynnika związanego z erytroidem 2 (NRF2) w komórkach raka płuc. Wykazał wzrost wrażliwości na środki chemioterapeutyczne, takie jak cisplatyna i karboplatyna (25).

    Podobnie oceniano, że CRISPR zwiększa chemiowrażliwość w raku piersi poprzez inaktywację lub regulację w dół genu MDR1 (znanego również jako ABCB1), który znacząco zwiększa cytotoksyczność doksorubicyny w komórkach raka piersi opornych na chemioterapię. Dane te sugerują, że mutacja genu MDR1 przez wewnątrzkomórkowe podanie kompleksu CRISPR-Cas9 przywracała podatność na lek i pozwalała uniknąć oporności wielolekowej w komórkach raka piersi (26).

    W raku jajnika chemiowrażliwość na CRISPR-Cas9 również wzrosła w wyniku inaktywacji genu MDR1, który koduje białko P-gp. Ten spadek ekspresji był związany z większą wrażliwością na doksorubicynę (27). Podobnie gen PARP-1 został stłumiony przez CRISPR-Cas9 w raku jajnika i spowodował większą wrażliwość na cisplatynę w komórkach nowotworowych (28). W kostniakomięsaku ekspresję P-gp można skutecznie zablokować przez CRISPR-Cas9, a hamowanie P-gp było związane z odwróceniem oporności na doksorubicynę w liniach komórkowych kostniakomięsaka MDR (KHOSR2 i U-2OSR2). Z tego powodu system CRISPR-Cas9 zwiększył długoterminową skuteczność chemioterapii przez przezwyciężenie MDR za pośrednictwem P-gp w warunkach klinicznych (29).

    Chociaż czasami wystarczy inaktywacja genu, aby odwrócić oporność na chemioterapię, typy guzów mogą mieć kilka genów docelowych, które mogą prowadzić do tego samego celu, jakim jest uczynienie go chemiowrażliwym. Na przykład, p53 ulegał nadekspresji, aby komórki były bardziej wrażliwe na chemioterapię doksorubicyną i uzyskano większy wpływ na chemosensytyzację opornych komórek kostniakomięsaka (30).

    W związku z powyższym zastosowanie narzędzia CRISPR-Cas9 w połączeniu z chemioterapią może zwiększyć skuteczność eliminacji różnych typów komórek nowotworowych. Jednak swoistość Cas9/sgRNA wymaga starannej oceny, ponieważ Cas9/sgRNA może mieć niepożądane cele poza celem i wycinać niezbędne geny dla pacjenta (20). Z tego powodu zastosowano system CRISPR-dCas9 ze względu na jego dezaktywowaną aktywność nikazy, która nie powoduje cięć w sekwencji genetycznej i nie dezaktywuje trwale genów, a tym samym zmniejsza efekty pozacelowe (31, 32).


    Aktywator genów dCas9-p300 CRISPR

    System aktywatora genu CRISPR dCas9-p300 opiera się na fuzji dCas9 z domeną rdzeniową katalitycznej acetylotransferazy histonowej (HAT) ludzkiego białka p300 związanego z E1A. To podejście zostało niezależnie zweryfikowane przez laboratorium Gersbach (Duke University) w celu aktywacji genów zarówno w proksymalnej, jak i dystalnej lokalizacji względem miejsca startu transkrypcji (TSS). Podejście acetylacji histonów dCas9-p300 reprezentuje odrębny mechanizm działania w stosunku do dCas9-VP64 lub innych podobnych motywów aktywacji genów. Chociaż domeny aktywacyjne, takie jak VP64, pomagają rekrutować kompleksy transkrypcyjne do regionu promotora, są one na łasce stanu epigenetycznego genu i zależne od dostępności dodatkowych białek transkrypcyjnych. Odwrotnie, białko acetylotransferazy histonowej p300 otwiera drogę transkrypcyjną, uwalniając DNA ze stanu heterochromatyny i umożliwiając ciągłą i silną ekspresję genów przez endogenną maszynerię komórkową.


    CRISPR Affinity Purification in situ Elementów Regulacyjnych: Oryginalna metoda CAPTURE

    Oryginalna metoda CAPTURE wymaga stworzenia stabilnej linii komórkowej, która współwyraża trzy składniki:

    1. dCas9 z dodanym miejscem akceptora biotyny
    2. BirA, ligaza biotynowa
    3. gRNA (s) ukierunkowany na pojedynczą lokalizację genomową będącą przedmiotem zainteresowania

    Gdy te trzy składniki ulegają koekspresji, gRNA kieruje dCas9 do interesujących loci, a dCas9 jest biotynylowane przez BirA. Stąd metoda CAPTURE jest podobna do innych metod 3C: sieciowanie wychwytuje interakcje z chromatyną, trawienie enzymem restrykcyjnym tnie DNA na mniejsze kawałki, a ligacja zbliżeniowa tworzy chimeryczne kręgi DNA, które są odległe liniowo, ale blisko siebie w przestrzeni. „Obraz” chromatyny jest następnie opracowywany poprzez wykrywanie tych chimerycznych fragmentów DNA za pomocą PCR lub sekwencjonowania nowej generacji.

    Rysunek 1: Przegląd kluczowych etapów metody CAPTURE. Po usieciowaniu kompleksów białkowych i DNA, DNA jest trawiony na mniejsze kawałki. Utworzone lepkie końce są następnie łączone ze sobą, aby utworzyć pętle DNA. Jest to klucz do łączenia fragmentów DNA, które są daleko od siebie pod względem par zasad, ale blisko siebie pod względem ich fizycznej lokalizacji. DNA jest następnie cięte na kawałki wystarczająco małe, aby można je było ściągnąć za pomocą streptawidyny IP. Biotynylowany dCas9 przechodzi przez wszystkie te etapy, dopóki jego połączenie z DNA nie zostanie przerwane podczas odwrócenia sieciowania (nie pokazano na schemacie). Wiązania krzyżowe są odwrócone, dzięki czemu fragmenty DNA mogą być wykryte przez PCR lub głębokie sekwencjonowanie.

    Wadą oryginalnej metody CAPTURE jest konieczność stworzenia nowej linii komórkowej dla każdego interesującego loci genomowego. Jest to kłopotliwe, a także utrudnia porównywanie wyników dla wielu celów, ponieważ różne linie komórkowe CAPTURE będą miały różne poziomy ekspresji dCas9 i gRNA. Dodatkowo sekwencjonowanie oparte na CAPTURE 3C wymaga dużej liczby komórek (

    5x10 7 ). Razem te dwa wymagania uniemożliwiają użycie CAPTURE z komórkami pierwotnymi lub rzadkimi populacjami komórek.


    Dyskusja

    Rak jest złożoną, niejednorodną i bardzo dynamiczną chorobą z wieloma ewoluującymi składnikami molekularnymi. Ze względu na niestabilność genomową komórek rakowych, każda pojedyncza komórka rakowa ma zestaw mutacji. Ta heterogeniczność guza powoduje kilka mechanizmów oporności w leczeniu raka, głównie mutację docelową (3, 4, 22). ATF oparte na CRISPR-dCas9 mogą być stosowane w terapii transkrypcyjnej w celu optymalizacji ekspresji genów i zaprojektowania bardziej kontrolowanego systemu, na przykład systemu indukowanego lekiem o zmienionym przeznaczeniu, poprawiającego siłę manipulacji genami, multipleksowania i ograniczania zasobów oraz schemat dawkowania i ekspresji genów (68). ). Do terapii przeciwnowotworowej opracowano ATF oparte na CRISPR-dCas9, aby aktywować geny supresorowe guza i wyciszać onkogeny oraz mechanizmy oporności guza w terapii celowanej (22). Niektóre potencjalne strategie interwencji CRISPR/Cas9 ukierunkowanych na geny komórkowe w raku proponują regulację w dół onkogenów (ErbB, src, abl, fps, tak, ras, raf, oraz moja c) oraz genów związanych z chemioopornością (MDR-1, MRP, GST-p, UGT1A1 i Cytokine P450) oraz genów supresorowych (pRb, p53, APC, SMAD4, PTEN, BRCA1/2 i ATM) (22, 69).

    Z tego powodu proponuje się zastosowanie ATF opartych na CRISPR-dCas9 do terapii przeciwnowotworowych w połączeniu z lekami o zmienionym przeznaczeniu, których mechanizm działania polega na regulacji ekspresji onkogenów i genów supresorowych nowotworów lub inaktywacji genów MDR. Może to umożliwić synergię lub komplementarność między technologią CRISPR a lekami o zmienionym przeznaczeniu w terapii przeciwnowotworowej, ponieważ obie strategie wyrażają lub tłumią pewne geny zaangażowane w raka, a ich połączone zastosowanie może generować efekt synergiczny, który wzmacnia terapię, gdy lek o zmienionym przeznaczeniu reguluje ekspresję tego samego gen, który będzie celem dla ATF opartych na CRISPR-dCas9.

    Na przykład w Tabeli 1 digitoksyna powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G2/M, ponieważ indukuje ekspresję p21, inhibitora kinaz zależnych od cyklin i hamuje ekspresję HIF-1 i HIF-2, które są czynnikami transkrypcyjnymi często wzrasta w guzach, które regulują niezbędne geny związane z niedotlenionymi środowiskami adaptacji guza (12, 19, 50, 51). Z tego powodu ATF oparte na CRISPR-dCas9 można łączyć z tymi zmienionymi lekami, aby w równym stopniu aktywować ekspresję p21 i generować efekt synergiczny lub tłumić ekspresję rodziny HIF i generować efekt uzupełniający, aby chemioterapia była bardziej skuteczna.

    Leczenie raka jest obsługiwane przez wiele narzędzi terapeutycznych. Można ich używać w zależności od typu pacjenta i jego diagnozy. W tym sensie leki o zmienionym przeznaczeniu w połączeniu z ATF opartymi na CRISPR-dCas9 mogą stanowić innowacyjną alternatywę, która obiecuje być w stanie skuteczniej pokryć niektóre typy nowotworów. Zmiana przeznaczenia leków i ATF oparte na CRISPR-dCas9 są stosowane w terapii przeciwnowotworowej i cieszą się coraz większą uwagą w badaniach biotechnologicznych ze względu na korzyści ekonomiczne, jakie stanowią dla przemysłu farmaceutycznego, a także korzyści molekularne, jakie przynoszą pacjentowi podczas lek na raka. Zastosowanie alternatywnych leków w leczeniu raka oznacza mniej skutków ubocznych dla pacjentów i szerszy zakres zastosowań jako korzyści molekularne. Niemniej jednak, geny MDR nadal wpływają na skuteczność ponownego użycia leków w przypadku raka (1, 19). Wyzwanie to można rozwiązać za pomocą technologii CRISPR-Cas9 lub ATF opartych na CRISPR-dCas9 w połączeniu ze zmianą przeznaczenia leków poprzez inaktywację genów MDR. Pomimo, że technologia CRISPR-Cas9 zapewnia skuteczną inaktywację dowolnego genu, rozszczepia ona jeden cel na raz i w sposób niespecyficzny, co ma inne wady (25, 27, 29). Z tego powodu ATF oparte na CRISPR-dCas9 są najlepszą opcją dla kombinacji terapii przeciwnowotworowej, ponieważ nie tylko mają większość celów terapeutycznych, ale także dwuniciowy DNA nie jest uszkodzony, a sekwencja DNA gospodarza nie jest zmieniona. ATFy oparte na CRISPR-dCas9 są nawet stosunkowo opłacalne w porównaniu do de novo budowa opartych na białkach domen wiążących DNA ZF i TALEs. Inną zaletą jest to, że ATF oparte na CRISPR-dCas9 są bardziej specyficzne w porównaniu z palcami TALE i ZINC i mogą mieć kilka celów genetycznych do jednoczesnej regulacji (36, 70). Jednak swoistość CRISPR-dCas9 może się zmniejszyć w zależności od złożoności DNA z powodu niedostępności celu terapeutycznego (43, 71).

    Jeśli chodzi o ograniczenia ATF oparte na CRISPR-dCas9, kompleks dCas9/sgRNA jest większy niż inne ATF, takie jak TALE lub Zinc Fingers, a dostarczanie komórek może być trudne (14, 22, 35, 37).

    Innymi ograniczeniami ATF opartych na CRISPR-dCas9 są efekty niezwiązane z celem ze względu na możliwość wiązania dCas9 z sekwencjami nukleotydowymi podobnymi do docelowej sekwencji PAM. Optymalizacja długości sgRNA pozwala jednak zredukować efekty poza celem bez poświęcania skuteczności w celu (43, 72). Pomimo powyższego, potrzeba więcej informacji, aby potwierdzić rzeczywisty negatywny wpływ efektów poza docelowymi generowanych przez dCas9, ponieważ wykonuje tylko częściowe i tymczasowe wiązanie z sekwencjami poza docelowymi bez ich uszkadzania (36, 70).

    Wreszcie, terapia przeciwnowotworowa z ponownym zastosowaniem leku w połączeniu z ATF opartymi na CRISPR-dCas9 nie została jeszcze przeprowadzona na podstawie eksperymentalnej, jednak ważne jest zbadanie w przyszłych badaniach możliwości połączenia tych metod w leczeniu raka ze względu na potencjalne korzyści dla zmniejszyć śmiertelność z powodu raka w oszczędny sposób i z bardziej efektywnymi wynikami.


    Strategie oparte na CRISPR do badania elementów regulatorowych i struktury chromatyny w kontroli genów ssaków

    Opracowanie wysokowydajnych metod umożliwiło identyfikację w całym genomie domniemanych elementów regulatorowych w wielu różnych komórkach ssaków z bezprecedensową rozdzielczością. Szeroko zakrojone badania genomiczne ujawniły ważną rolę elementów regulatorowych i ich zmienności genetycznej w powstawaniu choroby i ryzyku. W większości przypadków istnieją tylko korelacyjne dowody na role tych elementów i niekodujące zmiany w obrębie tych elementów w patogenezie. Wraz z pojawieniem się narzędzi do edycji genomu i epigenomu opartych na technologii CRISPR, możliwe jest obecnie testowanie funkcjonalnego znaczenia elementów regulatorowych i zmian w skali genomicznej. W tym miejscu dokonujemy przeglądu różnych strategii opartych na CRISPR, które zostały opracowane w celu funkcjonalnej walidacji potencjalnych elementów regulatorowych u ssaków, a także niekodujących wariantów genetycznych uznanych za związane z chorobami człowieka. Omawiamy również, w jaki sposób te narzędzia biologii syntetycznej pomogły wyjaśnić rolę trójwymiarowej architektury jądrowej i organizacji chromatyny wyższego rzędu w kształtowaniu funkcjonalnego genomu i kontrolowaniu ekspresji genów.


    Ci autorzy wnieśli równy wkład: Alicia E. Graham, Lucie Studena.

    Afiliacje

    Wydział Biologii i Inżynierii Biologicznej, California Institute of Technology, Pasadena, CA, 91125, USA

    Department of Bioengineering i Imperial College Center for Synthetic Biology, Imperial College London, Londyn, UK

    Alicia E. Graham, Lucie Studená i Rodrigo Ledesma-Amaro

    Możesz również wyszukać tego autora w PubMed Google Scholar

    Możesz również wyszukać tego autora w PubMed Google Scholar

    Możesz również wyszukać tego autora w PubMed Google Scholar

    Możesz również wyszukać tego autora w PubMed Google Scholar

    Składki

    R.L.-A. i NSM wymyślił papier. NSM napisał większość początkowego tekstu z pomocą L.S. i AEG którzy współtworzyli odpowiednio sekcje aplikacji i metod obliczeniowych. R.L.-A dostarczył wskazówek dotyczących pisania i kierowania przeglądem. Wszyscy autorzy poprawili i sfinalizowali artykuł.

    Autor do korespondencji


    Obejrzyj wideo: BIOINFORMATICS OF CRISPR CAS9. Designing guide RNAs gRNAs for Genome Editing (Sierpień 2022).